Intramyocardiale injectie voor de studie van de cardiale lymfefunctie bij zebravissen

Summary

Het huidige protocol maakt een efficiënte en stabiele afgifte van fluorescerende microsferen (MS) en quantum dots (QD) in het myocardium van levende vissen mogelijk die in de loop van de tijd kunnen worden gevolgd (getraceerd).

Abstract

Zebravissen hebben bewezen een belangrijk model te zijn voor het bestuderen van cardiovasculaire vorming en functie tijdens de postembryonale ontwikkeling en regeneratie. Het huidige protocol beschrijft een methode voor het injecteren van fluorescerende tracers in het myocardium van de zebravis om de opname van interstitiële vloeistof en puin in de lymfevaten van het hart te bestuderen. Om dit te doen, worden microsferen (200 nm diameter) en quantum dots (<10 nm diameter) in het myocardium van levende zebravissen ingebracht, die kunnen worden gevolgd met behulp van ex vivo confocale microscopie. Deze tracers worden vervolgens met tussenpozen gedurende enkele uren gevolgd om de klaring van het myocardium in de lymfevaten van het hart te volgen. Quantum dots worden via de lymfevaten van het hart getransporteerd, weg van het hart, terwijl grotere microsferen meer dan drie weken op de injectieplaats blijven. Deze methode van intramyocardiale injectie kan worden uitgebreid naar andere toepassingen, waaronder de injectie van ingekapselde MS of hydrogels om lokaal cellen, eiwitten of verbindingen van belang af te geven aan een gericht deel van het hart.

Introduction

Het lymfestelsel is essentieel voor het behoud van de weefsel-vochtbalans, modulatie van de immuunrespons na letsel en absorptie van lipiden in de darm¹. Accumulerend bewijs ondersteunt de brede rol van het lymfestelsel in verschillende ziekte- en ontwikkelingscontexten. Mechanistische studies worden echter belemmerd omdat lymfevaten moeilijk te visualiseren kunnen zijn en hun functionaliteit onzeker kan zijn. Vroege beeldvormingstechnieken vertrouwden op het natuurlijke vermogen van het lymfestelsel om geïnjecteerde tracers interstitieel te absorberen en deze vervolgens door het lymfevatennetwerk te transporteren, waardoor detectie en visualisatie mogelijk waren¹. Deze methode kan niet alleen worden gebruikt om de lymfevaten te visualiseren, maar het kan ook worden gebruikt om hun vermogen om vloeistof en macromoleculen uit het weefsel op te nemen te kwantificeren.

Het enorme lymfenetwerk omvat ook het cardiale lymfestelsel, waarvan is aangetoond dat het een integrale rol speelt bij de regeneratie van zebravissen ^2,3,4. Het begrijpen van de verschillen en overeenkomsten in lymfefunctie tussen verschillende soorten is cruciaal om deze kennis klinisch te benutten. Daarom is het nodig om de technologieën te verkennen die de lymfefunctie in verschillende modelorganismen kunnen meten en visualiseren ^5,6. Lymfevaten zijn stompe bloedvaten die vloeistof in één richting transporteren, weg van het weefsel⁷. Intramyocardiale injectie van fluorescerende kleurstoffen is vereist om lymfedrainage uit hartweefsel te observeren. Intramyocardiale injecties zijn ook klinisch en in preklinische zoogdiermodellen gebruikt om stam- en voorlopercellen of exogene verbindingen zoals hydrogel te transplanteren om te testen op verbetering van de hartfunctie na een hartinfarct ^8,9,10. Intramyocardiale injectie van zebravissen is niet in detail beschreven, wat het gebruik van dergelijke experimentele benaderingen voor het hart van de zebravis heeft beperkt.

Injecties in de pericardiale ruimte van de zebravis en de systemische bloedstroom in het lumen van het hart zijn eerder in detail beschreven^11,12, en succesvolle intramyocardiale injectie van fluorescerende tracers bij volwassen zebravissen is gemeld². Dit artikel geeft een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van intramyocardiale injecties bij volwassen zebravissen. Verschillende transgene zebravislijnen kunnen lymfevaten identificeren; Er is echter behoefte aan het onderzoeken van benaderingen om lymfedrainage te begrijpen of om lymfevaten te visualiseren in afwezigheid van transgene markers. Fluorescerende tracers, microsferen (MS) en quantum dots (QD) worden hier gebruikt om de injectieplaats en de vloeistofstroom naar de cardiale lymfevaten te visualiseren. QD zijn fluorescerende nanokristallen met een diameter van <10 nm waarvan de optische eigenschappen kunnen worden afgestemd en aangepast om vele biomedische toepassingen te dienen^13,14. QD worden gemakkelijk opgenomen door lymfevaten, maar niet door het bloedvaatstelsel wanneer ze interstitieel worden geïnjecteerd ^15,16. MS zijn fluorescerend gecoate polystyreen korrels van ongeveer 200 nm met een diameter^{van 15}. Als zodanig zijn MS aanzienlijk groter dan QD en significant persistenter wanneer ze in het myocardium worden geïnjecteerd, waardoor een consistente identificatie van de injectieplaats mogelijk is. Deze methode is nuttig om de lymfefunctie tijdens hartregeneratie te bestuderen, maar kan worden aangepast om verschillende aspecten van de hartbiologie te bestuderen met behulp van de stabiele, gelokaliseerde introductie van gecoate kralen, hydrogels of celpreparaten.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Weill Cornell Medicine (protocol 2020-0027) en volgden de juiste richtlijnen. De volgende experimenten werden uitgevoerd met mannelijke en vrouwelijke AB wildtype zebravissen in de leeftijd van 14 tot 20 maanden na de bevruchting voor volwassenen en 35 dagen na de bevruchting voor jonge exemplaren.

1. Naaldtrekken en bereiding van reagens

1. Trek een capillair van 1.2 mm OD (buitendiameter) standaard borosilicaatglas met behulp van een naaldtrekker (Figuur 1A,B) (zie Materiaaltabel) in twee naalden met optimale instellingen. Verwarm in dit geval 525; trek 65; snelheid 60; tijd 250.
2. Vortex commercieel verkregen voorraad colloïdale oplossingen van MS (1% vaste stoffen in water) en QD (2 μM, zie materiaaltabel).
   OPMERKING: De MS-colloïdale oplossing is wit van kleur en gemakkelijk te zien wanneer deze wordt geïnjecteerd.
3. Filtreer 500 μl colloïdale oplossing van MS-voorraad door een spuitfilter van 0,45 μm (zie materiaaltabel) om verstopping van de naald tot een minimum te beperken.
4. Om de werkende colloïdale oplossing van alleen MS te bereiden, verdunt u 100 μL van de gefilterde MS colloïdale oplossing met 100 μL 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing).
5. Om de werkende colloïdale oplossing van MS en QD te bereiden, mengt u 100 μl van de gefilterde MS-colloïdale oplossing met 100 μl van de QD-colloïdale oplossing.
   OPMERKING: Afhankelijk van het experiment kunnen MS en QD afzonderlijk worden gemengd of geïnjecteerd.
6. Bereid de benodigde reagentia en apparatuur voor en rangschik ze: stereoscoop, natte spons, micromanipulator, injector, pipet van 20 μl, tricaïneoplossing, rechte iridectomieschaar, tang, getrokken naalden, femtotips van de microloader, vuilwatertanks en netten zoals weergegeven in figuur 1D (zie materiaaltabel).
7. Zet de injectorluchttoevoer aan en stel de gated injectiepuls in in plaats van de getimede injectiepuls.
   OPMERKING: Zie voor de instrumentale details de materiaaltabel. Bij sommige instrumenten moet het injectiepedaal in de gated input-poort aan de achterkant van het instrument worden gestoken.

2. Voorbereiding van het injectiestation en voorbereiding van zebravissen

1. Zet de ontleedmicroscoop aan en pas de scherpstelling aan.
2. Vul met de pipetpunten van de microloader de controlevloeistof (bijv. 0,05% fenolrood in 1x PBS).
3. Steek de naald in de naaldhouder van de microinjector.
4. Knip onder de ontleedmicroscoop de getrokken naald met een tang op 1 mm van de punt af.
   OPMERKING: Het zo smal mogelijk afknippen van de naald is optimaal voor het doorboren van het myocardium. Als de naald echter te smal is, kan deze buigen wanneer u probeert het hartweefsel binnen te dringen.
5. Stel de juiste injectiedruk in op ongeveer 0.50 kPa/7.3 psi en de balansdruk op ongeveer 0 psi, zodat er geen vloeistof in de naald wordt teruggetrokken (Figuur 1C).
6. Zodra de gewenste druk is bereikt, test u de injectieopstelling en registreert u de tijd die nodig is om een bolus oplossing te injecteren in minerale olie met een diameter van minder dan 1 mm (<0,5 μl).
   OPMERKING: Idealiter moet de injectie de vloeistof afgeven met ongeveer 50 nL/s om een bolusdiameter van ongeveer 0,8 mm in 5 s te verkrijgen. Afhankelijk van de puntdiameter van de naald kunnen aanpassingen in tijd en druk worden gemaakt om 0,25-0,3 μL in een enkele vis te injecteren via een injectie van 5 s. Een hogere injectiedruk, in tegenstelling tot een langere injectietijd, is wenselijk om ervoor te zorgen dat de hoge interstitiële weefseldruk tijdens de injectie kan worden overwonnen.
7. Vul de naald met het geselecteerde volume (bijv. 10-15 μL, figuur 1B) injectieoplossing en herhaal stap 2.5-2.6.
   OPMERKING: Bij gated injecties kan men injecteren zolang het voetpedaal wordt ingedrukt, waardoor de positie van de punt kan worden aangepast totdat de juiste intraweefselinjectieplaats is gevonden.
8. Steek de naald met injectieoplossing in de naaldhouder van de microinjector.

3. Injectie

1. Bereid een gegroefde spons voor door in het midden een visachtige omtrek te snijden.
2. Bereid de werkconcentratie van tricaïne voor door 4,2 ml stockoplossing (4 mg/ml) te verdunnen tot 100 ml water uit de visfaciliteit (zie materiaaltabel) in een kristalliserende schaal.
3. Verdoof de zebravis in een tricaine-oplossing totdat de beweging van de kieuwen is verminderd en hij is gestopt met zwemmen.
   OPMERKING: Knijp in de staart om het verlies van respons bij verdoofde zebravissen te bevestigen.
4. Plaats de zebravis met de buikzijde naar de objectieflens in de bevochtigde gegroefde spons onder de snijmicroscoop (Figuur 2A en Figuur 3A).
5. Gebruik een iridectomieschaar om een kleine dwarse snede te maken ter hoogte van de borstvinnen en open de borstholte (aanvullende video 1).
6. Trek met een tang voorzichtig het hartzakje weg om de top van het hart bloot te leggen (Figuur 3B).
7. Met de geladen naaldhouder in de hand richt u de naald naar de top van het ventrikel in een scherpe hoek van <30° ten opzichte van de lichaamsas.
8. Steek een naald van 0,1-0,2 mm in het hart zonder te diep in het ventrikel door te dringen (Figuur 2B en Figuur 3B).
   OPMERKING: Als het uiteinde van de naald zich vult met bloed, trek de naald dan iets terug om te voorkomen dat de MS en QD in het ventriculaire lumen worden geïnjecteerd.
9. Terwijl de naald in de top van het hart is ingebracht, tilt u het ventrikel iets op van het lichaam door de hoek tussen de naald en de lichaamsas te verkleinen terwijl u de naaldpunt naar de basis van het hart beweegt (Figuur 2C en Figuur 3C).
   OPMERKING: De naald kan vaag zichtbaar zijn door de myocardwand.
10. Duw de naald verder naar de kop zodat de naaldpunt naar het myocardoppervlak beweegt.
11. Injecteer door het pedaal van het micro-injectieapparaat ~1-5 s ingedrukt te houden of totdat er een witte vlek zichtbaar is in het hartweefsel (Figuur 2C en Figuur 3C,D).
12. Als de borstholte zich tijdens het injecteren begint te vullen met injectievloeistof, geeft dit aan dat de naaldpunt volledig in het myocardium is doorgedrongen (Figuur 2D). Trek de naald langzaam terug totdat een opeenhoping van microbolletjes zichtbaar is in het weefsel.
13. Verplaats de naaldpunt als de vloeistof in het ventriculaire lumen wordt geïnjecteerd en met de daaropvolgende hartslag wordt gewist (Figuur 2E). Til in een dergelijke situatie de punt van de naald op en duw de naald in de richting van het hoofd totdat de injectiedruk resulteert in een witte vlek in het weefsel.
14. Als er geen witte vloeistof of vlek zichtbaar is, is de injectienaald verstopt. Trek in zo'n situatie de naald volledig terug. Om het experiment voort te zetten, breekt u de punt van de naald lichtjes of vervangt u de naald. Controleer in beide gevallen de injectiestroom voordat u het myocardium opnieuw injecteert.
15. Trek na een succesvolle injectie de naald voorzichtig terug uit het myocardium (Figuur 3F) en breng de zebravis onmiddellijk over in een opvangtank met water uit de visfaciliteit.
16. Houd de vis in de gaten totdat hij volledig hersteld is van de tricaine.
17. Breng de teruggevonden vissen over in een aquarium van 2,8 l en plaats deze in de visfaciliteit, tot het gewenste tijdstip voor hartextractie.

4. Hartextractie en beeldvorming

1. Bereid de werkconcentratie van tricaïne voor door 4,2 ml stockoplossing (4 mg/ml) te verdunnen tot 100 ml water uit de visfaciliteit in een kristalliserende schaal.
2. Verdoof de zebravis terminaal in een tricaine-oplossing totdat de beweging van de kieuwen is gestopt en deze niet meer reageert.
3. Breng de zebravis over op een bevochtigde, gegroefde spons onder de ontleedmicroscoop die met de ventrale kant naar de objectieflens is gericht.
4. Open de buikwand van de borstkas met een iridectomieschaar ter hoogte van de borstvinnen.
5. Open de pericardiale zak en zoek het uitstroomspoor van het hart. Gebruik een tang om de aorta vóór de bulbeuze arteriosus (BA) vast te pakken en trek ze voorzichtig omhoog met de basis van het ventrikel.
6. Met de voorste pool van het hart omhoog, snijdt u de ventrale aorta/sinus venosus door om het hart vrij te maken en plaatst u deze in een petrischaal van 35 mm met PBS.
7. Verwijder met een tang eventuele bloedstolsels en fixeer het hart gedurende 15 minuten in 4% PFA (wt/vol).
8. Stel de harten in beeld met een microscoop die in staat is om de gebruikte fluorescerende golflengten te verkrijgen.
   OPMERKING: In de voorbeelddatum werd een confocale microscoop met 405, 488, 567 en 647 laserlijnen gebruikt.
9. Gebruik ImageJ/Fiji-software (zie Materiaaltabel) voor beeldanalyse.
   OPMERKING: De berekening van QD- of MS-verrijking werd uitgevoerd met behulp van de hoge of lage drempel en creëerde selectiefuncties met het lymfevatenkanaal om eerst gebieden van lymfevaten en gebieden zonder vatsignaal te selecteren. Vervolgens werd de functie Meten gebruikt om de pixelintensiteit van het QD- of MS-kanaal te meten, waaruit een verhouding van de twee selecties werd berekend.

Results

Direct na de injectie moet een klein wit gebied van de myocardwand zichtbaar zijn (figuur 3F). Dit gebied zal een heldere fluorescerende labeling van de geïnjecteerde MS en QD vertonen (Figuur 4B,E). Bovendien kan er na de procedure zwakke en sporadische fluorescentiepuncta op het buitenoppervlak van het hart zijn van QD en MS in de pericardiale ruimte (Figuur 4B,E)...

Discussion

In dit artikel wordt een methode beschreven om exogeen materiaal in het myocardium van zebravissen te brengen. Deze techniek is ontwikkeld om QD en MS in het myocardium te introduceren om de lymfefunctie in homeostase en regeneratie te bestuderen ^2,18. Een vergelijkbare benadering is ook gebruikt om QD in het myocardium van muizen te introduceren om de aanwezigheid en functie van lymfevaten na een hartinfarct te onderzoeken

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water met toegevoegde zeezouten en natriumbicarbonaat tot een geleidbaarheid van 226uS en een pH van 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	geen filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blauw
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vasculair label
Sponge	elke	elke	(1.5 × 5 × 3 cm) met groef (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentratie: 4 mg/mL