Dit protocol beschrijft een robuuste zaailingenbestrijdingsmethode die geen voorafgaande ervaring of training vereist en tegen zeer lage kosten kan worden uitgevoerd met behulp van materialen die gemakkelijk toegankelijk zijn in de meeste laboratoria voor moleculaire biologie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Schaalbare, flexibele en kosteneffectieve zaailingenenting
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zaailingentransplantatie in een vroeg stadium is een populair hulpmiddel geworden in de moleculaire genetica om wortel-scheutrelaties binnen planten te bestuderen. Het enten van zaailingen in een vroeg stadium van de kleine modelplant, Arabidopsis thaliana, is technisch uitdagend en tijdrovend vanwege de grootte en kwetsbaarheid van de zaailingen. Een groeiende verzameling gepubliceerde methoden beschrijft deze techniek met verschillende slagingspercentages, moeilijkheidsgraad en bijbehorende kosten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige procedure om een intern herbruikbaar entapparaat te maken met behulp van siliconenelastomeermix en hoe dit apparaat te gebruiken voor zaailingen. Op het moment van deze publicatie kost elk herbruikbaar entapparaat slechts $ 0,47 aan verbruiksmaterialen om te produceren. Met behulp van deze methode kunnen beginners hun eerste succesvol geënte zaailingen hebben in minder dan 3 weken van begin tot eind. Deze zeer toegankelijke procedure zal laboratoria voor moleculaire genetica van planten in staat stellen om zaailingentransplantatie als een normaal onderdeel van hun experimentele proces vast te stellen. Vanwege de volledige controle die gebruikers hebben bij het maken en ontwerpen van deze entapparaten, kan deze techniek indien gewenst eenvoudig worden aangepast voor gebruik in grotere planten, zoals tomaat of tabak.
Inleiding
Enten is een oude tuinbouwtechniek die rond 500 v.Chr. een gevestigde landbouwpraktijk werd1. Het enten van verschillende soorten gewasplanten om de opbrengsten te verbeteren was het eerste gebruik van deze techniek en wordt nog steeds voor dit doel gebruikt. In het afgelopen decennium heeft enten steeds meer aandacht getrokken als een hulpmiddel voor moleculair biologen om langeafstandssignalering in planten 2,3,4,5 te bestuderen. Hoewel het enten van volwassen planten relatief eenvoudig is, is het enten van planten kort na het ontkiemen een uitdaging. Desondanks is het soms nodig om de effecten van langeafstandssignalering te beoordelen in processen zoals plantenontwikkeling, omgevingsreacties en bloei 6,7,8.
Arabidopsis thaliana is om vele redenen vastgesteld als het modelorganisme in de plantenbiologie, waaronder de relatief kleine omvang, waardoor het gemakkelijk in een laboratorium kan groeien. De kleine omvang en kwetsbaarheid van Arabidopsis-zaailingen maakt het enten van jonge zaailingen echter zeer uitdagend. In veel gevallen is uitgebreide hands-on training vereist om met succes zaailingengraften te verkrijgen. Er zijn in de loop der jaren veel methodologische verbeteringen geweest die ideale groeiomstandigheden en nieuwe technieken hebben geïdentificeerd om het slagingspercentage van zaailingenen 9,10,11 te verhogen. De meest recente tool die werd geïntroduceerd, was een Arabidopsis-zaailingenchip, waarmee zelfs onervaren gebruikers aanvaardbare niveaus van entsucces kunnen bereiken12. Hoewel deze vooruitgang de technische barrière van zaailingenenten aanzienlijk heeft verlaagd, is het chipapparaat duur en wordt het aantal grafts dat parallel kan worden uitgevoerd snel onbetaalbaar.
Bovendien kan dit apparaat alleen worden gebruikt voor Arabidopsis-zaailingen met hypocotylafmetingen die vergelijkbaar zijn met zaailingen van het wilde type. Hoewel Arabidopsis de hoeksteensoort is in de wereld van de moleculaire genetica van planten, is recent werk gedaan bij andere soorten met behulp van zaailingen. Voorbeelden hiervan zijn het enten van sojabonen en de gewone boon, tabak tot tomaat en koolzaad tot Arabidopsis, en vervolgens het bemonsteren van beide weefsels op kleine RNA's13,14. Daarom is een entmethode die voor de meeste laboratoria toegankelijk is en gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala aan plantensoorten zonder grote technische veranderingen, zeer wenselijk.
Dit protocol beschrijft een methode die gebruik maakt van interne productie van een eenvoudig entapparaat dat de volledige aanpassing van de diameter en lengte van het entkanaal mogelijk maakt om elke morfologie van zaailingen voor de meeste plantensoorten mogelijk te maken. De productie van deze apparaten is zeer betaalbaar en zeer schaalbaar, omdat de enige componenten die nodig zijn siliconenelastomeer, bedrading of slangen van de juiste grootte, een zeer nauwkeurig mes en een container zijn om als mal te dienen. Volgens het hier beschreven entprotocol kunnen gebruikers succesvolle entpercentages van 45% (n = 105) bereiken, vergelijkbaar met eerder gerapporteerde entresultaten10,12.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van het apparaat
- Maak het siliconentransplantatieapparaat door siliconenelastomeeroplossing in een vierkante petrischaal (100 mm x 100 mm) te gieten. Bereid 15 ml van de elastomeeroplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant.
OPMERKING: Siliconenelastomeerkits bevatten meestal een vloeistof op siliconenbasis en een uithardingsmiddel, dat wanneer het samen wordt gemengd, de siliconen laat stollen. - Bereid de vierkante petrischaal door vier rechte stukken van 29 G-draad in de vierkante petrischaal te leggen, op gelijke afstand van elkaar (figuur 1A). Zorg ervoor dat de draad gelijk ligt met de bodem van de mal. Om de draad volledig recht te trekken, rolt u deze op een hard uniform oppervlak met een zwaar en plat voorwerp (bijvoorbeeld een metalen buizenrek).
OPMERKING: Twist ties bevatten vaak 29 G draad en kunnen worden gebruikt na het verwijderen van de buitenste papiercoating met aceton. - Giet de gemengde siliconenelastomeeroplossing op de draden en dek af met de bovenkant van de petrischaal. Laat de siliconen 24-48 uur uitharden bij kamertemperatuur.
- Verwijder de siliconenplaat van de petrischaal met een schone tang en ga naar een schoon vlak oppervlak.
- Verwijder de draden van het siliconenvel. Verwijder de dunne laag siliconen die aan de buitenkant van het kanaal achterblijft met een fijne punttang, zodat het kanaal aan één kant open is (figuur 1A).
- Knip de siliconenplaat loodrecht op de kanalen in stroken van 3 mm met een schone schaar. Verplaats elke strip naar een aluminiumfolie envelop en sluit af met autoclaaftape.
- Autoclaaf de strips bij 121 °C gedurende ten minste 30 minuten en bewaar ze tot ze klaar zijn voor gebruik.
2. Voorbereiding van zaailingen
- Steriliseer en vernaliseer zaden.
- Suspensie tot 100 Arabidopsis-zaden in 1 ml 50% bleekoplossing met 0,1% Tween 20 in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en incubeer gedurende 5-10 minuten. Verwijder de bleekoplossing door pipetteren of aspiratie onder steriele omstandigheden. Spoel de zaden met 1 ml gesteriliseerd dH2O. Zorg ervoor dat u de buizen omkeert om de zaden voldoende te spoelen en verwijder eventuele bleekoplossing die aan de bovenkant van de buis achterblijft. Herhaal het spoelen 4x.
- Laat ongeveer 0,25 ml water in de buisjes met de zaden en bewaar bij 4 °C gedurende 3 dagen in het donker.
- Plaat de zaden ter voorbereiding op het enten.
- Bereid een 1% agar MS-plaat als volgt: voor 1 L MS (0,5% sucrose) vast medium, meng 4,4 g MS-zout, 5 g sucrose en 10 g agar in 800 ml water, pas de pH aan op 5,7 met KOH en breng vervolgens het totale volume op 1 L met extra water. Autoclaaf gedurende ten minste 20, minuten voordat ~ 25 ml in de vierkante petrischaaltjes wordt gegoten.
- Verplaats onder steriele omstandigheden het juiste aantal bereide zaden naar de plaat, gebruik een pipetpunt van 20 μL om de zaden te aspirateren en over te brengen.
- Plaats een steriele strip op het plaatoppervlak om de plaatsing van het zaad te begeleiden, zodat de zaden zijn uitgelijnd met de kanalen op de strip. Verwijder de strip zodra de zaden zijn geplateerd.
OPMERKING: Een vierkante plaat van 100 mm x 100 mm biedt plaats aan twee rijen zaailingen (figuur 1B). - Zodra de platen rechtop staan, laat u de vloeistof uit het vaste medium verdampen en verzamelt u zich op de bodem van de plaat. Nadat de zaden op de plaat zijn geplaatst, plaatst u deze op de plaatafdekking en sluit u een kant van de plaat af die evenwijdig is aan de twee rijen zaden (aangegeven door het blauw gemarkeerde gebied in figuur 1B) met parafilm. Wikkel ademende tape bovenop de parafilm en rond alle andere randen van de plaat.
- Sta voorzichtig twee platen omhoog met de parafilm-verzegelde kant naar beneden gericht. Scheid de twee platen aan de onderkant door er een horizontale centrifugebuis van 15 ml tussen te plaatsen en vast te zetten met een elastiekje. Zorg ervoor dat de plaatoppervlakken een hoek van 100°-110° vormen met het tafeloppervlak (figuur 1C).
- Bewaar de platen in deze richting gedurende 72 uur in totale duisternis bij 21 °C, zodat de hypocotylen van de zaailing ~ 5 mm lang kunnen worden. Verwijder na 72 uur de platen uit het donker en groei onder 16 uur licht (intensiteit van 100 μE m-2 sec-1) en 8 uur donkere cycli gedurende nog 2-4 dagen bij dezelfde temperatuur voordat u ent.
- Ent de zaailingen tussen 5 en 7 dagen nadat ze zijn verguld. Plaats een entstrook over de zaailingen en plaats hun hypocotylen in de kanalen. Plaats de zaailing voorzichtig zo dat de wortel-hypocotylverbinding aan de onderkant van de siliconenstrip wordt geplaatst om de zaailing voor te bereiden op het snijden (figuur 1D).
3. Entprocedure
- Bereid een steriele werkomgeving voor door een dissectiekijker te ontsmetten met 70% ethanol en twee paar tangen met fijne punt en een scalpelhandvat te autoclaveren. Voer alle entprocedures uit in een steriele kap en met behulp van een dissectiekijker indien nodig. Voer het grootste deel van de enting uit met een vergroting van 10,5x.
- Bereid de telgen voor. Gebruik een vers scalpelmesje om de hypocotyl loodrecht te snijden om een rechte schone snede te creëren. Duw het mes naar voren in plaats van in de plant te drukken om te voorkomen dat de zaailing in de agar wordt geduwd (Video 1).
- Verwijder de scheut. Zorg ervoor dat het gesneden deel van de shoot gehydrateerd blijft door contact met het mediaoppervlak te garanderen. U kunt de scheut ook verplaatsen naar een aangewezen opslaggebied, zoals de bovenkant van een petrischaal gevuld met steriele dH2O, totdat deze klaar is voor gebruik.
- Bereid de onderstammen voor. Trek voorzichtig aan de wortel door de wortel in de ruimte tussen de gesloten tang te vangen en ze te draaien, waarbij het afgesneden gedeelte van de onderstammen in het midden van de strip blijft (Video 2).
OPMERKING: De fragiele wortel zal worden beschadigd als deze direct tussen de gesloten tang wordt geplet, waardoor de wortel in de scherpe hoek van de pincetuiteinden moet worden gewied om het weefsel te manipuleren. - Pak voorzichtig de gewenste scheut op met behulp van de fijne tang en steek deze in de bovenkant van het kanaal.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om het contact tussen de telgen en onderstammen visueel te bevestigen om een succesvol transplantaat te verkrijgen (Video 3). - Nadat alle enten zijn gemaakt, wikkelt u de platen in met parafilm en ademende tape en plaatst u de platen op dezelfde manier als voorheen, zonder de zaailingen of siliconenstrips te verstoren. Verplaats de platen voorzichtig naar een groeikamer ingesteld op 26 °C met 16 h licht/8 h donkere cycli.
- Evalueer de geënte zaailingen onder steriele omstandigheden na 7-10 dagen. Verwijder voorzichtig de siliconenstrip met een tang door één kant te pellen, zodat de kanalen de zaailingen kunnen bevrijden. Verwijder alle onvoorziene wortels die van de telg groeien door ze met een vers scalpelmesje van de telg af te snijden of ze te verpletteren met een fijne tang. Evalueer visueel of de onderstam stevig aan de telg is gehecht om een succesvolle ent te vormen (figuur 2).
- Verplaats succesvolle enten naar zaailing vermeerderingsgrond om zo lang als nodig te groeien is. Bedek de grond een paar dagen met transparant plastic terwijl de zaailingen zich vestigen. Na het overbrengen van de planten naar de grond, groeien onder de eerder genoemde lichte en donkere cycli bij 21 °C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Verschillende aspecten van het ontwerp van de entstrip werden getest om de optimale entomstandigheden te identificeren die de minste hoeveelheid technische vaardigheid vereisten (tabel 1). Alle entproeven werden voltooid op 0,5% sucrose MS-medium, waarvan eerder is gemeld dat het een ideaal entmediumis 11,12.
Optimale zaailinggroei kan niet worden bereikt met ontkieming op de strip
In de eerste iter...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Samenvatting en betekenis
Vorming van een entunie is cruciaal voor een succesvolle enting, die direct en ongestoord contact tussen de onderstam en de telg vereist. De miniatuurgrootte en kwetsbaarheid van zaailingen van kleine planten zoals Arabidopsis maakt het technisch uitdagend om aan deze eis te voldoen. Een techniek die werd ontwikkeld in vroege Arabidopsis-zaailingenentmethoden was om zowel de telg als de onderstam in een korte siliconenbuiskraag te steken om de entverbinding<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Dankbetuigingen
Met dank aan Javier Brumos voor de initiële training en begeleiding bij het enten van Arabidopsis zaailingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 mL kegelbuisjes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Gecertificeerd Oplosmiddel) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0,5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Moleculaire Biologie), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube buizen (1,5 mL), verpakking van 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand Hoge Precisie #4 Stijl Scalpel Handvat | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lood-Vrije Autoclaaf Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand vierkante petrischalen | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscoop | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige en Skoog Basaal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| kaliumhydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug en Zaailing Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Chirurgisch Ontwerp No. 22 Koolstof Scalpel Blad | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
Referenties
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161(2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14(2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
