De menselijke schimmelpathogeen Cryptococcus neoformans produceert een verscheidenheid aan virulentiefactoren (bijv. Peptidases) om zijn overleving in de gastheer te bevorderen. Milieuniches vormen een veelbelovende bron van nieuwe natuurlijke peptidaseremmers. Dit protocol schetst de bereiding van extracten van weekdieren en de beoordeling van hun effect op de productie van schimmelvirulentiefactoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van de vermeende anticryptokokkeneigenschappen van ruwe en geklaarde extracten van weekdieren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cryptococcus neoformans is een ingekapselde menselijke schimmelpathogeen met een wereldwijde verspreiding die voornamelijk immuungecompromitteerde individuen infecteert. Het wijdverbreide gebruik van antischimmelmiddelen in klinische omgevingen, hun gebruik in de landbouw en stamhybridisatie hebben geleid tot een verhoogde evolutie van resistentie. Deze stijgende mate van resistentie tegen antischimmelmiddelen is een groeiende zorg onder clinici en wetenschappers over de hele wereld, en er is een verhoogde urgentie om nieuwe antischimmeltherapieën te ontwikkelen. C. neoformans produceert bijvoorbeeld verschillende virulentiefactoren, waaronder intra- en extracellulaire enzymen (bijv. Peptidasen) met rollen in weefselafbraak, cellulaire regulatie en verwerving van voedingsstoffen. De verstoring van dergelijke peptidase-activiteit door remmers verstoort schimmelgroei en -proliferatie, wat suggereert dat dit een belangrijke strategie kan zijn om de ziekteverwekker te bestrijden. Belangrijk is dat ongewervelde dieren zoals weekdieren peptidaseremmers produceren met biomedische toepassingen en antimicrobiële activiteit, maar ze zijn onderbelicht in termen van hun gebruik tegen schimmelpathogenen. In dit protocol werd een wereldwijde extractie uit weekdieren uitgevoerd om potentiële peptidaseremmers in ruwe en geklaarde extracten te isoleren, en hun effecten tegen klassieke cryptokokkenvirulentiefactoren werden beoordeeld. Deze methode ondersteunt de prioritering van weekdieren met schimmelwerende eigenschappen en biedt mogelijkheden voor de ontdekking van antivirulentiemiddelen door gebruik te maken van de natuurlijke remmers die in weekdieren worden aangetroffen.
Inleiding
Cryptococcus neoformans is een menselijke schimmelpathogeen die ernstige ziekten veroorzaakt bij immuungecompromitteerde gastheren, zoals personen die leven met HIV / AIDS1, en leidt tot ongeveer 19% van de AIDS-gerelateerde sterfgevallen2. De schimmel is gevoelig voor verschillende klassen van antischimmelmiddelen, waaronder azolen, polyenen en flucytosine, die fungicide en fungistatische activiteit uitoefenen met behulp van verschillende mechanismen 3,4. Het uitgebreide gebruik van antischimmelmiddelen in klinische en agrarische o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Eiwitextractie uit weekdieren
- Verzamel weekdieren uit een aangewezen en goedgekeurd natuurgebied (bijv. Speed River, Guelph, Ontario). Voor deze studie werden zowel inheemse als invasieve soorten geselecteerd om een breed scala aan potentiële antischimmeleffecten te beoordelen.
- Breek voorzichtig de schaal van de weekdieren (bijv. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi en Cipangopaludina chinensis) met behulp van een stamper en vijzel en verwijder de vaste stukken met een pincet. Over het algemeen worden 10 weekdieren samengevoegd voor gebruik in het hele protocol.
- Verzamel en weeg de organen.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De hierin beschreven workflow maakt de isolatie mogelijk van eiwitten en peptiden uit weekdieren met potentiële antivirulentie-eigenschappen tegen C. neoformans. Evenzo maakt het beoordelen van verschillende vormen van extracten (d.w.z. ruw en geklaard) de semi-zuivering van de potentiële actieve verbindingen mogelijk en ondersteunt het downstream-beoordeling (bijv. Op massaspectrometrie gebaseerde proteomica). Doorgaans produceert de eiwitextractieworkflow gehomogeniseerde oplossingen met eiwitconcentraties van.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier beschreven extractieprotocol schetst de isolatie van verbindingen uit weekdieren verzameld uit Ontario, Canada, en toont een nieuw onderzoek naar het gebruik van weekdierextracten tegen de menselijke schimmelpathogeen, C. neoformans. Dit protocol draagt bij aan een groeiend aantal onderzoeken naar de activiteit van peptidaseremmers van ongewervelde dieren13. Tijdens de extractie waren sommige extractmonsters moeilijk te filteren-steriliseren, mogelijk vanwege de aanwezigheid van .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken leden van het Geddes-McAlister Lab voor hun waardevolle steun tijdens dit onderzoek en hun manuscriptfeedback. De auteurs erkennen de financiële steun van de Ontario Graduate Scholarship en International Graduate Research Award - University of Guelph tot D. G.-G en van de Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) en Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award voor J. G.-M.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Niet beschikbaar | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Niet beschikbaar | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referenties
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
