Methodenartikel

Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

DOI:

10.3791/64499

⸱

3 februari 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de verrijking van kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel door middel van een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) afgeleid van weefsel kunnen de functionele status van de broncellen en de kenmerken van de interstitiële ruimte van het weefsel weerspiegelen. De efficiënte verrijking van deze sEV's is een belangrijke voorwaarde voor de studie van hun biologische functie en een sleutel tot de ontwikkeling van klinische detectietechnieken en therapeutische dragertechnologie. Het is moeilijk om sEV's uit weefsel te isoleren omdat ze meestal zwaar verontreinigd zijn. Deze studie biedt een methode voor de snelle verrijking van hoogwaardige sEV's uit leverkankerweefsel. De methode omvat een proces in vier stappen: de incubatie van spijsverteringsenzymen (collagenase D en DNase Ι) met weefsel, filtratie door een 70 μm celzeef, differentiële ultracentrifugatie en filtratie door een membraanfilter van 0,22 μm. Door de optimalisatie van de differentiële ultracentrifugatiestap en de toevoeging van een filtratiestap is de zuiverheid van de sEV's die met deze methode worden verkregen hoger dan die van klassieke differentiële ultracentrifugatie. Het biedt een belangrijke methodologie en ondersteunende gegevens voor de studie van weefsel-afgeleide sEV's.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) hebben een diameter van ongeveer 30 nm tot 150 nm en worden uitgescheiden door verschillende cellen1. Ze kunnen communiceren met weefselcellen en de lokale of verre micro-omgeving reguleren door belangrijke biologische moleculen zoals lipiden, eiwitten, DNA en RNA naar verschillende organen, weefsels, cellen en intracellulaire delen te transporteren. Zo kunnen ze ook het gedrag van ontvangende cellen veranderen 2,3. De isolatie en zuivering van specifieke sEV's is een essentiële voorwaarde voor het bestuderen van hun biologische gedrag tijdens de ontwikkeling en het verloop van de ziekte. Differentiële ultracentrifugatie - beschouwd als de gouden standaard - wordt vaak gebruikt om sEV's te scheiden van de weefsels waarin ze zich normaal bevinden4. Weefselresten, celresten, grote blaasjes en apoptotische lichamen kunnen met deze techniek worden verwijderd, waardoor alleen de sEV's overblijven.

Van collagenase D en DNase I is aangetoond dat ze de moleculaire kenmerken van cellen of blaasjes niet beïnvloeden, waarbij de eigenschappen van beide enzymen bijdragen aan de afgifte van blaasjes in de extracellulaire matrix 5. Deze enzymen zijn gebruikt om sEV's te extraheren uit menselijk gemetastaseerd melanoomweefsel, darmkankerweefsel en darmslijmvliesweefsel 5,6,7. De concentratie en verteringstijd van collagenase D en DNase I in deze methoden verschillen echter, wat leidt tot inconsistente conclusies. Om de coprecipitatie van andere subtypen van sEV's te voorkomen, hebben onderzoekers grotere extracellulaire blaasjes (0,1 μm of 0,2 μm in diameter) verwijderd door filtratie en / of differentiële centrifugatie8. Afhankelijk van het bronweefsel kunnen verschillende methoden van isolatie en zuivering nodig zijn 9,10.

Het gebruik van de traditionele differentiële ultracentrifugatiemethode om sEV's uit leverweefsel te extraheren, resulteert in een laag witte stof op het oppervlak van het supernatant, zonder enige manier om de eigenschappen ervan te bepalen. In een eerdere studie11 bleek deze laag witte stof de zuiverheid van de sEV's te beïnvloeden. Hoewel het aantal deeltjes en de eiwitconcentratie van monsters die met de traditionele methode werden geïsoleerd hoger waren dan die van de huidige methode, was de variatiecoëfficiënt groot, mogelijk omdat veel verontreinigende stoffen kunnen leiden tot een slechte herhaalbaarheid van de resultaten. Dat wil zeggen, met behulp van detergent (d.w.z. het detecteren van de oplosbaarheid van deeltjes in 1% Triton X-100), vonden we dat de zuiverheid van sEV's verkregen door deze methode groter was. Daarom gebruiken we deze methode om sEV's afgeleid van colorectaal kankerweefsel te isoleren en te zuiveren voor proteomisch onderzoek.

Op dit moment is het onderzoek naar sEV's bij leverkanker voornamelijk gericht op serum, plasma en het supernatant van de celcultuur12,13,14. SEV's afgeleid van leverkankerweefsel kunnen echter nauwkeuriger de fysiologische pathologie en de omliggende micro-omgeving van leverkanker weerspiegelen en effectief de afbraak en vervuiling van andere EV's voorkomen15,16. Met het gebruik van differentiële ultracentrifugatie kan deze methode de opbrengst verrijken en hoogwaardige sEV's verkrijgen, wat een belangrijke basis vormt voor de verdere studie van leverkanker. Deze methode maakt het mogelijk om het leverkankerweefsel te scheiden door scherpe scheiding en te worden gedissocieerd door collagenase D en DNase I. Vervolgens worden het cellulaire puin, grote blaasjes en apoptotische lichamen verder verwijderd door filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Ten slotte worden de sEV's geïsoleerd en gezuiverd voor latere studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijk leverkankerweefsel werd verzameld van patiënten met de diagnose levermaligniteit in het First Affiliated Hospital van de Gannan Medical University. Alle patiënten ondertekenden een geïnformeerd toestemmingsformulier en de verzameling van menselijke weefselmonsters werd goedgekeurd door de ethische commissie van het First Affiliated Hospital van de Gannan Medical University. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.

1. Voorbereiding

  1. Plaats de transference decoloring shaker in de incubator en stel de temperatuur in op 37 °C. Zie figuur 1 voor alle andere benodigde apparatuur.
  2. Reinig het scalpel en de tang door ze in te spuiten met 75% alcohol.
  3. Bereid de spijsverteringsoplossing door 6 mg collagenase D (4 mg / ml) en 24 μl DNase Ι (80 U / ml) te meten en toe te voegen aan 1,5 ml RPMI-1640 basisch medium. Meng door zachte inversie totdat de additieven volledig zijn opgelost.
  4. Bevochtig vooraf 70 μm en 0,22 μm celzeven met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  5. Plaats een 100 mm steriele celkweekschaal op de ijskast om de leverweefsels na het ontdooien vast te houden.
  6. Spoel binnen 15 minuten na weefselisolatie van hepatocellulair carcinoom het bloed op het oppervlak van het weefselblok af met PBS, breng het weefsel over in een steriele bevroren buis en bewaar het bij −80 °C tot het experiment gedurende niet meer dan 2 weken.

2. Weefseldissociatie

  1. Haal het weefselmonster uit de vriezer van −80 °C en plaats ongeveer 400 mg van het weefsel - gesneden in fragmenten van 2 mm x 2 mm x 2 mm - in de celkweekschaal van 10 cm op de ijskast.
  2. Verplaats het weefsel in een 6-well plaat met 1,5 ml van de spijsverteringsoplossing; plaats vervolgens de plaat op de transference decoloring shaker (20 rpm/min) om gedurende 20 min bij 37 °C te incuberen voor volledige dissociatie van het leverkankerweefsel en afgifte van de sEV's.
  3. Verwijder de 6-puts plaat uit de incubator en plaats deze op de ijskast. Voeg 80 μL fosfataseremmer en 200 μL complete proteaseremmeroplossing toe om de spijsvertering te stoppen.
  4. Breng de spijsverteringsoplossing over in de 70 μm celzeef en filter deze langzaam om grote weefselresten te verwijderen. Verzamel het filtraat en plaats het in een centrifugebuis van 2 ml.

3. Differentiële ultracentrifugatie

OPMERKING: Voer alle centrifugeerstappen uit bij 4 °C.

  1. Centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten op 500 × g en vang het supernatant op in een nieuwe centrifugebuis van 2 ml. Het grootste deel van het kleine weefselafval kan dan worden verwijderd.
  2. Centrifugeer het supernatant gedurende 20 minuten bij 3.000 × g om celresten te verwijderen. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis totdat de punt van de pipet op het punt staat de witte substantie op het oppervlak te raken.
  3. Centrifugeer de resterende vloeistof bij 3.000 × g gedurende 3 minuten; Zuig vervolgens het supernatant op om het verzamelen van blaasjes te vergemakkelijken. Om de zuiverheid van de sEV's te garanderen, moet u ervoor zorgen dat de witte substantie niet wordt aangezogen.
  4. Centrifugeer het verzamelde supernatant gedurende 20 minuten op 12.000 × g en breng 900 μL van het supernatant over in een ultracentrifugebuis van 4,7 ml. Centrifugeer de resterende vloeistof gedurende 3 minuten bij 12.000 × g en verzamel en meng vervolgens beide supernatanten in dezelfde ultracentrifugebuis. Vul de tube volledig met PBS.
  5. Centrifugeer de supernatanten gedurende 60 minuten op 100.000 × g . Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet door de ultracentrifugebuis te vullen met PBS en opnieuw te centrifugeren bij 100.000 × g gedurende 60 minuten. Resuspensie van de pellet met 50 μL PBS.
  6. Zuig de sEV-suspensie op met een steriele spuit van 1 ml en filter deze door een membraanfilter van 0,22 μm. Verzamel het filtraat in een centrifugebuis van 600 μl en bewaar het bij −80 °C voor verdere analyse.

4. Evaluatie van de verrijkingskwaliteit

  1. Observeer de morfologie van de sEV's onder een transmissie-elektronenmicroscoop.
    1. Laat vervolgens 10 μL van het sEV-monster op een koperen net vallen, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en reinig het met steriel gedestilleerd water, met absorberend papier om overtollige vloeistof te verwijderen.
    2. Laat 10 μL 2% uranylacetaat op het koperen net vallen voor negatieve kleuring gedurende 1 minuut. Gebruik filtreerpapier om de vloeistof op het oppervlak van het koperen net te absorberen en droog het gedurende 2 minuten onder een gloeilamp.
    3. Observeer het kopergaas onder een transmissie-elektronenmicroscoop en beeld bij 80 kV.
  2. Gebruik een nanodeeltjesstroomcytometer om de grootteverdeling en zuiverheid van de sEV's te bepalen.
    1. Voordat de machine wordt gestart, bereidt u buizen voor met 200 μL kwaliteitscontrole, 200 μL silica-nanosferen, 2 x 200 μL ultrapuur water, 2 x 200 μL reinigingsoplossing en 200 μL PBS.
      OPMERKING: Alvorens de sEV-monsters te testen, moet de kwaliteitscontrole op het instrument worden uitgevoerd en moet de deeltjesgroottenorm worden getest (de grootteverdeling moet worden berekend met behulp van standaardcurven die worden gegenereerd met verschillende nanomicrosferen van verschillende diameters [68-155 nm] onder dezelfde detectieconditie). QC-kralen en silica-nanosferen werden 100x verdund met ultrapuur water in een totaal volume van 200 μL.
    2. Controleer het volume van de reinigingsoplossing (>10 ml) en noteer het verschil tussen de niveaus van de mantelvloeistof en de afvalvloeistof (20-30 cm).
    3. Schakel de hoofdvoeding van het instrument uit; Schakel na 20 S de computer in en wacht op de pieptonen die aangeven dat het instrument correct is aangesloten om de software uit te voeren.
    4. Klik op Opstarten om de camera, laser en luchtpomp in te schakelen.
    5. Klik op Sheath Flow-Start Up en plaats ultrapuur water op het laadplatform. Klik na 4 minuten (aftellen van het instrument) op Sample-Boosting | Monster-lossen.
    6. Plaats na 30 s de lege buis op het laadplatform en klik op Sample-Boosting | Monster-lossen. Plaats vervolgens de buis met het ultrazuivere water op het laadplatform en klik tegelijkertijd op Sample-Boosting | Schede Flow-Purge.
    7. Klik op Handmatige bediening en plaats de deeltjesconcentratiebuis op het laadplatform. Klik vervolgens gedurende 1 minuut op Sample-Boosting en selecteer tegelijkertijd 250 nm Std FL SiNPs kwaliteitscontrole in "SAMP. Inf."
    8. Klik op Sample-Sampling en schakel de detector in door op SPCM te klikken.
      OPMERKING: Op dit punt is de real-time signaalgolfvorm te zien.
    9. Klik op Auto Sampling en voer 1.0 in Sampling SET in om de druk op 1 KPa te zetten. Klik op de werkbalk en selecteer Groot signaal.
    10. Pas de horizontale positie van de laser aan en stel de laser in op 2 μm; klik vervolgens op L of R om ervoor te zorgen dat het signaal sterk en uniform is.
    11. Klik op Time to Record om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springen wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in een Naf-bestand en klik op Sample-Unload.
    12. Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform, klik op Sample-Boosting en klik na 1 minuut op Sample-Unload. Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.
    13. Plaats de standaardbuis van de deeltjesgrootte op het laadplatform en klik gedurende 1 minuut op Sample-Boosting .
    14. Selecteer 68-155 nm Std FL SiNPs kwaliteitscontrole in "SAMP. Inf" en klik op Sample-Sampling. Klik vervolgens op de werkbalk en selecteer Klein signaal.
    15. Klik op Time to Record om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springen wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in een Naf-bestand en klik op Sample-Unload.
    16. Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform, klik op Sample-Boosting en klik na 1 minuut op Sample-Unload . Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.
    17. Plaats de PBS-buis op het laadplatform; klik op Sample-Boosting gedurende 1 min.
    18. Selecteer 68-155 nm Std FL SiNPs kwaliteitscontrole in "SAMP. Inf" en klik op Sample-Sampling. Klik vervolgens op de werkbalk en selecteer Klein signaal.
    19. Klik op Time to Record om gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springen wanneer u klaar bent. Sla de gegevens op in een Naf-bestand en klik op Sample-Unload.
    20. Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform, klik na 1 minuut op Sample-Boosting en Sample-Unload. Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.
    21. Controleer de voorbeeldinformatie zoals eerder beschreven in de stappen 4.2.17-4.2.20; wijzig de PBS (stap 4.2.17) in het sEV-voorbeeld en analyseer de gegevens.
  3. Identificeer de sEV's verder door western blot.
    1. Bepaal de eiwitconcentraties van de sEV's en weefsels met behulp van de BCA-eiwitkwantificeringskit volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Bereken het laadvolume van sEV's (bijvoorbeeld voor 5 μg eiwit per put) op basis van deze kwantitatieve resultaten. Voeg laadbuffer toe in een verhouding van 1:4 en vortex het mengsel.
    3. Na denaturatie in een metaalbad van 100 °C (droge thermostaat) gedurende 10 minuten, scheidt u het eiwit op een 12% polyacrylamidegel bij 60 V gedurende 80 minuten.
    4. Breng de gel over op een 0,22 μm polyvinylideendifluoridemembraan bij 220 mA gedurende 2 uur met behulp van transferbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol).
    5. Blokkeer het membraan met 5% magere droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing Tween (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en incubeer met primair antilichaam (konijn monoklonaal anti-humaan CD9-antilichaam, konijn monoklonaal anti-humaan CD63-antilichaam, konijn monoklonaal anti-humaan TSG101-antilichaam, muis monoklonaal anti-humaan GM130-antilichaam) 's nachts bij 4 °C. Verdun de primaire antilichamen in 5% magere melk bij 1:1.000.
    6. Na drie wasbeurten met TBST, incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    7. Detecteer het HRP-gekoppelde antilichaam met behulp van ECL-blottingsubstraat en verzamel en analyseer vervolgens de afbeeldingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sEV's uit menselijke leverkankerweefsels hebben een cruciale rol gespeeld bij de diagnose, behandeling en prognose van patiënten met leverkanker. Deze methode maakte gebruik van gemeenschappelijke laboratoriuminstrumenten om sEV's afkomstig van leverkankerweefsels te isoleren en te zuiveren; dit kan methodologische ondersteuning bieden voor de studie van sEV's. Figuur 2 illustreert het algemene proces van het verrijken van sEV's uit leverkankerweefsels. sEV's in de intercellulaire ruimtes va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een herhaalbare methode voor het extraheren van sEV's uit leverkankerweefsel. Hoogwaardige sEV's worden verkregen door scherpe weefselisolatie, behandeling met spijsverteringsenzymen, differentiële ultracentrifugatie en 0,22 μm filtermembraanfiltratie en -zuivering. Voor downstream-analyse is het uiterst belangrijk om de hoge zuiverheid van de sEV's te waarborgen. Tijdens het proces van differentiële centrifugatie verschijnt een laag witte stoffen (onbekende samenstelling) op het oppervlak van het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken het First Affiliated Hospital van Gannan Medical University voor het ondersteunen van dit werk. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82260422).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm Membrane Filter UnitMillexSLGPR33RB
1 mL Sterile syringeHubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2% Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400-2
4.7 mL Centrifuge TubeBeckman Coulter361621
6-well Cell cuture plateLABSELECT11110
50 mL BeakerTianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales CompanyCF2100800
70 µm Cell strainerBiosharpBS-70-XBS
100 mm Cell culture dishCELL TERCS016-0128
600 µL Centrifuge tubeAxygenMCT060C
BCA protein quantification kitThermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman A95761
BioRad Mini trans-blotBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
CD63 AntibodyAbcamab134045
CD9 AntibodyAbcamab263019
Centrifuge 5430REppendorf5428HQ527333
Cleaning SolutionNanoFCMC1801
Collagenase DRoche11088866001
Copper netHenan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
Dry ThermostatHangzhou allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC Anti Human CD9 AntibodyElabscienceE-AB-F1086C
GlycineSolarbioG8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody ProteintechSA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody ProteintechSA00001-2
MethanolShanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometerNanoFCM INCFNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)Roche4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)ServicebioG4202
Polyvinylidene Difluoride MembraneSolarbioISEQ00010
QC BeadsNanoFCMQS2502
RPMI-1640 basic mediumBiological Industries C11875500BT
ScalpelGuangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
Silica NanospheresNanoFCMS16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8Kylin-BellE0018
Transmission Electron MicroscopeThermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
TSG101 AntibodyProteintech28283-1-AP
TweezerGuangzhou Lige Technology CompanyLG01-105-4X

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  2. Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
  3. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  4. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  5. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  6. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  7. Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).
  8. Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
  9. Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
  10. Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
  11. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  12. Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
  13. Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
  14. Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).
  15. Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
  16. Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vesikelverrijkingdifferenti le ultracentrifugatiemembraanfiltratieenzymatische digestieflowcytometrietransmissie elektronenmicroscopieeiwitmarkersWestern blot

Gerelateerde artikelen