Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Samenvatting

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Samenvatting

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) vertegenwoordigen de grootste superfamilie van receptoren en zijn het doelwit van tal van menselijke geneesmiddelen. High-throughput screening (HTS) van willekeurige kleine molecuulbibliotheken tegen GPCR's wordt door de farmaceutische industrie gebruikt voor het ontdekken van doelwitspecifieke geneesmiddelen. In deze studie werd een HTS gebruikt om nieuwe liganden met kleine moleculen van ongewervelde neuropeptide GPCRRs te identificeren als sondes voor fysiologische studies van vectoren van dodelijke menselijke en veterinaire pathogenen.

De ongewervelde-specifieke kininereceptor werd gekozen als doelwit omdat het veel belangrijke fysiologische processen bij ongewervelde dieren reguleert, waaronder diurese, voeding en spijsvertering. Bovendien is de farmacologie van veel ongewervelde GPCR's slecht of helemaal niet gekarakteriseerd; daarom voegt de differentiële farmacologie van deze groepen receptoren met betrekking tot de gerelateerde GPCR's in andere metazoën, met name mensen, kennis toe aan de structuur-activiteitsrelaties van GPCR's als een superfamilie. Een HTS-test werd ontwikkeld voor cellen in 384-well-platen voor de ontdekking van liganden van de kininereceptor van de runderkoortsteek, of zuidelijke runderteek, Rhipicephalus microplus. De tekenkininereceptor kwam stabiel tot expressie in CHO-K1-cellen.

De kininereceptor, wanneer geactiveerd door endogene kinine-neuropeptiden of andere agonisten met kleine moleculen, veroorzaakt Ca²⁺ afgifte uit calciumvoorraden in het cytoplasma. Deze calciumfluorescentietest in combinatie met een "dual-addition" -benadering kan functionele agonist en antagonist "hit" -moleculen in dezelfde testplaat detecteren. Elke test werd uitgevoerd met behulp van medicijnplaten met een array van 320 willekeurige kleine moleculen. Een betrouwbare Z'-factor van 0,7 werd verkregen en drie agonisten en twee antagonist-hitmoleculen werden geïdentificeerd wanneer de HTS zich op een eindconcentratie van 2 μM bevond. De hier gerapporteerde calciumfluorescentietest kan worden aangepast om andere GPCR's te screenen die de Ca²⁺ signaleringscascade activeren.

Inleiding

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's), die aanwezig zijn van gist tot mens, vertegenwoordigen de grootste superfamilie van receptoren in veel organismen¹. Ze spelen een cruciale rol bij het reguleren van bijna alle biologische processen bij dieren. Er zijn 50-200 GPCR's in het genoom van geleedpotigen, wat betekent dat ze de grootste membraanreceptor superfamilie² vertegenwoordigen. Ze worden ingedeeld in zes hoofdklassen, A-F, op basis van hun volgordeovereenkomst en functies³. GPCR's transduceren verschillende extracellulaire signalen, zoals die van hormonen, neuropeptiden, biogene amines, glut....

Protocol

1. Cel onderhoud

OPMERKING: Een CHO-K1 cellijn die stabiel de kininereceptor van R. microplus tot expressie brengt, genaamd BMLK₃, werd ontwikkeld door Holmes et ^al.16. De details van de ontwikkeling van de cellijn worden elders gepresenteerd¹⁴. Alle volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een klasse II bioveiligheidskast.

1. Kweek de recombinante cellijn in selectieve media (F-12K medium met 10% foetaal runderserum [FBS] en 800 μg/ml G418-sulfaat) om de expressie van de doelreceptor te garanderen. Bewaar de cellen die de ....

Resultaten

Een interne medicijnplaat (SAC2-34-6170) bestaande uit 320 willekeurige kleine moleculen werd gebruikt om deze HTS-test als voorbeeld te demonstreren. De HTS had een uitstekende testkwaliteit met een Z'-factor van 0,7 (tabel 1). Deze Z'-factor weerspiegelt de testkwaliteit onafhankelijk van de geteste verbindingen³⁴. Een Z′-factor van 0,5 of hoger duidt op een goed dynamisch bereik van het testsignaal tussen de RFRA's van de positieve controles en de negatiev.......

Discussie

Het doel van HTS is om hitmoleculen te identificeren door enorme aantallen kleine moleculen te screenen. Daarom vertegenwoordigen de resultaten van dit voorbeeld slechts een klein deel van een conventioneel HTS-experiment. Bovendien moeten de geïdentificeerde hitmoleculen worden gevalideerd in downstream-assays, zoals een dosisafhankelijke test op dezelfde recombinante cellijn en op een CHO-K1-cellijn die alleen de lege vector draagt, die tegelijkertijd kan worden uitgevoerd om kleine moleculen te redden. Cytotoxiciteits.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% trypsin-EDTA	Gibco Invitrogen	15050-065	met fenol rood
0.4% trypan blauw	MilliporeSigma	T8154	vloeibaar, sterieel
1.5 mL microcentrifuge buisjes	Thermo Fisher	AM12400	RNase-vrije Microfuge buisjes
5 mL serologische pipet	Corning	29443-045	Corning Costar Stripette individueel verpakt
10 mL serologische pipet	Corning	29443-047	Corning Costar Stripette individueel verpakt
15 mL conische buisjes	Falcon	352196	sterieel
20 µL filter tips	USA Scientifc Inc.	P1121	sterieel, barrière
25 mL serologische pipet	Corning	29443-049	Corning Costar Stripette individueel verpakt
50 mL conische buisjes	Corning	430828	gegradueerd, sterieel
150 mL auto-vriendelijk reservoir	Integra Bioscience	6317	sterieel, individueel verpakt voor celzaaien op dag 1
150 mL auto-vriendelijk reservoir	Integra Bioscience	6318	sterieel, gestapeld, voor ladingskleurstof op dag 2
384/ 12.5 µL laagretentie tips	Integra Bioscience	6405	lang, sterieel filter
384/ 12.5 µL tips	Integra Bioscience	6404	lang, sterieel filter
384-well plate	Greiner	781091	CELLSTAR, helder polystyreen, µClear, Black/Flat
Aluminium plate verzegelingen	Axygen Scientific	PCR-AS-200	polyester-gebaseerd
Aluminiumfolie omwikkeling	Walmart
Biosafty cabinet II	NuAire	NU-540-300
Celteller	Nexcelom	AutoT4
celtelling dia's	Nexcelom	SD-100	20 µL kamer
CO2 bevochtigde incubator	Thermo Fisher	Forma Series II
Bureaulamp	SunvaleeyTEK	RS1000B
Dimethyl sulfoxide	MilliporeSigma	276855	watervrij, >99.9%
Drug plate	Corning	3680
Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing	Corning	21-031-CV	DPBS, 1x zonder calcium en magnesium
Ethanol	Koptec	2000
F-12K Nutrient Mixture	Corning	45000-354	(Kaighn's Mod.) met L-glutamine
Foetaal bovien serum	Equitech-Bio	SFBU30
Fluorescent calcium assay kit	ENZO Lifescience	ENZ-51017	10x96 testen
G418 sulfaat	Gibco Invitrogen	10131-027	Geneticin selectief antibioticum 50 mg/mL
Hank's buffer	MilliporeSigma	55037C	HBSS gemodificeerd, met calcium, met magnesium, zonder fenol rood
HEPES buffer	Gibco Invitrogen	15630-080	1 Molair
HTS data opslag platform	CDD vault		https://www.collaborativedrug.com/
Vloeistofafhandelingssysteem	Integra Bioscience	Viaflo	384/12.5 µL
Plate centrifuge	Thermo Fisher	Sorvall ST8
Plate reader	BMG technology	Clariostar
Poly-D-lysine	MilliporeSigma	P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide	Genscript	custom order	QFSPWGamide
T-75 fles	Falcon	353136