Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64505

⸱

2 december 2022

 ,  , 
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

In dit artikel

Samenvatting

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Samenvatting

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) vertegenwoordigen de grootste superfamilie van receptoren en zijn het doelwit van tal van menselijke geneesmiddelen. High-throughput screening (HTS) van willekeurige kleine molecuulbibliotheken tegen GPCR's wordt door de farmaceutische industrie gebruikt voor het ontdekken van doelwitspecifieke geneesmiddelen. In deze studie werd een HTS gebruikt om nieuwe liganden met kleine moleculen van ongewervelde neuropeptide GPCRRs te identificeren als sondes voor fysiologische studies van vectoren van dodelijke menselijke en veterinaire pathogenen.

De ongewervelde-specifieke kininereceptor werd gekozen als doelwit omdat het veel belangrijke fysiologische processen bij ongewervelde dieren reguleert, waaronder diurese, voeding en spijsvertering. Bovendien is de farmacologie van veel ongewervelde GPCR's slecht of helemaal niet gekarakteriseerd; daarom voegt de differentiële farmacologie van deze groepen receptoren met betrekking tot de gerelateerde GPCR's in andere metazoën, met name mensen, kennis toe aan de structuur-activiteitsrelaties van GPCR's als een superfamilie. Een HTS-test werd ontwikkeld voor cellen in 384-well-platen voor de ontdekking van liganden van de kininereceptor van de runderkoortsteek, of zuidelijke runderteek, Rhipicephalus microplus. De tekenkininereceptor kwam stabiel tot expressie in CHO-K1-cellen.

De kininereceptor, wanneer geactiveerd door endogene kinine-neuropeptiden of andere agonisten met kleine moleculen, veroorzaakt Ca2+ afgifte uit calciumvoorraden in het cytoplasma. Deze calciumfluorescentietest in combinatie met een "dual-addition" -benadering kan functionele agonist en antagonist "hit" -moleculen in dezelfde testplaat detecteren. Elke test werd uitgevoerd met behulp van medicijnplaten met een array van 320 willekeurige kleine moleculen. Een betrouwbare Z'-factor van 0,7 werd verkregen en drie agonisten en twee antagonist-hitmoleculen werden geïdentificeerd wanneer de HTS zich op een eindconcentratie van 2 μM bevond. De hier gerapporteerde calciumfluorescentietest kan worden aangepast om andere GPCR's te screenen die de Ca2+ signaleringscascade activeren.

Inleiding

G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's), die aanwezig zijn van gist tot mens, vertegenwoordigen de grootste superfamilie van receptoren in veel organismen1. Ze spelen een cruciale rol bij het reguleren van bijna alle biologische processen bij dieren. Er zijn 50-200 GPCR's in het genoom van geleedpotigen, wat betekent dat ze de grootste membraanreceptor superfamilie2 vertegenwoordigen. Ze worden ingedeeld in zes hoofdklassen, A-F, op basis van hun volgordeovereenkomst en functies3. GPCR's transduceren verschillende extracellulaire signalen, zoals die van hormonen, neuropeptiden, biogene amines, glutamaat, proton, lipoglycoproteïnen en fotonen4. GPCR's koppelen aan heterotrimeer G-eiwitten (Gα, Gβ en Gγ) om stroomafwaartse signalen te verzenden. GPCR's gekoppeld aan Gαs- of Gαi/o-eiwitten verhogen of verlagen respectievelijk de intracellulaire 3', 5'-cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) niveaus door adenylylcyclase te activeren of te remmen. GPCR's gekoppeld aan Gαq/11 induceren calciumafgifte uit de endoplasmatische reticulumcalciumvoorraden door de fosfolipase C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfaat (IP3) route te activeren. GPCR's gekoppeld aan Gα12/13 activeren RhoGTPase nucleotide-uitwisselingsfactoren 5,6. GPCR's zijn het doelwit van meer dan 50% van de menselijke geneesmiddelen en een acaricide, amitraz4. Omdat GPCR's zulke uiteenlopende signalen transduceren, zijn ze veelbelovende doelen voor het ontwikkelen van nieuwe pesticiden die ongewervelde fysiologische functies verstoren.

Het doel van HTS is om hitmoleculen te identificeren die receptorfuncties kunnen moduleren. HTS omvat assay-ontwikkeling, miniaturisatie en automatisering7. Geleedpotige neuropeptide GPCRRs zijn betrokken bij de meeste fysiologische functies, zoals ontwikkeling, rui en ecdysis, uitscheiding, energiemobilisatie en reproductie4. De meeste neuropeptide GPCRRs van geleedpotigen en metazoën signaleren via de calciumsignaleringscascade 2,6,8,9,10, zoals in de myoinhibitory peptide en SIFamide receptoren van de zwartpootteek Ixodes scapularis; hun liganden zijn antagonistisch in hindgutmotiliteitstests, waarbij SIF contractie uitlokt en MIP hetremt 11,12. Een NPY-achtige receptor van de gelekoortsmug, Aedes aegypti, reguleert de vrouwelijke gastheer op zoek naar13. In vergelijking met andere alternatieve calciummobilisatietests zoals de aequorinecalciumbioluminescentietest14, is de calciumfluorescentietest gemakkelijk uit te voeren, vereist geen transfectie van andere recombinante calciumdetectie-eiwitten en is het kosteneffectief. De calciumfluorescentietest produceert een langdurig signaal in vergelijking met het snelle kinetische signaal dat wordt verkregen in de aequorinecalciumbioluminescentietest14,15.

In het voorbeeld hier werd de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, recombinant tot expressie gebracht in de CHO-K1-cellijn en gebruikt voor de calciumfluorescentietest. Er is slechts één kininereceptorgen gevonden in R. microplus; de receptor signaleert via een Gq-eiwitafhankelijke signaalroute en activeert de efflux van Ca2+ uit calciumvoorraden naar de intracellulaire ruimte16. Dit proces kan worden gedetecteerd en gekwantificeerd door een fluorofoor, die een fluorescentiesignaal opwekt bij het binden van calciumionen (figuur 1).

De kininereceptor is een ongewervelde GPCR, die behoort tot de klasse A Rhodopsine-achtige receptoren. Kinine is een oud signaal neuropeptide dat aanwezig is in Mollusca, Crustacea, Insecta en Acari 4,17,18. Coleopteranen (kevers) missen het kininesignaleringssysteem; in de mug Aedes aegypti is er slechts één kininereceptor die drie aedeskinines bindt, terwijl Drosophila melanogaster één kininereceptor heeft met drosokinine als een uniek ligand 19,20,21. Er zijn geen homologe kininen of kininereceptoren in gewervelde dieren. Hoewel de exacte functie van kinine onbekend is bij teken, vertonen de kininereceptor RNAi-gedempte vrouwtjes van R. microplus een significant verminderde reproductieve fitheid22. Kininen zijn pleotrope peptiden in insecten. Bij Drosophila melanogaster zijn ze betrokken bij zowel het centrale als het perifere zenuwstelsel23, pre-ecdysis24, voeding25, metabolisme26 en slaapactiviteitspatronen26,27, evenals larvale voortbeweging28. Kinins reguleren hindgut contractie, diurese en voeding in de mug A. aegypti 29,30,31. De kininepeptiden hebben een geconserveerd C-terminal pentapeptide Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, wat de minimaal vereiste sequentie is voor biologische activiteit32. De geleedpotige specificiteit, de kleine omvang van het endogene ligand, waardoor ze vatbaar zijn voor interferentie met kleine moleculen, en de pleiotrope functies bij insecten maken de kininereceptor een veelbelovend doelwit voor ongediertebestrijding4.

De "dual-addition" assay (Figuur 2) maakt de identificatie van agonisten of antagonisten in dezelfde HTS assay15 mogelijk. Het is aangepast van een "dual-addition" assay die vaak wordt gebruikt in de farmaceutische industrie voor het ontdekken van geneesmiddelen33. Kortom, de eerste toevoeging van geneesmiddelen aan de celplaat maakt de identificatie van potentiële agonisten in de chemische bibliotheek mogelijk wanneer een hoger fluorescentiesignaal wordt gedetecteerd in vergelijking met de toepassing van de oplosmiddelcontrole. Na 5 minuten incubatie met deze kleine moleculen wordt een bekende agonist (kininepeptide) op alle putten aangebracht. Die putten die willekeurig een antagonist van de medicijnplaat ontvingen, vertonen een lager fluorescentiesignaal bij agonisttoevoeging in vergelijking met de controleputten die het oplosmiddel in de eerste toevoeging ontvingen. Deze test maakt het vervolgens mogelijk om potentiële agonisten en antagonisten met dezelfde cellen te identificeren. In een standaard HTS-project zouden deze hitmoleculen verder worden gevalideerd door middel van dosis-responstests en door aanvullende biologische activiteitstests, die hier niet worden getoond.

figure-introduction-1
Figuur 1: Illustratie van het calciumfluorescentietestmechanisme. Het Gq-eiwit activeert de intracellulaire calciumsignaleringsroute. De kininereceptor (G-eiwit-gekoppelde receptor) werd recombinant tot expressie gebracht in CHO-K1-cellen. Wanneer de agonistligand zich aan de receptor bindt, activeert het Gq-eiwit geassocieerd met de kininereceptor PLC, dat de omzetting van een PIP 2-molecuul in IP3 en DAG katalyseert. IP3 bindt vervolgens aan de IP3R op het oppervlak van het endoplasmatisch reticulum, wat leidt tot de afgifte van Ca2+ in het cytoplasma, waar Ca2+ ionen binden aan de fluoroforen en een fluorescentiesignaal opwekken. Het fluorescentiesignaal kan worden verkregen door excitatie bij 490 nm en gedetecteerd bij 514 nm. Afkortingen: GPCR = G eiwit-gekoppelde receptor; PLC = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat; IP3 = inositol trisfosfaat; DAG = diacylglycerol; IP3R = IP3 receptor. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-introduction-2
Figuur 2: De workflow voor de high-throughput screening van kleine moleculen op een G-eiwit gekoppelde receptor tot expressie gebracht in CHO-K1 cellen. (A) Recombinante CHO-K1 cellen die stabiel de kininereceptor tot expressie brengen, werden toegevoegd aan de 384-well plaat (10.000 cellen / put) met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem (25 μL / put) en geïncubeerd in een bevochtigde CO2-incubator gedurende 12-16 uur. (B ) De testbuffer met de fluorescerende kleurstof (25 μL/put) werd met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem aan de celplaat toegevoegd. De plaat werd gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C gedurende 30 minuten en bij RT gedurende nog eens 30 minuten in evenwicht gebracht. (C) Het achtergrondfluorescentiesignaal van de cellen in elke put werd gemeten met een platenlezer. (D) Geneesmiddeloplossingen van een 384-well bibliotheekplaat en blanco oplosmiddel (allemaal bij 0,5 μL / put) werden toegevoegd aan de cellulaire testplaat met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem. (E) Cellulaire calciumfluorescentieresponsen werden gemeten met de platenlezer onmiddellijk na de toevoeging van de geneesmiddeloplossingen; verbinding(en) die hoger dan gemiddelde fluorescentiesignalen uitlokken, werden uitgezocht als agonistische hit(s). Antagonist-hits die de GPCR blokkeren (pictogram hieronder) werden onthuld na de toevoeging van de peptide-agonist tijdens stap G. (F) In dezelfde testplaat werd na 5 minuten incubatie van de cellen met screeningverbindingen een endogene agonist peptide Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) van de tekenkininereceptor aan elke put toegevoegd (1 μM). (G) Cellulaire fluorescentiereacties na de toevoeging van het agonistpeptide werden onmiddellijk door de plaatlezer gemeten. Verbinding(en) die het fluorescentiesignaal remmen werden geselecteerd als antagonist hit(s). Afkortingen: GPCR = G eiwit-gekoppelde receptor; RT = kamertemperatuur; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cel onderhoud

OPMERKING: Een CHO-K1 cellijn die stabiel de kininereceptor van R. microplus tot expressie brengt, genaamd BMLK3, werd ontwikkeld door Holmes et al.16. De details van de ontwikkeling van de cellijn worden elders gepresenteerd14. Alle volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een klasse II bioveiligheidskast.

  1. Kweek de recombinante cellijn in selectieve media (F-12K medium met 10% foetaal runderserum [FBS] en 800 μg/ml G418-sulfaat) om de expressie van de doelreceptor te garanderen. Bewaar de cellen die de receptor stabiel tot expressie brengen in 1 ml vriesmedium (90% FBS en 10% dimethylsulfoxide [DMSO]) in een cryoviaal van 2 ml in een vriezer van −80 °C.
    OPMERKING: Voor langdurige opslag van de bevroren cellen, bewaar ze in vloeibare stikstof.
  2. Prewarm alle media voor celkweek. Breng in een bioveiligheidskast 13 ml voorgewarmd selectief medium (F-12K-medium met 10% FBS en 800 μg / ml G418-sulfaat) over in een T-75-kolf en bewaar het in de bioveiligheidskast. Ontdooi één injectieflacon met de bevroren BMLK3-cellen (~ 1,5 × 106 cellen) in een waterbad van 37 °C gedurende 2-3 minuten. Breng de ontdooide cellen over in de T-75 kolf. Bewaar de cellen in een bevochtigde incubator op 37 °C en 5% CO2 , tenzij anders aangegeven.
  3. Wanneer de cellen 90% confluency (1-2 dagen) bereiken, warmen alle media voor tot 37 °C, behalve dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), die op kamertemperatuur wordt gehouden. Verwijder in een bioveiligheidskast het gebruikte medium uit de T-75-kolf, was de cellen gedurende 5 s met 10 ml DPBS door de kolf voorzichtig te draaien en verwijder vervolgens de DPBS met een serologische pipet.
    OPMERKING: Een afbeelding van CHO-K1-cellen met 90% confluentie wordt getoond in Lu et al.14.
  4. Maak de cellen los van de T-75 kolf door 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe te voegen en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C in de incubator. Voeg vervolgens 8 ml selectief medium toe en meng goed door 2x-3x voorzichtig te pipetteren en los te laten met dezelfde serologische pipet.
  5. Breng 2 ml van de celsuspensie (~ 1 × 106 cellen) over van stap 1.4 naar een nieuwe T-75 kolf met 10 ml warm selectief medium. Laat de cellen 1-2 dagen in de incubator groeien totdat ze 90% samenvloeiing bereiken.
  6. Gebruik de cellen voor de test na de volgende stappen of herhaal stap 1.4-1.5 een of twee keer voordat u de cellen in de test gebruikt.
    OPMERKING: Niet meer dan drie tot vier passages, omdat het testsignaal met bepaalde cellijnen zwakker kan worden met verdere passages.

2. Calciumfluorescentietest

  1. Bedek de celplaat.
    1. Gebruik een vloeistofbehandelingssysteem dat in een bioveiligheidskast is geplaatst voor alle pipetteerstappen in de 384-putplaten. Maak aangepaste programma's voor pipetteren in de 384-well platen31 (aanvullende tabel S1). Bestrijk de steriele 384-well platen van tevoren. Laad in een bioveiligheidskast 10 μL/putje van een waterige oplossing van Poly-D-lysine (PDL) bij 0,05 mg/ml in elke plaat en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Leeg het bord door het bord snel om te keren en voorzichtig op steriele keukenpapier te deppen. Spoel vervolgens elke put af met 10 μL water, leeg de plaat en laat de plaat een nacht drogen in de bioveiligheidskast zonder het deksel. Sluit het bord met het deksel en bewaar het bij 4 °C in de koelkast.
      OPMERKING: De gecoate platen kunnen maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
  2. Dag 1
    1. Verwijder de medicijnplaat (100 μM in 90% DPBS + 10% DMSO, de uiteindelijke concentratie in de put voor HTS is 2 μM) bewaard in de -20 °C vriezer en plaats deze op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Lay-out van de medicijnplaat: Elke 384-well plaat (24 kolommen x 16 rijen) bevat 320 putten met verschillende bibliotheekverbindingen en 64 putten met blanco oplosmiddel (DPBS met 10% DMSO), die zijn gerangschikt in vier kolommen, met twee kolommen aan de rand van elke kant. Zie Aanvullende tabel S2 voor de plaatindeling.
    2. Wanneer cellen ~70% -90% samenvloeiing in de T-75 kolf bereiken, maak de cellen los van de T-75 kolf zoals hieronder beschreven. Verwarm alle media voor op 37 °C behalve de DPBS (kamertemperatuur).
      1. Verwijder het gebruikte medium, was de cellen met 10 ml DPBS en verwijder vervolgens de DPBS. Maak de cellen los van de T-75 kolf met behulp van 2 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 3-5 minuten bij 37 °C in de incubator, voeg 8 ml selectief medium toe en breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml om gedurende 3 minuten bij 1.000 × g te centrifugeren.
      2. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in 10 ml F-12K-medium met 1% FBS en 400 μg / ml G418-sulfaat. Bewaar de suspensie in de bioveiligheidskast terwijl u het aantal cellen bepaalt.
    3. Bepaal de celdichtheid van de suspensie voor verdere verdunning: Meng 20 μL celsuspensie in 20 μL van 0,4% trypan blue en laad vervolgens 20 μL van het mengsel in een celtelkamer die door een celteller moet worden afgelezen voor celdichtheid.
    4. Verdun de celsuspensie in hetzelfde medium (F-12K medium met 1% FBS en 400 μg/ml G418-sulfaat) tot een eindvolume van ten minste 15 ml bij een dichtheid van 4 × 105 cellen/ml.
    5. Zaai de cellen in de PDL-gecoate 384-well plaat. Breng 15 ml van de bovenstaande celsuspensie (4 × 105 cellen / ml) over in een autovriendelijk reagensreservoir van 150 ml. Doseer 25 μL van de celsuspensie (~ 10.000 cellen / put) in elke put van de 384 putten van de plaat met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem in twee stappen. Laad 384/12,5 μL lage retentiepunten op de vloeistofbehandelingskop, zuig 12,5 μL uit het reservoir (snelheid 5,2 μL/s) en doseer in elke put (snelheid: 3,1 μL/s).
    6. Herhaal het pipetteren zoals in de vorige stap 2.2.5 om 25 μL per putje te bereiken. Incubeer vervolgens de plaat een nacht (14-16 uur) bij 37 °C en 5% CO2 in de bevochtigde incubator.
      OPMERKING: Aangezien het maximale pipetteervolume 12,5 μL is voor deze specifieke kop, wordt pipetteren voor 25 μL in twee stappen uitgevoerd.
  3. Dag 2
    1. Controleer de volgende ochtend de afgedekte celplaat onder een microscoop; zo niet confluent, wacht dan tot de cellen 90% confluency bereiken.
    2. Bereid een stamoplossing van fluorescerende kleurstof: Resuspenduleer gelyofiliseerde fluorescerende kleurstof in 100 μL DMSO en vermijd direct licht op de stamoplossing. Wikkel de tube in met aluminiumfolie om fotobleaching te voorkomen.
      OPMERKING: De bouillon kan worden gealiquoteerd in aliquots van 15 μL voor elke plaattest om herhaald bevriezen en ontdooien te voorkomen; de aliquots kunnen maximaal 1 maand bij −80 °C worden bewaard.
    3. Bereid in de bioveiligheidskast met de lichten uit de laadkleurstof (1x) in een conische buis van 15 ml omwikkeld met aluminiumfolie, waarbij 15 μL van de fluorescerende kleurstofvoorraadoplossing (uit stap 2.3.2) en de rest van de voorbewarmde kitcomponenten (37 °C) worden gecombineerd: 13,5 ml 1x HHBS (Hank's buffer met 20 mM HEPES) en 1,5 ml reagens B (kleurstofeffluxremmer).
      OPMERKING: Het kamerlampje brandt tijdens deze stap.
    4. Sluit de buis en meng goed door de buis voorzichtig meerdere (meestal 3-5x) keren om te keren.
      OPMERKING: Bewaren op kamertemperatuur en gebruik het ladingskleurstofmengsel binnen 30 minuten.
    5. Wanneer de cellen 90% confluency bereiken, verwijdert u het gebruikte medium van de 384-well assayplaat door de plaat snel om te keren en voorzichtig steriele papieren handdoeken te deppen; herhaal deze beweging 2x-3x om alle vloeistof van de plaat te verwijderen. Gooi de natte handdoeken weg.
    6. Schakel de meeste directe kunstmatige lichten in de kamer uit (laat een zachte, gedimde bureaulamp branden of iets dergelijks om zichtbare werkomstandigheden mogelijk te maken) en in de bioveiligheidskast voor alle stappen tot het einde van de test (ongeveer gedurende 1,5 uur).
    7. Plaats 15 ml van de ladingskleurstof (1x) uit stap 2.3.3 in een autovriendelijk reservoir van 150 ml.
      1. Breng 25 μL van de ladingskleurstof (1x) van het reservoir in elke put met behulp van een vloeistofbehandelingssysteem met 384/12,5 μL tips met lage retentie door 12,5 μL in elke put van de plaat te doseren (aspiratie- en doseersnelheid: 3,8 μL /s).
    8. Herhaal de pipetteerstap zoals in 2.3.7.1 om een eindvolume van 25 μL in elk putje van de plaat te bereiken. Dek de plaat af en wikkel deze in met aluminiumfolie om hem te beschermen tegen omgevingslicht.
    9. Incubeer de afgedekte celplaat bij 37 °C in de CO 2-bevochtigde incubator gedurende 30 minuten, verwijder deze uit de incubator en breng deze bij kamertemperatuur in evenwicht in de platenlezer of op de bank, houd de plaat bedekt en omwikkeld met folie gedurende nog eens 30 minuten. De cellen zijn dan klaar voor high-throughput screening (HTS).
    10. Chemische bereiding: Draai de medicijnplaat vanaf stap 2.2.1 bij 1.200 × g in een plaatcentrifuge gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
      1. Bereid een 10x agonist peptide oplossing van Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) (10 μM) door 100 nmol gelyofiliseerd peptide te resuspenderen in 10 ml 1x HHBS met 0,1% DMSO, en breng de oplossing over in een autovriendelijk reservoir van 150 ml.
    11. Meet het achtergrondsignaal: Kies voor de gehele HTS-test in de plaatlezer onder Protocollen de fluorescentiemodus van het eindpunt.
      OPMERKING: Het fluorescerende signaal wordt afgelezen vanaf de onderkant van de plaat bij excitatie/emissiegolflengten van 495 nm/525 nm.
      1. Plaats de celplaat in de plaatlezer. Selecteer in het instrumentenpaneel versterking aanpassen, selecteer een willekeurig putje op de plaat, wijs het toe als 5% -10% van de maximaal meetbare fluorescentiewaarde en selecteer de hoogte aanpassen (aflezen).
      2. Klik op meting starten om de hele plaat af te lezen voor het achtergrondfluorescentiesignaal in relatieve fluorescentie-eenheden (RFU).
    12. "Dual-addition" test
      1. Gebruik het vloeistofbehandelingssysteem met 384/12,5 μL-tips om de geneesmiddeloplossing in elk putje van de medicijnplaat te mengen, pipetteer 3x op en neer 10 μL van de geneesmiddeloplossing (in DPBS met 10% DMSO) (pipetteersnelheid: 5,2 μL / s) en "aspirateer" 1,5 μL uit elke put van de medicijnplaat (aspiratiesnelheid: 1,0 μL / s).
      2. "Dispense" 0,5 μL van de verbindingen in de celtestplaat (pipetteersnelheid: 1 μL/s) om een uiteindelijke concentratie van 2 μM te bereiken in 0,2% DMSO.
      3. Plaats de testplaat onmiddellijk in de plaatlezer na het toevoegen van de screeningsverbindingen. Lees dezelfde plaat in zowel de voorwaartse als de omgekeerde leesrichting. Om deze uitlezingen te verkrijgen, definieert u een programma om te lezen van "goed 1-384" en onmiddellijk van "384-1".
        OPMERKING: De uitlezing in beide richtingen duurt in totaal 2 minuten. Dit uitleesontwerp is bedoeld om te compenseren voor de afname van de signaalsterkte die optreedt tijdens het lezen van de plaat in elke richting. Zie stap 3.1 voor de uitleesanalyses.
      4. Gooi de resterende 1 μL geneesmiddeloplossing in de uiteinden door de uiteinden onder te dompelen in een afvalreservoir van 150 ml met ~ 50 ml DPBS (afgiftesnelheid: 1,0 μL / s).
      5. Incubeer de zeefverbindingen met de cellen gedurende in totaal 5 minuten (inclusief de 2 minuten plaataflezing) bij kamertemperatuur in de bioveiligheidskast met de lichten uit. Voeg 3 μL van het agonistpeptide, Rhimi-K-1 (QFSPWGamide), uit het reservoir (aspiratiesnelheid: 3,1 μL/s) toe aan de testplaat met behulp van het vloeistofbehandelingssysteem (doseersnelheid: 3,1 μL/s) met 384/12,5 μL tips.
      6. Plaats de plaat onmiddellijk na de toevoeging van het agonistpeptide in de plaatlezer. Lees de plaat zowel in de voorwaartse als in de omgekeerde richting met hetzelfde programma als in stap 2.3.12.3

3. Data-analyse

  1. Met behulp van de analysesoftware die is gekoppeld aan de plaatlezer die op een computer is geïnstalleerd, berekent u de cellulaire fluorescentieresponsen (in RFU) voor beide metingen na de eerste samengestelde toevoeging (Eerst lezen; RFUgeleden [Aanvullende tabel S2]) en na de stappen voor agonisttoevoeging (Tweede lezing = RFU-mier [Aanvullende tabel S2]). Elke aflezing wordt verkregen door het gemiddelde te nemen van de twee waarden die zijn verkregen (niet weergegeven) door de voor- en achteruitplaatmetingen van respectievelijk stap 2.3.12.3 en stap 2.3.12.6.
    OPMERKING: RFUgeleden verwijzen RFU-mieren naar respectievelijk de relatieve fluorescentie-eenheden van de potentiële agonistslagen (lees in stap 2.3.12.3) en de potentiële antagonistslagen (lees in stap 2.3.12.6).
  2. Exporteer alle drie de gegevenssets, RFUbg, RFUago en RFUant, vanuit de analysesoftware naar drie afzonderlijke spreadsheets. Elke spreadsheet heeft slechts twee kolommen: putpositie en onbewerkte RFU (bestanden die hier niet worden weergegeven).
    OPMERKING: RFUbg verwijst naar de RFU van de achtergrond die wordt gelezen in stap 2.3.11.2.
  3. Maak de gegevens uit de drie spreadsheets op en organiseer de bovenstaande gegevens in één csv-bestand (zie het voorbeeld in Aanvullende tabel S2). Trek het gelezen achtergrondsignaal af van respectievelijk de RFUago- en RFU-mier (G- en H-kolommen in aanvullende tabel S2).
  4. Importeer het csv-bestand in een commercieel beschikbaar "online HTS-gegevensplatform" (zie de tabel met materialen) voor downstream-gegevensanalyse (tabel 1) en opslag.
  5. Bereken handmatig de Z'-factor voor de kwaliteitscontrole van elke plaattest met behulp van vergelijking (1):
    vergelijking (1):
    figure-protocol-1(1)
    OPMERKING: μc- en μc+ vertegenwoordigen de gemiddelde RFU's van metingen van dezelfde putten, die dienen als negatieve controles in de eerste toevoeging na toevoeging van het oplosmiddel (blanco oplosmiddel, n = 64; getallen in blauw in aanvullende tabel S2) en dienen als positieve controles na toevoeging van de agonist (blanco oplosmiddel + agonist, n = 64; getallen in magenta); respectievelijk. Bovendien vertegenwoordigen σc- en σc+ hun overeenkomstige standaarddeviaties (SSD's).
  6. Selecteer handmatig de hitmoleculen uit de heatmaps op het "online HTS-dataplatform" en bereken de genormaliseerde procentactivering (NPA) en remmende activiteit (Io) voor de agonisthits en antagonisthits met behulp van vergelijking (2) en vergelijking (3):
    figure-protocol-2(2)
    figure-protocol-3(3)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een interne medicijnplaat (SAC2-34-6170) bestaande uit 320 willekeurige kleine moleculen werd gebruikt om deze HTS-test als voorbeeld te demonstreren. De HTS had een uitstekende testkwaliteit met een Z'-factor van 0,7 (tabel 1). Deze Z'-factor weerspiegelt de testkwaliteit onafhankelijk van de geteste verbindingen34. Een Z′-factor van 0,5 of hoger duidt op een goed dynamisch bereik van het testsignaal tussen de RFRA's van de positieve controles en de negatiev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van HTS is om hitmoleculen te identificeren door enorme aantallen kleine moleculen te screenen. Daarom vertegenwoordigen de resultaten van dit voorbeeld slechts een klein deel van een conventioneel HTS-experiment. Bovendien moeten de geïdentificeerde hitmoleculen worden gevalideerd in downstream-assays, zoals een dosisafhankelijke test op dezelfde recombinante cellijn en op een CHO-K1-cellijn die alleen de lege vector draagt, die tegelijkertijd kan worden uitgevoerd om kleine moleculen te redden. Cytotoxiciteits...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (Award nummer 2022-67015-36336, PVP [Project Director]) en van concurrerende fondsen van het Texas A &M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) aan P.V.P. De A.W.E.S.O.M.E. faculteitsgroep van het College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, wordt erkend voor hulp bij het bewerken van het manuscript. Aanvullende tabel S2 bevat gegevens van een interne, willekeurige bibliotheek met kleine moleculen, verkregen uit het laboratorium van Dr. James Sacchettini aan de Texas A &M University en Texas A &M AgriLife Research.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsin-EDTAGibco Invitrogen15050-065met fenol rood
0.4% trypan blauwMilliporeSigmaT8154vloeibaar, sterieel
1.5 mL microcentrifuge buisjesThermo FisherAM12400RNase-vrije Microfuge buisjes
5 mL serologische pipetCorning29443-045Corning Costar Stripette individueel verpakt 
10 mL serologische pipetCorning29443-047Corning Costar Stripette individueel verpakt 
15 mL conische buisjesFalcon352196sterieel
20 µL filter tipsUSA Scientifc Inc.P1121sterieel, barrière
25 mL serologische pipetCorning29443-049Corning Costar Stripette individueel verpakt 
50 mL conische buisjesCorning430828gegradueerd, sterieel
150 mL auto-vriendelijk reservoirIntegra Bioscience6317sterieel, individueel verpakt voor celzaaien op dag 1
150 mL auto-vriendelijk reservoirIntegra Bioscience6318sterieel, gestapeld, voor ladingskleurstof op dag 2
384/ 12.5 µL laagretentie tipsIntegra Bioscience6405lang, sterieel filter
384/ 12.5 µL tipsIntegra Bioscience6404lang, sterieel filter
384-well plateGreiner781091CELLSTAR, helder polystyreen, µClear, Black/Flat
Aluminium plate verzegelingenAxygen ScientificPCR-AS-200polyester-gebaseerd
Aluminiumfolie omwikkelingWalmart
Biosafty cabinet IINuAireNU-540-300
CeltellerNexcelomAutoT4
celtelling dia'sNexcelomSD-10020 µL kamer
CO2 bevochtigde incubatorThermo FisherForma Series II
BureaulampSunvaleeyTEKRS1000B
Dimethyl sulfoxideMilliporeSigma276855watervrij, >99.9%
Drug plateCorning3680
Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossingCorning21-031-CVDPBS, 1x zonder calcium en magnesium
EthanolKoptec2000
F-12K Nutrient Mixture Corning45000-354(Kaighn's Mod.) met L-glutamine
Foetaal bovien serumEquitech-BioSFBU30
Fluorescent calcium assay kitENZO LifescienceENZ-5101710x96 testen
G418 sulfaatGibco Invitrogen10131-027Geneticin selectief antibioticum 50 mg/mL
Hank's bufferMilliporeSigma55037CHBSS gemodificeerd, met calcium, met magnesium, zonder fenol rood
HEPES bufferGibco Invitrogen15630-0801 Molair
HTS data opslag platformCDD vault https://www.collaborativedrug.com/
VloeistofafhandelingssysteemIntegra BioscienceViaflo384/12.5 µL
Plate centrifugeThermo FisherSorvall ST8
Plate readerBMG technologyClariostar
Poly-D-lysineMilliporeSigmaP6407
Rhimi-K-1 agonist peptideGenscriptcustom orderQFSPWGamide
T-75 flesFalcon353136

Referenties

  1. Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
  2. Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993(2021).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
  4. Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
  5. Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
  6. Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260(2021).
  7. Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).
  8. Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
  9. Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167(2012).
  10. Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151(2012).
  11. Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
  12. Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
  13. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486(2013).
  14. Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732(2011).
  15. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008(2019).
  16. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
  17. Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
  18. Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).
  19. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800(2015).
  20. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
  21. Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
  22. Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
  23. Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940(2021).
  24. Kim, Y. -J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
  25. Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
  26. Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409(2019).
  27. Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607(2019).
  28. Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
  29. Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
  30. Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
  31. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
  32. Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
  33. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
  34. Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  35. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  36. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  37. Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037(2022).
  38. Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Dubbele additie assaykleine molecuulligandenkininereceptoragonist antagonistdetectie384 wellplaatintracellulaire calciumsignaleringplaatlezer
Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.