Het huidige werk beschrijft een nieuw experimenteel protocol dat een 3D-geprinte houder gebruikt om live cell imaging met hoge resolutie van enucleated globes mogelijk te maken. Via dit protocol kan de cellulaire calciumsignaleringsactiviteit in gewond hoornvliesepitheel van ex vivo globes in realtime worden waargenomen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-cell beeldvorming van intacte Ex Vivo Globes met behulp van een nieuwe 3D-geprinte houder
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cornea-epitheliale wondgenezing is een migratieproces dat wordt geïnitieerd door de activering van purinerge receptoren die tot expressie komen op epitheelcellen. Deze activering resulteert in calciummobilisatiegebeurtenissen die zich van cel naar cel voortplanten, die essentieel zijn voor het initiëren van cellulaire beweeglijkheid in het wondbed, waardoor efficiënte wondgenezing wordt bevorderd. Het Trinkaus-Randall-lab heeft een methodologie ontwikkeld voor het in beeld brengen van de genezingsrespons van de hoornvlieswond in ex vivo muizenbollen in realtime. Deze aanpak omvat het enucleren van een intacte wereldbol van een muis die volgens vastgestelde protocollen is geëuthanaseerd en onmiddellijk de wereld incuberen met een calciumindicatorkleurstof. Een counterstain die andere kenmerken van de cel kleurt, kan in dit stadium worden toegepast om te helpen bij beeldvorming en cellulaire oriëntatiepunten te tonen. Het protocol werkte goed met verschillende levende celkleurstoffen die worden gebruikt voor counterstaining, waaronder SiR-actine om actine te kleuren en dieprode plasmamembraanvlek om het celmembraan te kleuren. Om de reactie op een wond te onderzoeken, wordt het hoornvliesepitheel verwond met behulp van een naald van 25 G en worden de bollen in een 3D-geprinte houder geplaatst. De afmetingen van de 3D-geprinte houder zijn gekalibreerd om immobilisatie van de wereldbol gedurende de duur van het experiment te garanderen en kunnen worden aangepast aan ogen van verschillende groottes. Live cell imaging van de wondrespons wordt continu uitgevoerd op verschillende diepten in het weefsel in de loop van de tijd met behulp van confocale microscopie. Dit protocol stelt ons in staat om beelden van hoge resolutie, publicatiekwaliteit te genereren met behulp van een 20x luchtdoel op een confocale microscoop. Voor dit protocol kunnen ook andere doelstellingen worden gebruikt. Het vertegenwoordigt een aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van live cell imaging in ex vivo muizenbollen en maakt de identificatie van zenuwen en epitheel mogelijk.
Inleiding
Hoornvlies
Het hoornvlies is een heldere, avasculaire structuur die het voorste oppervlak van het oog bedekt en die licht breekt om het zicht mogelijk te maken en het binnenste van het oog beschermt tegen schade. Omdat het hoornvlies wordt blootgesteld aan de omgeving, is het gevoelig voor schade door zowel mechanische oorzaken (krabben) als door infectie. Een hoornvliesletsel bij een verder gezonde patiënt geneest meestal binnen 1-3 dagen. Bij patiënten met onderliggende aandoeningen, waaronder limbale stamceldeficiëntie en diabetes type II, kan het genezingsproces van de hoornvlieswond echter sterk worden verlengd1. Omdat het hoornvlies sterk geïnnerveerd is, zijn deze niet-genezende hoornvlieszweren en terugkerende cornea-erosies zeer pijnlijk en verminderen ze de kwaliteit van leven van patiënten die ze ervarensterk 1.
Cel signalering
Wanneer een verder gezond hoornvlies gewond raakt, gaan calciumsignaleringsgebeurtenissen in de cellen naast de wond vooraf aan en leiden cellulaire migratie naar het wondbed, waar ze het letsel sluiten zonder het risico op littekens 2,3. Deze signaleringsgebeurtenissen zijn goed gekarakteriseerd in cornea-epitheelcelkweekmodellen met behulp van live cell imaging2. Voorlopige experimenten tonen significant meer calciumsignalering na verwonding in niet-diabetische cellen in vergelijking met diabetische cellen. De karakterisering van de celsignaleringsgebeurtenissen in ex vivo globes is echter een technische uitdaging gebleken.
Live cel beeldvorming
Eerdere studies hebben met succes calciumsignaleringsgebeurtenissen geregistreerd uit in vitro celkweekmodellen van corneawondgenezing 4,5,6. Het ontwikkelen van een methodologie om beelden van hoge kwaliteit te produceren van deze signaleringsgebeurtenissen in ex vivo weefsel is van groot belang omdat het de studie van deze gebeurtenissen in een complexer en levensecht systeem mogelijk zou maken. Eerdere benaderingen betroffen dissectie van het hoornvlies gevolgd door immobilisatie in een UV-geïnduceerde PEG-gel 7,8,9. Immobilisatie is een essentiële maar uitdagende stap bij het werken met levend weefsel, omdat het levensvatbaar en gehydrateerd moet blijven in de loop van het experiment. Bovendien mag immobilisatie het weefsel niet beschadigen. Hoewel de PEG-oplossing het weefsel immobiliseerde, waren de resolutie en kwaliteit van de geproduceerde beelden niet consistent. Daarom zijn 3D-geprinte houders ontwikkeld om intacte bollen te immobiliseren om beelden van hogere kwaliteit te produceren met minder risico op weefselschade.
De aanpak
Een unieke 3D-geprinte houder werd ontwikkeld om intacte ex vivo globes te immobiliseren voor live cell imaging. Deze houder voorkomt schade door twee belangrijke bronnen: het maakt beeldvorming van een enucleated bol mogelijk zonder de noodzaak om het hoornvlies te ontleden, en het elimineert blootstelling aan UV-licht. Zonder deze bronnen van schade gaven de verkregen beelden nauwkeuriger de reactie weer op de krasblessures die experimenteel werden gemaakt. Bovendien werd de 3D-geprinte houder gekalibreerd op de precieze afmetingen van het muizenoog. Dit zorgde voor een veel betere pasvorm dan immobilisatie in peg-oplossing, wat leidde tot een beeld van hogere kwaliteit bij lagere vermogens als gevolg van verminderde weefselbeweging. Een afdekbalk die aan de bovenkant van de houder is bevestigd, zorgt ervoor dat de wereldbol gedurende de hele duur van het experiment onbeweeglijk blijft en dat er geen verplaatsing van de aardbol plaatsvindt wanneer groeimedia worden aangebracht om de hydratatie en levensvatbaarheid te behouden. De mogelijkheid om de houder op precieze afmetingen te printen, stelt ons ook in staat om een optimale pasvorm te genereren voor muizenogen van verschillende groottes vanwege de leeftijd of ziektestatus. Deze technologie kan breder worden toegepast om houders voor de ogen van verschillende soorten te ontwikkelen op basis van hun afmetingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research en het Boston University IACUC-protocol (201800302).
1. Ontwerpen van de 3D-geprinte houders en cover bar
- Ontwerp de 3D-geprinte houders en de afdekbalk rekening houdend met de gemiddelde diameter van muisbollen en 3D-print het ontwerp (figuur 1A, B).
- Houd de diameter van de binnenwand van de houder iets groter dan de gemiddelde diameter van de wereldbol om rekening te houden met de verschillende groottes van individuele muizen. Houd de hoogte van de houder op ongeveer de helft van de diameter van de wereldbol, zodat de wereldbol nauw aansluit wanneer deze wordt vastgezet door de 3D-geprinte afdekbalk.
- Pas de afdekbalk van de houder aan de lengte van de buitendiameter van de houder aan met een breedte van 1/4 tot 1/2 van de diameter van de houder. De afdekbalk is zo groot dat deze toegang heeft tot de wereldbol wanneer deze in de houder is bevestigd voor hydratatie en het verwijderen van het oog aan het einde van het experiment.
- Druk de houder en de afdekbalk af.
2. Monsterverzameling
- Euthanasie muizen (mannelijke C57BL/6 muizen van 9-12 weken en 27 weken oud werden gebruikt voor deze studie) met behulp van gevestigde protocollen in overeenstemming met institutionele richtlijnen. Voer voor dit protocol euthanasie uit met koolstofdioxide gevolgd door onthoofding.
- Verwijder de muiskop en plaats deze onmiddellijk op ijs om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Enucleate de bollen met behulp van dissectietools en voorkom weefselschade.
- Proptose de wereldbol met behulp van een pincet. Knip de oogzenuw met behulp van een dissectieschaar net onder de plek waar deze door het pincet wordt vastgehouden.
OPMERKING: Voer voor verdere voorzorgsmaatregelen de volgende stappen uit in een laminaire stromingskap. - Incubeer de bollen in 2 ml medium in een p35 celkweekschaal inclusief een calciumindicator en/of celmembraanvlek gedurende 1 uur in een 37 °C, 5% CO2-incubator met weinig licht. Zorg ervoor dat de bollen worden ondergedompeld in het kleuringsmedium voor uniforme kleuring.
- Gebruik voor de experimenten die hier worden uitgevoerd de calciumindicator, Fluo4-AM (1:100)2, en celmembraantellervlek, dieprode plasmamembraanvlek (1:10.000)2, met een eindconcentratie van 1% (v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluroninezuur in 2 ml keratinocytenserumvrij medium (KSFM) met de volgende groeisupplementen: 25 μg/ml runderknoefyse-extract, 0,02 nM epidermale groeifactor, 0,3 mM CaCl2 en penicilline-streptomycine (respectievelijk 100 eenheden /ml en 100 μg / ml).
OPMERKING: De incubatieomstandigheden en -tijden zijn variabel, afhankelijk van de calciumindicator, het weefseltype en het monstervolume. Bij het gebruik van pluroninezuur is voorzichtigheid geboden omdat het weefseldoorlatend maakt. Dit protocol vraagt om 10% pluroninezuur. Lagere concentraties pluroninezuur zijn experimenteel vastgesteld om niet effectief te zijn en hogere concentraties riskeren schade aan het weefsel.
- Gebruik voor de experimenten die hier worden uitgevoerd de calciumindicator, Fluo4-AM (1:100)2, en celmembraantellervlek, dieprode plasmamembraanvlek (1:10.000)2, met een eindconcentratie van 1% (v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluroninezuur in 2 ml keratinocytenserumvrij medium (KSFM) met de volgende groeisupplementen: 25 μg/ml runderknoefyse-extract, 0,02 nM epidermale groeifactor, 0,3 mM CaCl2 en penicilline-streptomycine (respectievelijk 100 eenheden /ml en 100 μg / ml).
3. Voorbereiding van de monsterhouders
- Hecht de houders aan een schone glazen bodemafdekking met lijm die nog niet eerder is gebruikt. De lijm die in dit protocol wordt gebruikt, is afkomstig van containers voor eenmalig gebruik om steriliteit te garanderen en er wordt elke keer een nieuwe, ongeopende container gebruikt.
- Was de houder in 70% ethanol. Plaats lijm op de houder en bevestig de houder aan de glazen bodemafdekking. Zorg ervoor dat er geen lijm in het binnenste gedeelte van de houder zit, omdat lijm kan fluoresceren, wat de beeldvorming bemoeilijkt.
- Wacht tot de lijm stolt. Controleer of de houder veilig is tegen de coverslip.
OPMERKING: P35-celplaten met deksels met glazen bodem werden gebruikt voor de experimenten die in dit manuscript worden gepresenteerd. Andere glasbodemplaten en/of platen kunnen worden vervangen op basis van de behoeften van het experiment.
4. Verwonding van de oogbollen
- Verwijder de bollen van de kleuringsoplossing met behulp van steriele oogdruppels en zorg ervoor dat weefselschade aan het betreffende gebied wordt voorkomen. Was de bollen gedurende 5 minuten op kamertemperatuur met behulp van steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing om overtollige vlekken te verwijderen en plaats de bollen in het medium voor transport naar de microscoop.
- Wond de bollen met een steriele naald van 25 G in het interessante gebied.
- Pak met behulp van een steriele oogdruppel de wereldbol op en houd deze vast vanaf de achterkant van het oog. Dit houdt de wereldbol stabiel, voorkomt dat deze rolt en maakt het mogelijk om consistente wonden te maken. Met behulp van deze opstelling bevindt de oogzenuw zich in het mondstuk van de oogdruppel en is het hoornvlies naar buiten gericht.
- Beweeg voor een krabwond voorzichtig een steriele naald van 25 G over het blootgestelde hoornvlies. Voor een prikwond drukt u de naald voorzichtig rechtstreeks in het centrale hoornvlies. Zorg ervoor dat de wond het hoornvlies niet doorboort.
OPMERKING: Sla deze stap over als een wondreactie of gewonde omgeving niet vereist is voor het experiment. Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel krabwonden als prikwonden aan muizenhoornvliezen die met deze methode zijn gemaakt, consistent zijn in zowel diameter als diepte10. Bevestiging van de wondafmetingen tussen onafhankelijke globes werd uitgevoerd met behulp van een regio van belanganalyse.
5. Monsterplaatsing op de houder
- Plaats het hoornvlies of limbale gebied op de coverslip in het binnenste gedeelte van de houder en stabiliseer met behulp van de 3D-geprinte omslag (figuur 1C-H).
- Controleer of de wereldbol correct is geplaatst en of de interessante plaats in contact staat met de glazen afdekplaat. Zodra de bol in de houder is geplaatst, probeer dan niet om de bol te verwijderen, omdat dit weefselschade kan veroorzaken.
- Bevestig de 3D-geprinte hoes met lijm aan de houder, waardoor stabilisatie wordt gegarandeerd. Zorg ervoor dat de afdekbalk aan de houder hecht en niet aan de wereldbol.
OPMERKING: Het gebied dat moet worden afgebeeld, wordt naar beneden geplaatst omdat het protocol is geschreven voor gebruik op een omgekeerde microscoop. Het protocol kan worden aangepast voor rechtopstaande microscopen met behulp van houders met een kleinere binnenradius en het verwijderen van de afdekbalk. Dit zal resulteren in minder globestabilisatie.
6. Voorbeeld beeldvorming
- Schakel de microscoop en omgevingskamer in en controleer of de kamer is bevochtigd. Stel de omgevingskamer in op 35 °C en 5% CO2 voor de duur van het experiment.
OPMERKING: Microscopen met omgevingskamers hebben de voorkeur voor deze procedure om uitdroging te voorkomen en om de aardbol op optimale temperaturen te houden, maar zijn niet vereist. - Plaats de coverslip, houder en gestabiliseerde bol op het microscoopstadium in de omgevingskamer en afbeelding met behulp van live cell imaging-technieken9.
- Pipetteer extra groeimedia op de coverslip om uitdroging te voorkomen en de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden. Zorg ervoor dat er voldoende medium in de put zit om de wereldbol in de houder te bedekken. Afhankelijk van de duur van de beeldvorming, voeg nieuw medium toe wanneer dat nodig is tijdens het experiment.
- Begin met experimenten met behulp van live cell imaging technieken en protocollen. Gebruik laserinstellingen met een laag vermogen om het weefsel te behouden en weefselschade te voorkomen in langdurige experimenten. Gebruik geschikte doelstellingen voor lange werkafstanden. De experimenten in dit manuscript werden uitgevoerd met behulp van een 20x-objectief.
OPMERKING: Het laservermogen en de versterking, de experimentele duur, de locatie en het beeldvlak zijn allemaal variabelen, afhankelijk van de experimentele parameters. Beeldexperimenten op intacte bollen variërend van 1 uur tot 4 uur duur zijn met succes uitgevoerd in eerdere publicaties10. - Record en sla gegevens op in de gewenste bestandsindeling. De software die door de microscoop wordt gebruikt, produceert .czi-bestanden voor gegevensregistratie.
- Gooi de globes weg volgens de standaard institutionele protocollen aan het einde van het protocol.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol is gebruikt om consistent gegevens en afbeeldingen van publicatiekwaliteit te produceren10. De verkregen beelden vertegenwoordigen een aanzienlijke verbetering in vergelijking met eerdere benaderingen (figuur 2). Met behulp van de 3D-geprinte houder kunnen beelden worden vastgelegd in de lagen van het hoornvlies en kan calciummobilisatie in verschillende z-vlakken worden waargenomen (figuur 3). Deze benadering is gebruikt om ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een live cell imaging-techniek die een 3D-geprinte houder gebruikt om intacte dierenogen te stabiliseren en te immobiliseren. Het is ontworpen om verschillende belangrijke nadelen te omzeilen die worden erkend met eerdere live cell imaging-protocollen van ex vivo hoornvliesweefsel. Dit protocol biedt veel voordelen voor de live cell imaging van intacte globes. Het vermindert aanzienlijk onnodige weefselschade die de wondgenezingsreactie op experimenteel geïnduceerde kraswonden zou kunnen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
We willen de NIH bedanken voor de volgende subsidiesteun: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) en 5T32GM008541-24 (KS). We willen ook het Massachusetts Lions Eye Research Fund en het New England Corneal Transplant Fund erkennen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Materiaal voor houder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well voor beeldvorming. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software gebruikt voor het printen van de houders. |
| BD 25 G 7/8 steriele naalden enkelvoudig gebruik 100 naalden/doos | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | Voor experimenteel veroorzaakte wonden aan de globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Celmembraan counterstain. Calcium indicator. 1:10.000 concentratie met een uiteindelijke concentratie van 1%(v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluronische zuur |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | Voor het bevestigen van de houder aan de beeldvormingswell |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | Voor het printen van de houder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | Licentienummer: GPL2 | Software gebruikt voor het bevestigen van consistentie van wonddiepte en -diameter tussen onafhankelijke globes met behulp van Region of Interest-analyse |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentratie met een uiteindelijke concentratie van 1%(v/v) DMSO en 0,1% (w/v) pluronische zuur |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovien hypofyse-extract, 0,02 nM EGF, 0,3 mM CaCl2 en penicilline-streptomycine (100 eenheden/mL, 100 µg/mL, respectievelijk) toegevoegd aan het medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Gebruikt om overtollig kleurstof van de hoornvliezen af te wassen voor beeldvorming |
| Zeiss Confocal 880 Microscoop met AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x vergrotingsobjectief werd gebruikt |
Referenties
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73(2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338(2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14(2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
