Het huidige protocol maakt een efficiënte en stabiele afgifte van fluorescerende microsferen (MS) en quantum dots (QD) in het myocardium van levende vissen mogelijk die in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd (getraceerd).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Intramyocardiale injectie voor de studie van de cardiale lymfefunctie bij zebravissen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebravissen hebben bewezen een belangrijk model te zijn voor het bestuderen van cardiovasculaire vorming en functie tijdens de postembryonale ontwikkeling en regeneratie. Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van fluorescerende tracers in het myocardium van de zebravis om de opname van interstitiële vloeistof en puin in de lymfevaten van het hart te bestuderen. Om dit te doen, worden microsferen (200 nm diameter) en quantum dots (<10 nm diameter) in het myocardium van levende zebravissen ingebracht, die kunnen worden gevolgd met behulp van ex vivo confocale microscopie. Deze tracers worden vervolgens met tussenpozen gedurende enkele uren gevolgd om de klaring van het myocardium in de lymfevaten van het hart te volgen. Quantum dots worden via de lymfevaten van het hart getransporteerd, weg van het hart, terwijl grotere microsferen meer dan drie weken op de injectieplaats blijven. Deze methode van intramyocardiale injectie kan worden uitgebreid naar andere toepassingen, waaronder de injectie van ingekapselde MS of hydrogels om lokaal cellen, eiwitten of verbindingen van belang af te geven aan een gericht deel van het hart.
Inleiding
Het lymfestelsel is essentieel voor het behoud van de weefsel-vochtbalans, modulatie van de immuunrespons na letsel en absorptie van lipiden in de darm1. Accumulerend bewijs ondersteunt de brede rol van het lymfestelsel in verschillende ziekte- en ontwikkelingscontexten. Mechanistische studies worden echter belemmerd omdat lymfevaten moeilijk te visualiseren kunnen zijn en hun functionaliteit onzeker kan zijn. Vroege beeldvormingstechnieken vertrouwden op het natuurlijke vermogen van het lymfestelsel om geïnjecteerde tracers interstitieel te absorberen en deze vervolgens door het lymfevatennetwerk te transporte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Weill Cornell Medicine (protocol 2020-0027) en volgden de juiste richtlijnen. De volgende experimenten werden uitgevoerd met mannelijke en vrouwelijke AB wildtype zebravissen in de leeftijd van 14 tot 20 maanden na de bevruchting voor volwassenen en 35 dagen na de bevruchting voor jonge exemplaren.
1. Naaldtrekken en bereiding van reagens
- Trek een capillair van 1.2 mm OD (buitendiameter) standaard borosilicaatglas met behulp van een naaldtrekker (Figuur 1A,B....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Direct na de injectie moet een klein wit gebied van de myocardwand zichtbaar zijn (figuur 3F). Dit gebied zal een heldere fluorescerende labeling van de geïnjecteerde MS en QD vertonen (Figuur 4B,E). Bovendien kan er na de procedure zwakke en sporadische fluorescentiepuncta op het buitenoppervlak van het hart zijn van QD en MS in de pericardiale ruimte (Figuur 4B,E).......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel wordt een methode beschreven om exogeen materiaal in het myocardium van zebravissen te brengen. Deze techniek is ontwikkeld om QD en MS in het myocardium te introduceren om de lymfefunctie in homeostase en regeneratie te bestuderen 2,18. Een vergelijkbare benadering is ook gebruikt om QD in het myocardium van muizen te introduceren om de aanwezigheid en functie van lymfevaten na een hartinfarct te onderzoeken
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Adedeji Afolalu, Chaim Shapiro, Soji Hosten en Chelsea Quaies voor de verzorging van vissen (Weill Cornell Medicine), Caroline Pearson (Weill Cornell Medicine) voor het kritisch lezen van het manuscript. Jingli Cao (Weill Cornell Medicine) voor het gebruik van dissectiescoop en camera om de procedure vast te leggen, naast het kritisch lezen van het manuscript. Nathan Lawson (University of Massachusetts Medical School), Brant Weinstein (NICHD), Elke Ober (University of Kopenhagen) en Stephan Schulte-Merker (WWU Münster) voor transgene zebravislijnen. Daniel Castranova (NICHD) voor advies over QD en beeldvorming en Yu Xia (Wei....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Crystallization dish | VWR | 89000-288 | |
| Dissection Scope | Zeiss | 495010-0007-000 | |
| Fish facility water | N/A | N/A | RO water met toegevoegde zeezouten en natriumbicarbonaat tot een geleidbaarheid van 226uS en een pH van 7.35 |
| Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| Glass Capillaries | WPI | 1B120-3 | geen filament |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Iridectomy scissors | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Microinjector | Warner Instruments | 64-1735 | |
| Microloader femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Gated pedal input |
| Microspheres | Thermo Fisher Scientific | B200 | Blauw |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| Quantum dots (QD) | Thermo Fisher Scientific | Q21061MP | Qtracker705 vasculair label |
| Sponge | elke | elke | (1.5 × 5 × 3 cm) met groef (0.5 × 2.5 cm) |
| Syringe filter | Corning | 431220 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | concentratie: 4 mg/mL |
Referenties
- Munn, L. L., Padera, T. P. Imaging the lymphatic system. Microvascular Research. 0, 55(2014).
- Harrison, M. R., et al. Late developing cardiac lymphatic vasculature supports adult zebrafish heart function and regeneration. eLife. 8, 42762(2019).<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
