Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie

5.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64526

⸱

16 december 2022

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Calciuminflux, een maat voor T-celsignalering, is een effectieve manier om reacties op T-celreceptorstimulatie te analyseren. Dit protocol voor het multiplexen van Indo-1 met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen maakt gebruik van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie.

Samenvatting

Calciuminstroom als reactie op T-celreceptorstimulatie is een veel voorkomende maat voor T-celsignalering. Verschillende calciumindicatorkleurstoffen zijn ontwikkeld om calciumsignalering te beoordelen door band-pass flowcytometrie. Dit protocol is ontworpen om calciumresponsen in primaire murine T-cellen te meten met behulp van full spectrum flowcytometrie. Totale splenocyten worden gelabeld met de ratiometrische calciumindicatorkleurstof Indo-1, samen met een panel van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen celoppervlakmoleculen. Het benutten van de mogelijkheden van full spectrum flowcytometrie biedt een platform voor het gebruik van een breed scala aan celoppervlakvlekken in combinatie met Indo-1. Cellen worden vervolgens in real-time geanalyseerd bij 37 °C voor en na de toevoeging van een anti-CD3-antilichaam om de T-celreceptor te stimuleren. Na het ontmengen van de spectrale signalen wordt de verhouding van calciumgebonden tot calciumvrije Indo-1 berekend en kan deze in de loop van de tijd worden gevisualiseerd voor elke gated populatie van splenocyten. Deze techniek kan de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in meerdere celpopulaties mogelijk maken.

Inleiding

T-celreceptor (TCR) geïnduceerde calciuminflux is een nuttige maat voor T-celactivatie en wordt vaak gebruikt om te bepalen of een populatie T-cellen verminderde reacties heeft in de proximale stappen van de TCR-signaleringsroute1. Metingen van calciuminstroom worden over het algemeen uitgevoerd door de T-cellen vooraf te labelen met één of een paar fluorescerende calciumindicatorkleurstoffen en vervolgens de fluorescerende signalen te onderzoeken met behulp van flowcytometrie in realtime na TCR-crosslinking 2,3,4. Indo-1, een ratio-metrische calciumkleurstof, wordt geëxciteerd door de UV-laser met piekemissies op twee verschillende golflengten, afhankelijk van calciumbinding5, en is een veelgebruikte indicatorkleurstof voor flowcytometrie-analyse van calciumresponsen in levende lymfocyten. Omdat het emissieprofiel van Indo-1 vrij breed is, kan het een uitdaging zijn om Indo-1-beoordeling te combineren met gelijktijdige analyse van meerdere celoppervlakmarkers door band-pass flowcytometrie. Deze beperking beperkt het gebruik van flowcytometrie-analyse van calciumresponsen op voorgezuiverde populaties van T-cellen of op populaties geïdentificeerd door een beperkte set celoppervlakmoleculen.

Om de beperkingen van het meten van calciumresponsen op heterogene populaties van primaire lymfocyten met behulp van band-pass flowcytometrie aan te pakken, werd een protocol ontwikkeld om Indo-1 fluorescentie te meten met behulp van full spectrum flow cytometrie. Deze methode maakt het mogelijk om Indo-1 te multiplexen met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie. Het voordeel van het gebruik van full spectrum flowcytometrie ten opzichte van conventionele flowcytometrie is het vermogen om de fluorescerende signalen te onderscheiden van sterk overlappende kleurstoffen, waardoor het aantal oppervlaktemarkers dat tegelijkertijd in elk monster kan worden beoordeeld, toeneemt. Conventionele flowcytometrie maakt gebruik van bandpassfilters en is beperkt tot één fluorochroom per detectorsysteem6. Full spectrum flowcytometrie verzamelt signalen over het gehele spectrum van het fluorochroom met behulp van 64 detectoren op een vijf-laser spectraal flowcytometriesysteem 7,8. Bovendien maakt full spectrum flowcytometrie gebruik van APD-detectoren (Avalanche Photo Diode) die een verhoogde gevoeligheid hebben ten opzichte van fotomultiplicatorbuisdetectoren die aanwezig zijn op conventionele flowcytometers8. Bijgevolg is deze aanpak ideaal voor de heterogene celpopulaties, zoals perifere mononucleaire bloedcellen of muriene secundaire lymfoïde orgaancelsuspensies, omdat het de noodzaak voor de isolatie van specifieke T-celpopulaties voorafgaand aan calciumkleurstofetikettering elimineert. In plaats daarvan kunnen celoppervlakmarkerexpressieprofielen en flowcytometriegating na gegevensverzameling worden gebruikt om calciumresponsen in elke relevante populatie te beoordelen. Zoals aangetoond in dit rapport, kan Indo-1 gemakkelijk worden gecombineerd met acht fluorochroom-geconjugeerde antilichamen, wat resulteert in een totaal van 10 unieke spectrale handtekeningen. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast op mengsels van cellen uit congenetisch verschillende muizenlijnen, waardoor de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in wildtype T-cellen mogelijk is in vergelijking met die van een gengerichte muizenlijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Muizen werden onderhouden op de Anschutz Medical-campus van de Universiteit van Colorado in overeenstemming met IACUC-protocollen. Alle muizen werden geëuthanaseerd volgens de AAALAC-normen.

1. Bereiding van immuuncellen uit de milt van de muis

LET OP: Euthanaseer naïeve muizen met CO 2-euthanasie. C57BL / 6-muizen gekocht bij Jackson Laboratories en intern gefokt, worden gebruikt voor experimenten op de leeftijd van 6-12 weken. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen worden gebruikt voor experimenten.

  1. Desinfecteer de muizenhuid met 70% ethanol om de kans te verkleinen dat externe verontreinigingen in het monster terechtkomen.
  2. Ontleed de milt van de muis met behulp van dissectiegereedschappen, een chirurgische schaar en een tang. Oogst de milt en plaats de losgemaakte milt in een conische buis van 50 ml met ~ 5 ml complete RPMI-media (cRPMI) op ijs.
    OPMERKING: Complete RPMI bestaat uit 10% FBS, 2 mM L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine.
    1. Om de milt van de muis te oogsten, maakt u met een schaar een incisie van 5 cm in de vacht en huid langs de linkerkant van de muis halverwege tussen de voor- en achterpoten. Open de lichaamsholte ~5 cm en verwijder de milt met een tang. De milt is de kleur van een nierboon en is langer en platter dan de naburige nier.
  3. Giet de inhoud van stap 1.2 op een steriel filter van 70 μm dat is bevestigd aan een nieuwe conische buis van 50 ml. Scheid de milt mechanisch in een suspensie met één cel door de milt door het filter te duwen met een zuiger van 5 ml spuit totdat er geen miltpulp op het filteroppervlak achterblijft.
  4. Pelleteer de splenocyten met behulp van een uitklapbare rotorcentrifuge op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Decanteer het supernatant zorgvuldig. De gepelletiseerde splenocyten blijven op de bodem van de 50 ml conische buis.
  6. Om rode bloedcellen te verwijderen, suspensieer de gepelletiseerde splenocyten opnieuw in 1 ml ACK-lysisbuffer gedurende 3 minuten volgens de instructies van de fabrikant. Meng goed.
  7. Blus de ACK-lysisbuffer met 15 ml cRPMI.
  8. Pellet de lymfocyten zoals aangegeven in stap 1.4.
  9. Suspensie van de celsuspensie opnieuw in 5 ml cRPMI in een conische buis van 50 ml. Leg de monsters op ijs.
    1. Om de cellen te tellen, brengt u 10 μL van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 0,6 ml en verdunt u in een verhouding van 1:1 met trypan blauwe oplossing. Ga vervolgens over naar een hemocytometer of een geautomatiseerd celtelsysteem.
  10. Na het tellen, afhankelijk van de celconcentratie in celsuspensie zoals in stap 1.9, pellet je de cellen in een tafelcentrifuge bij 500 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten om je voor te bereiden op de toevoeging van cRMPI-media die Indo-1 AM-esterkleurstof bevatten.
  11. Bereken het volume voor hersuspensie van de cellen om 10-12 x 106 cellen / ml te bereiken. Dit is een concentratie van 2x van het totale benodigde celgetal.
  12. Suspensie van de cellen opnieuw in het volume cRPMI berekend in stap 1.11. Plaats de cellen bij 37 °C met 5% CO2 in een conische buis van 50 ml met het deksel geventileerd of in een weefselkweekplaat.

2. Indo-1 ratiometrische kleurstof en fluorescerende antilichaametikettering

  1. Voeg volgens de instructies van de fabrikant 50 μL DMSO toe aan een injectieflacon met 50 μg Indo-1 AM. De concentratie van de stamoplossing is 1 μg/μL.
    OPMERKING: DMSO wordt geleverd in microflacons met de kit om oxidatie van DMSO te voorkomen.
  2. Verdun het stamaliquot (1 μg/μL) tot het juiste experimentele volume (vastgesteld in 1.11) cRPMI in een concentratie van 6 μg/ml, een concentratie van 2x. Bewaar Indo-1 niet in een waterige oplossing.
    OPMERKING: Andere buffers met toegevoegd calcium kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de celbehoeften.
  3. Zet complete media met Indo-1 opzij in een waterbad bij 37 °C.
    OPMERKING: Gebruik de minimale concentratie Indo-1 AM-ester die nodig is om een adequaat signaal te verkrijgen. Dit moet worden getitreerd voor verschillende celtypen. Meestal is een concentratie tussen 3-5 μM voldoende. Voor primaire T-cellen verhoogt het laden van cellen met Indo-1 in een concentratie >5 μg/ml de gemiddelde fluorescerende intensiteit (MFI) boven een log van 6 op spectrale flowcytometers. Als dit gebeurt, verlaagt u de UV-laserintensiteit en titreer de Indo-1 naar een lagere concentratie.
  4. Verdun eerder bereide celsuspensie (in stap 1.12), 1:1 in cRPMI, inclusief de 2x Indo-1 media gemaakt in stap 2.2. Zorg ervoor dat de cellen een concentratie hebben tussen 5-6 x 106/ml.
    OPMERKING: Laad geen ongekleurde enkele vlekcontrole of oppervlaktemarkering enkele vlekcelcontroles met Indo-1. Het toevoegen van Indo-1 aan antilichaamcontroles met één vlek zal een meerkleurig monster creëren vanwege de Indo-1 die wordt toegevoegd aan enkele gekleurde cellen. Voeg indo-1 (calciumvrije) EGTA toe aan de monsterplaat die in stap 2.6 is gemaakt.
  5. Voeg 1 ml cellen / put / experimentele toestand toe aan een weefselkweekplaat met 12 putten.
  6. Maak een enkele gekleurde controle voor Indo-1 (calciumvrij) monster met behulp van eerder Indo-1 kleurstof-geladen cellen en voeg EGTA toe tot een uiteindelijke concentratie van 2 mM. EGTA zal calcium in de celsuspensie cheleren, waardoor een schoner controlemonster ontstaat.
    1. Creëer een Indo-1 positieve controle (Indo-1 calciumgebonden) door 50 μM ionomycine toe te voegen aan de kleurstofgeladen celsuspensie bij de flowcytometer. Ionomycine is een membraandoorlatende calciumionofoor die calciumionen bindt en de overdracht van calciumionen in cellen vergemakkelijkt.
  7. Maak een put voor biologische negatieve bestrijding zonder fluoroforen of Indo-1 kleurstof.
  8. Maak een put voor enkele kleurcontroles voor eventuele extra celpopulaties van belang (antilichamen die door de gebruiker zijn gedefinieerd) met behulp van antilichaamgeconjugeerde fluoroforen in een flowcytometriepaneelontwerp. Deze zullen de Indo-1 ratiometrische kleurstof niet omvatten.
  9. Voeg het Fc-receptorblokkerende antilichaam (~ 2 μg / 1 x 106 cellen) toe, volgens de instructies van de fabrikant, voordat extra fluorochroom-geconjugeerde antilichamen voor oppervlaktekleuring worden toegevoegd.
  10. Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  11. Resuspensie van de cellen in een plaat met 12 putten door elke 15 minuten zachtjes op de plaat te tikken.
  12. Meng en verwijder het volledige volume cellen dat in de media is gesuspendeerd van de 12-putplaat. Voeg vervolgens de celsuspensie toe aan microcentrifugebuizen van 1,7 ml.
  13. Pellet de cellen in een microcentrifuge op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Decanteer het supernatant en was de cellen door 1 ml voorverwarmde cRPMI toe te voegen. Pelleteer opnieuw en decanteer het supernatant.
    OPMERKING: Het wassen van de cellen verwijdert alle resterende FC-blokkerende antilichamen.
  14. Resuspendeer de cellen in 1 ml cRPMI in microcentrifugebuizen van 1,7 ml en incubeer elke buis bij 37 °C gedurende nog eens 30 minuten bij 5% CO2, waarbij de bovenkant van de buis iets open blijft om gasuitwisseling mogelijk te maken. Dit maakt volledige de-esterificatie van de intracellulaire AM-esters mogelijk.
  15. Breng de cellen indien nodig terug in een weefselkweekplaat met 12 putten. Extra door de gebruiker gedefinieerde getitreerde fluorochroom-geconjugeerde antilichamen kunnen in een rustfase worden toegevoegd.
    OPMERKING: Markeringen die in het methodenpaneel worden gebruikt, zijn: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 en CD1d/α-galcer tetrameer. Markers worden gekozen om T-cel subsets te analyseren.
    1. Maak een mastermix van alle door de gebruiker gedefinieerde fluorochroom-geconjugeerde antilichamen volgens de celtypen van belang bij een eerder getitreerd volume in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.
    2. Voeg een berekende mastermix toe voor 1 ml van het celvolume, afhankelijk van getitreerde antilichamen tegen rustcellen.
      OPMERKING: Het voordeel van kleuring bij stap 2.15 in plaats van de latere stap 2.18 is dat kleuring bij stap 2.15 de totale incubatietijd voor het experiment verkort. Kleuring in een totaal volume van 1 ml bij stap 2.15 verhoogt echter het gebruik van antilichamen.
  16. Pellet de cellen na rust op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Cellen in een weefselkweekplaat met 12 putten kunnen in de plaat worden gepelletiseerd met een plaatcentrifugeaccessoire. Pellet de cellen anders in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.
  17. Was de cellen door de pellet opnieuw te gebruiken in 1 ml 4 °C koude cRPMI en pellet de cellen opnieuw zoals in stap 2.16. Plaats de cellen op ijs.
    OPMERKING: Als oppervlaktekleuringscellen afzonderlijk worden gebruikt, is na de-esterificatie bij stap 2.18 minder antilichaamvolume nodig. Oppervlaktekleuring bij deze stap kan worden uitgevoerd na de rustfase in koudestroombuffer (1x DPBS met toegevoegde 1% FBS), met behulp van door de gebruiker gedefinieerde antilichamen, op ijs gedurende 30 minuten. Was de cellen na de vlek in cRPMI zoals in stap 2.17.
    1. Voeg levensvatbaarheidsvlek Ghost540 verdund 1:7.500 in DPBS toe aan monsters volgens de instructies van de fabrikant. Warmte doodt de cellen bij 55 °C op een opwarmblok voor enkelgekleurde levend/dood controle.
      OPMERKING: Levensvatbaarheid functionele kleurstofkleuring om dode cellen te elimineren in flowcytometrische analyse wordt uitgevoerd zonder FBS. FBS kan interageren met aminekleurstoffen volgens de instructies van de fabrikant.
  18. Suspensie van afzonderlijke monsters opnieuw in 500 μL cRPMI (fenolroodvrij) met behulp van een polystyreenstroombuis van 5 ml met een dop.
    OPMERKING: Cellen kunnen maximaal een uur bij 4 °C worden bewaard.
  19. Verwarm elke buis van 5 ml met cellen, afzonderlijk, tot 37 °C met behulp van een kraalbad gedurende 7 minuten voorafgaand aan de analyse op de flowcytometer, waarbij de tijd tussen de monsters consistent blijft. Gebruik een timer.

3. Kraalbadbuis: temperatuur handhaven tijdens calciumfluxanalyse

  1. Voeg badkralen toe aan een klein waterbad, zonder toevoeging van water; opwarmen tot 37 °C.
  2. Snijd voorzichtig een conische buis van 50 ml doormidden, bij de markering van 25 ml, met een scheermesje; Gooi de bovenkant van de buis weg.
  3. Vul de gehalveerde tube 3/4 van de weg met badparels.
  4. Plaats de in stap 3.2 gemaakte buis in het kralenbad dat in stap 3.1 is gemaakt. Breng de tube en kralen op 37 °C.
  5. Steek het kraalbad in een stopcontact naast de flowcytometer om de temperatuur te handhaven ter voorbereiding op monsteranalyse.
  6. Voeg een conisch piepschuimrek van 50 ml toe om één buis vast te houden om de buis op zijn plaats te plaatsen terwijl hij op de flowcytometer loopt. Dit elimineert de noodzaak om de buis handmatig vast te houden voor de duur van de curve-analyse.

4. Verwerving van calciuminstroom met behulp van flowcytometrische analyse

  1. Log in op de flowcytometersoftware op een flowanalysator.
  2. Klik op het tabblad Bibliotheek om Indo-1 (calciumgebonden) en Indo-1 (calciumvrij) fluorescerende tags toe te voegen. Selecteer Fluorescerende tags in het softwaremenu aan de linkerkant. Selecteer UV-laser onder fluorescerende taggroepen en klik op +toevoegen om een fluorescerende tagnaam (Indo-1 (calciumgebonden)/Indo-1 (calciumvrij)) aan de bibliotheek toe te voegen. Kies de golflengte van de laserexcitatie en de emissiegolflengte en klik vervolgens op Opslaan. Ga verder met de experimentele opstelling.
    OPMERKING: Indo-1 wordt geëxciteerd door de UV-laser op een golflengte van 355 nm. De emissiegolflengte van Indo-1 (calciumgebonden) is 372 nm. De emissiegolflengte van Indo-1 (calciumvrij) is 514 nm.
  3. Klik op het tabblad Acquisitie. Open/maak een nieuw experiment en voeg de gewenste fluorescerende tags toe aan het experiment.
  4. Maak referentiegroep en een nieuwe voorbeeldgroep(en) voor het experiment. Label indien nodig zowel de monsters als de referentiegroepen.
  5. Stel op het tabblad Acquisities de gebeurtenissen in die moeten worden vastgelegd op het maximum: 10.000.000.
  6. Stel het stopvolume in op het maximale volume: 3.000 μL.
  7. Stel de stoptijd in op de maximale tijd: 36.000 s.
  8. Verkrijg enkele gekleurde controles voor gedefinieerde geconjugeerde antilichamen die zijn opgenomen in het meerkleurige paneel.
  9. Verkrijg enkele gekleurde bedieningselementen voor Indo-1 functionele kleurstof.
    1. Voeg 50 μM ionomycine toe aan de calciumgebonden Indo-1 positieve controle. Vortex om te mixen. Voeg de stroombuis toe aan de injectiepoort van het monster en klik op Opnemen.
    2. Voeg calciumvrije Indo-1 negatieve controle toe aan de flowcytometer en klik op Opnemen. EGTA is toegevoegd in stap 2.6.
    3. Verwijder het mixen van de enkele gekleurde besturingselementen door op de knop Unmix te klikken.
      OPMERKING: Alle enkelvoudige gekleurde controles van alle geconjugeerde antilichamen en functionele kleurstoffen moeten worden geregistreerd voordat de monsters worden ontmengd. Om de Unmix-knop te laten werken, moeten eerst alle referentiebesturingselementen worden opgenomen. Ontmengen kan voor of na het verzamelen van monsters.
  10. Zodra het ontmengen is voltooid, maakt u opeenvolgende plots met behulp van het niet-gemengde werkblad. SSC-A versus FSC-A verwijderen van vuil uit monster, SSC-A versus SSC-H om doubletten te verwijderen. Dit wordt gevolgd door een opruimpoort voor levensvatbaarheid, samen met verdere gating op populaties van belang. Om poorten aan te maken, klikt u op Plot. Voeg een plot toe aan het werkblad en dubbelklik binnen de poort om een stroomafwaartse gated populatie te maken. Ga door totdat alle populaties van belang zijn meegeteld.
  11. Warme enkelgekleurde controlemonsters (van stap 2.6-2.9 in sectie Indo-1 ratiometrische kleurstof en fluorescerende antilichaametikettering) tot 37 °C voor sequentiële analyse. Stel de flowcytometriesoftware in.
  12. Laat DI-water gedurende 2-3 minuten op de cytometer lopen om de vloeistofstabiliteit van de flowcytometer te garanderen.
  13. Stel opeenvolgende plots in op het ongemengde werkblad door poorten te maken met de poortknoppen Polygoon, Rechthoek of Ellips. Poort om de populatie van belang op te nemen (d.w.z. lymfocyten die SSC-A versus FSC-A gebruiken [discriminatie van grootte / lymfocyten]). Negatieve populaties lijken geclusterd rond nul, terwijl positieve populaties kunnen worden gevisualiseerd door MFI te verhogen. Populaties van belang zullen door de gebruiker worden gedefinieerd op basis van de biologische vraag.
  14. Dubbelklik binnen de gemaakte gate en wijzig de parameters van de Y-as en X-as in SSC-A versus SSC-H (singletdiscriminatie). Voltooi het definiëren van de asparameters door met de linkermuisknop op de woorden op de as te klikken.
  15. Maak een plot met SSC-A versus levensvatbaarheid kleurstofsignaal (levensvatbaarheidspoortparameters). Poort op levende cellen, die negatief zijn voor aminekleurstofkleuring. Levende cellen, negatief voor levende dode kleuring, zullen clusteren bij de 0-markering op zowel de Y- als de X-as.
  16. Dubbelklik op de binnenste plot om een nieuwe plot te maken die alleen eencellige levende lymfocyten bevat. Verander de Y-as in Indo-1 (gebonden-calcium) (V1) en/of Indo-1 (vrij-calcium) (V7) versus tijd op de X-as voor visualisatie van de calciuminstroom.
  17. Plaats het verwarmde biologische monster op de SIT van de machine en voer de monsters uit op 2.500-3.000 gebeurtenissen (s) op medium om visualisatie van calciuminstroom in beperkte celaantalpopulaties (bijv. iNKT) mogelijk te maken.
    OPMERKING: Door de cellen te resuspenderen in een concentratie van 1 x 106 / ml, moeten de celgebeurtenissen die worden verzameld met een gemiddelde stroomsnelheid gelijk zijn aan 2.500-3.000 gebeurtenissen / s. Verlaag het debiet onder acquisitiecontrole door op het vervolgkeuzemenu te klikken of verdun het monster als de celsuspensie een verhoogde concentratie heeft. Het uitvoeren van de monsters met een hoge stroomsnelheid kan de verspreiding van het signaal van de ene fluorofoor naar andere fluoroforen in het paneel verhogen.
  18. Voeg de volgende tube toe aan het kralenbad om op te warmen tot 37 °C.
  19. Druk in de Acquisition Control op Record om de initiële gegevens voor 30 s vast te leggen om een basaal niveau van calciumsignalering in het monster te verkrijgen.
  20. Klik in de Acquisition Control op Stop en verwijder de buis uit de Sample Injection Port (SIP).
  21. Voeg 30 μg ongeconjugeerd anti-CD3 rechtstreeks toe aan de monsterbuis om de calciuminstroom te initiëren. De uiteindelijke concentratie per buis is 60 μg/ml.
    OPMERKING: Er is geen wasstap na de toevoeging van anti-CD3.
  22. Plaats de buis zo snel mogelijk terug op de SIP van de machine en druk op Record in de software.
  23. Registreer gegevens gedurende 7 minuten, kijkend naar de tijd die is verstreken onder de acquisitiecontroles in de software, om het tijdsverloop van calciuminstroom binnen de steekproefpopulaties te observeren.
  24. Druk na 7 minuten op Stop in de software en voeg 1 μg / ml ionomycine toe. Neem op gedurende 30 s om het maximale calciumsignaal in de cellen van belang te verkrijgen. Om de overdracht van ionomycine naar het volgende monster te beperken, voltooit u twee SIT-spoelingen op het instrument tussen de monsters.
  25. Ga verder met het volgende voorbeeld en herhaal de workflow totdat alle monsters zijn verzameld.
  26. Sla het experiment op en klik op het zip-bestand exporteren . Ongemengde bestanden (.fsc) worden geüpload naar externe flowcytometrie-analysesoftware.

5. Calcium curve analyse

  1. Met behulp van een analysesoftware6 voor flowcytometrie, zet Indo-1 fluorescerende signalen om in een verhouding voor time-lapse calciummetingen. Leid parameters af onder het tabblad tools door verwijzingen Indo-1 (calciumgebonden)/Indo-1 (vrij-calcium) in te voegen met behulp van een lineaire schaal. Stel het minimum in op nul en het maximum op basis van de instroom van calciumverhouding, meestal rond de 10. De maximale verhouding varieert per celtype en MFI van Indo-1.
  2. Markeer de geselecteerde parameter. Voeg onder tools kinetische analyse toe om de parameter te kiezen door op het tabblad Kinetiek te klikken. Stel de Y-as in op afgeleid.
  3. Selecteer MFI (gemiddelde fluorescerende intensiteit) op het tabblad Kinetica.
  4. Voeg desgewenst Gaussische gladheid toe. Als u Gaussische afvlakking wilt toevoegen, selecteert u de optie in het vervolgkeuzemenu met statistieken in de stroomanalysesoftware. Gaussische afvlakking kan worden toegevoegd om de visualisatie van de calciuminstroomcurve van de analyse glad te strijken.
  5. Maak meerdere bereiken voor statistieken langs het calciumfluxtijdverloop voor biologische vergelijkingen binnen de monsters.
  6. Sleep de voorbeelden naar de lay-outeditor en voeg de statistieken naar wens toe. Statistische analyse varieert afhankelijk van de biologische vraag. Voor publicatiedoeleinden worden meerdere replicaties geanalyseerd met behulp van t-test of ANOVA.
  7. Voor een moment van tijdsanalyse, zet de poort op een specifiek moment in de tijd langs de calciumflux. Onderzoek de gewenste oppervlaktemarkeringen en poort op de populatie van belang; beoordeel vervolgens een tweedimensionale dot-plot van Indo-1 (calciumvrij) versus Indo-1 (calciumgebonden) voor gated cellen binnen dat moment in het tijdsgebied.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De experimentele workflow om calciumresponsen in primaire murine T-cellen te beoordelen met behulp van een Indo-1 ratiometrische kleurstof met multiplexing oppervlaktevlekken is weergegeven in figuur 1. Na het oogsten en verwerken van de splenocyten van de muis tot een enkele celsuspensie, worden de cellen gekleurd met een Indo-1 AM-ester en het oppervlak gekleurd met fluorochroom-gekoppelde antilichamen. Zodra de kleurstofbelasting en antilichaamkleuring zijn voltooid, worden de lymfocytenm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde test die is ontworpen om calciumresponsen te meten in primaire muizen T-cellen geladen met getitreerde Indo-1 ratiometrische indicatorkleurstof met behulp van full spectrum flowcytometrie 7,8. Het voordeel van het uitvoeren van calciumfluxtesten met behulp van volledige spectrum flowcytometrie is de mogelijkheid om oppervlaktecelmarkerkleuring te multiplexen in combinatie met beoordeling van Indo-1-fluorescentie. Full ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen aan te geven.

Dankbetuigingen

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Veel dank aan onze collega's bij Cytek voor voortdurende discussies over volledige spectrale cytometrische analyse op de Aurora en SpectroFlo software. Figuren werden gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 well TC treated platesCell Treat229111
50 mL conicalGreiner Bio141-12-17-0350 mL Polypropyleen centrifugebuizen met dop
5mL polysterene flow tubesCorning352052
5mL syringeBD syringe309646alleen de zuiger wordt gebruikt, de schede wordt weggegooid
70uM filterGreiner bio1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC lysis BufferGibcoA1049201
Aurora Spectral Flowcytometerhttps://cytekbio.com/pages/aurora
Bath BeadscoleparmerItem # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d Tetramer APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
Cell IncubatorFormal Scientific
Dissection Tools forcepsMcKesson#487593weefselforceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Lengte Office Grade Roestvrij staal Niet-steriele Niet-vergrendelingsduimgreep 1 X 2 tanden
Dissection Tools ScissorsMcKesson#970135Operatie-schaar McKesson Argent™ 4-1/2 Inch chirurgische kwaliteit roestvrij staal vingerringgreep rechte scherpe punt / scherpe punt
DPBS 1xGibco14190-136DPBS 
EGTAFisherNC1280093
FBSHyclondSH30071.03lot AE29165301
FlowJo Softwarehttps://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dyeebioscience65-085-39Calcium Ladingskleurstof 
ionomycinMillipore407951-1mg
Live/Dead Ghost 540Tonbo13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mLLight LabsA-7001
Penicillin/Streptomycin/L-GlutamineGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)Tonbo70-0161-M001FC Blok
RPMIGibco1875093 + fenol rood
RPMI phenol freeGibco11835030 -fenol rood
Table top centrifugeBeckman CoulterAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5ebioscience15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent PackProduct No: C06019Omvat Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
WaterbathFisher Brand Dry bath

Referenties

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Calciuminstroom in T-cellencalciumindicatorkleurstofIndo-1-kleuringanti-CD3-stimulatiecalciumfluxanalyseceloppervlaktemarkersmulticolor flowcytometrieT-cel-subsets
Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.