Het huidige werk beschrijft een nieuw experimenteel protocol dat een 3D-geprinte houder gebruikt om live cell imaging met hoge resolutie van enucleated globes mogelijk te maken. Via dit protocol kan de cellulaire calciumsignaleringsactiviteit in gewond hoornvliesepitheel van ex vivo globes in realtime worden waargenomen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-cell beeldvorming van intacte Ex Vivo Globes met behulp van een nieuwe 3D-geprinte houder
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cornea-epitheliale wondgenezing is een migratieproces dat wordt geïnitieerd door de activering van purinerge receptoren die tot expressie komen op epitheelcellen. Deze activering resulteert in calciummobilisatiegebeurtenissen die zich van cel naar cel voortplanten, die essentieel zijn voor het initiëren van cellulaire beweeglijkheid in het wondbed, waardoor efficiënte wondgenezing wordt bevorderd. Het Trinkaus-Randall-lab heeft een methodologie ontwikkeld voor het in beeld brengen van de genezingsrespons van de hoornvlieswond in ex vivo muizenbollen in realtime. Deze aanpak omvat het enucleren van een intacte wereldbol van een muis die volgens vastgestelde protocollen is geëuthanaseerd en onmiddellijk de wereld incuberen met een calciumindicatorkleurstof. Een counterstain die andere kenmerken van de cel kleurt, kan in dit stadium worden toegepast om te helpen bij beeldvorming en cellulaire oriëntatiepunten te tonen. Het protocol werkte goed met verschillende levende celkleurstoffen die worden gebruikt voor counterstaining, waaronder SiR-actine om actine te kleuren en dieprode plasmamembraanvlek om het celmembraan te kleuren. Om de reactie op een wond te onderzoeken, wordt het hoornvliesepitheel verwond met behulp van een naald van 25 G en worden de bollen in een 3D-geprinte houder geplaatst. De afmetingen van de 3D-geprinte houder zijn gekalibreerd om immobilisatie van de wereldbol gedurende de duur van het experiment te garanderen en kunnen worden aangepast aan ogen van verschillende groottes. Live cell imaging van de wondrespons wordt continu uitgevoerd op verschillende diepten in het weefsel in de loop van de tijd met behulp van confocale microscopie. Dit protocol stelt ons in staat om beelden van hoge resolutie, publicatiekwaliteit te genereren met behulp van een 20x luchtdoel op een confocale microscoop. Voor dit protocol kunnen ook andere doelstellingen worden gebruikt. Het vertegenwoordigt een aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van live cell imaging in ex vivo muizenbollen en maakt de identificatie van zenuwen en epitheel mogelijk.
Inleiding
Hoornvlies
Het hoornvlies is een heldere, avasculaire structuur die het voorste oppervlak van het oog bedekt en die licht breekt om het zicht mogelijk te maken en het binnenste van het oog beschermt tegen schade. Omdat het hoornvlies wordt blootgesteld aan de omgeving, is het gevoelig voor schade door zowel mechanische oorzaken (krabben) als door infectie. Een hoornvliesletsel bij een verder gezonde patiënt geneest meestal binnen 1-3 dagen. Bij patiënten met onderliggende aandoeningen, waaronder limbale stamceldeficiëntie en diabetes type II, kan het genezingsproces van de hoornvlieswond echter sterk worden verlengd1. Omdat ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research en het Boston University IACUC-protocol (201800302).
1. Ontwerpen van de 3D-geprinte houders en cover bar
- Ontwerp de 3D-geprinte houders en de afdekbalk rekening houdend met de gemiddelde diameter van muisbollen en 3D-print het ontwerp (figuur 1A, B).
- Houd de diameter van de binnenwand van de houder iets groter dan de gemiddelde diameter van de wereldbol om reken....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol is gebruikt om consistent gegevens en afbeeldingen van publicatiekwaliteit te produceren10. De verkregen beelden vertegenwoordigen een aanzienlijke verbetering in vergelijking met eerdere benaderingen (figuur 2). Met behulp van de 3D-geprinte houder kunnen beelden worden vastgelegd in de lagen van het hoornvlies en kan calciummobilisatie in verschillende z-vlakken worden waargenomen (figuur 3). Deze benadering is gebruikt om .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een live cell imaging-techniek die een 3D-geprinte houder gebruikt om intacte dierenogen te stabiliseren en te immobiliseren. Het is ontworpen om verschillende belangrijke nadelen te omzeilen die worden erkend met eerdere live cell imaging-protocollen van ex vivo hoornvliesweefsel. Dit protocol biedt veel voordelen voor de live cell imaging van intacte globes. Het vermindert aanzienlijk onnodige weefselschade die de wondgenezingsreactie op experimenteel geïnduceerde kraswonden zou kunnen .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen de NIH bedanken voor de volgende subsidiesteun: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) en 5T32GM008541-24 (KS). We willen ook het Massachusetts Lions Eye Research Fund en het New England Corneal Transplant Fund erkennen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Materiaal voor houder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well voor beeldvorming. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software gebruikt voor het printen van de houders. |
| BD 25 G 7/8 steriele naalden enkelvoudig gebruik 100 naalden/doos | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | Voor experimenteel veroorzaakte wonden aan de globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Celmembraan counterstain. Calcium indicator. 1:10.000 concentratie met een uiteindelijke concentratie van 1%(v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluronische zuur |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | Voor het bevestigen van de houder aan de beeldvormingswell |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | Voor het printen van de houder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | Licentienummer: GPL2 | Software gebruikt voor het bevestigen van consistentie van wonddiepte en -diameter tussen onafhankelijke globes met behulp van Region of Interest-analyse |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentratie met een uiteindelijke concentratie van 1%(v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluronische zuur |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovien hypofyse-extract, 0,02 nM EGF, 0,3 mM CaCl2 en penicilline-streptomycine (100 eenheden/mL, 100 µg/mL, respectievelijk) toegevoegd aan het medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Gebruikt om overtollig kleurstof van de hoornvliezen af te wassen voor beeldvorming |
| Zeiss Confocal 880 Microscoop met AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x vergrotingsobjectief werd gebruikt |
Referenties
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
