Methodenartikel

Automatisering van de micronucleustest met behulp van beeldvorming, flowcytometrie en kunstmatige intelligentie

DOI:

10.3791/64549

⸱

27 januari 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micronucleus (MN) assay is een gevestigde test voor het kwantificeren van DNA-schade. Het scoren van de test met behulp van conventionele technieken zoals handmatige microscopie of op functies gebaseerde beeldanalyse is echter bewerkelijk en uitdagend. Dit artikel beschrijft de methodologie om een kunstmatig intelligentiemodel te ontwikkelen om de MN-test te scoren met behulp van imaging flow cytometriegegevens.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micronucleus (MN) assay wordt wereldwijd gebruikt door regelgevende instanties om chemicaliën te evalueren op genetische toxiciteit. De test kan op twee manieren worden uitgevoerd: door MN te scoren in eenmaal verdeelde, cytokinese-geblokkeerde binucleated cellen of volledig gedeelde mononucleated cellen. Historisch gezien is lichtmicroscopie de gouden standaardmethode geweest om de test te scoren, maar het is bewerkelijk en subjectief. Flowcytometrie is de afgelopen jaren gebruikt om de test te scoren, maar wordt beperkt door het onvermogen om belangrijke aspecten van cellulaire beelden visueel te bevestigen. Imaging flow cytometry (IFC) combineert high-throughput beeldopname en geautomatiseerde beeldanalyse en is met succes toegepast om snel beelden te verzamelen van en alle belangrijke gebeurtenissen in de MN-test te scoren. Onlangs is aangetoond dat kunstmatige intelligentie (AI) -methoden op basis van convolutionele neurale netwerken kunnen worden gebruikt om MN-testgegevens te scoren die door IFC zijn verkregen. Dit artikel beschrijft alle stappen om AI-software te gebruiken om een deep learning-model te maken om alle belangrijke gebeurtenissen te scoren en om dit model toe te passen om automatisch aanvullende gegevens te scoren. De resultaten van het AI deep learning-model zijn goed te vergelijken met handmatige microscopie, waardoor een volledig geautomatiseerde score van de MN-test mogelijk is door IFC en AI te combineren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micronucleus (MN) assay is fundamenteel in de genetische toxicologie om DNA-schade te evalueren bij de ontwikkeling van cosmetica, farmaceutische producten en chemicaliën voor menselijk gebruik 1,2,3,4. Micronuclei worden gevormd uit hele chromosomen of chromosoomfragmenten die na deling niet in de kern worden opgenomen en condenseren in kleine, cirkelvormige lichamen die gescheiden zijn van de kern. MN kan dus worden gebruikt als een eindpunt om DNA-schade te kwantificeren in genotoxiciteitstests1.

De voorkeursmethode voor het kwantificeren van MN is binnen eenmaal verdeelde binucleated cellen (BNC's) door de deling te blokkeren met behulp van Cytochalasine-B (Cyt-B). In deze versie van de test wordt de cytotoxiciteit ook beoordeeld door mononucleated (MONO) en polynucleated (POLY) cellen te scoren. De test kan ook worden uitgevoerd door MN te scoren in niet-geblokkeerde MONO-cellen, wat sneller en gemakkelijker te scoren is, waarbij cytotoxiciteit wordt beoordeeld met behulp van celtellingen vóór en na blootstelling om proliferatie 5,6 te beoordelen.

Fysieke scoring van de test is historisch uitgevoerd door middel van handmatige microscopie, omdat dit visuele bevestiging van alle belangrijke gebeurtenissen mogelijk maakt. Handmatige microscopie is echter uitdagend en subjectief1. Zo zijn geautomatiseerde technieken ontwikkeld, waaronder microscoopglaasscanning en flowcytometrie, elk met hun eigen voordelen en beperkingen. Terwijl diascanmethoden het mogelijk maken om belangrijke gebeurtenissen te visualiseren, moeten dia's worden gemaakt met een optimale celdichtheid, wat moeilijk te bereiken kan zijn. Bovendien ontbreekt het deze techniek vaak aan cytoplasmatische visualisatie, wat de score van MONO- en POLO-cellen 7,8 in gevaar kan brengen. Hoewel flowcytometrie gegevensverzameling met een hoge doorvoer biedt, moeten de cellen worden gelyseerd, waardoor het gebruik van de Cyt-B-vorm van de test niet mogelijk is. Bovendien biedt conventionele flowcytometrie, als een niet-beeldvormende techniek, geen visuele validatie van belangrijke gebeurtenissen 9,10.

Daarom is imaging flow cytometrie (IFC) onderzocht om de MN-test uit te voeren. De ImageStreamX Mk II combineert de snelheid en statistische robuustheid van conventionele flowcytometrie met de hoge resolutie beeldvormingsmogelijkheden van microscopie in één systeem11. Het is aangetoond dat door gebruik te maken van IFC, beelden met hoge resolutie van alle belangrijke gebeurtenissen kunnen worden vastgelegd en automatisch kunnen worden gescoord met behulp van feature-based 12,13 of kunstmatige intelligentie (AI) technieken 14,15. Door IFC te gebruiken om de MN-test uit te voeren, is het automatisch scoren van veel meer cellen in vergelijking met microscopie in een kortere tijd haalbaar.

Dit werk wijkt af van een eerder beschreven beeldanalyseworkflow16 en bespreekt alle stappen die nodig zijn om een Random Forest (RF) en/of convolutioneel neuraal netwerk (CNN) model te ontwikkelen en te trainen met behulp van de Amnis AI-software (hierna "AI-software" genoemd). Alle noodzakelijke stappen worden beschreven, inclusief het invullen van ground truth-gegevens met behulp van AI-ondersteunde tagging-tools, interpretatie van modeltrainingsresultaten en toepassing van het model om aanvullende gegevens te classificeren, waardoor berekening van genotoxiciteit en cytotoxiciteit15 mogelijk is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Data-acquisitie met behulp van imaging flow cytometrie

OPMERKING: Raadpleeg Rodrigues et al.16 met de volgende wijzigingen, waarbij wordt opgemerkt dat de acquisitieregio's die IFC gebruiken mogelijk moeten worden gewijzigd voor optimale beeldvastlegging:

  1. Voor de niet-Cyt-B-methode voert u een celtelling uit met behulp van een in de handel verkrijgbare cellenteller volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) op elke cultuur onmiddellijk vóór de kweek en onmiddellijk na de herstelperiode.
  2. Als u monsters uitvoert op een flowcytometer met één camerabeeld, plaatst u de Brightfield (BF) in kanaal 4. Vervang M01 door M04 en M07 door M01.
    OPMERKING: "M" verwijst naar het camerakanaal op de IFC.
  3. Gebruik de 40x vergroting tijdens de acquisitie.
  4. Gebruik op de grafiek BF-gebied versus BF-hoogte-breedteverhouding tijdens de acquisitie de volgende regiocoördinaten:
    X-coördinaten: 100 en 900; Y-coördinaten: 0,7 en 1 (Cyt-B methode)
    X-coördinaten: 100 en 600; Y-coördinaten: 0.7 en 1
  5. Gebruik op het intensiteitsdiagram Hoechst de volgende regiocoördinaten:
    X-coördinaten: 55 en 75; Y-coördinaten: 9.5 en 15 (Cyt-B methode)
    X-coördinaten: 55 en 75; Y-coördinaten: 13 en 21 (niet-Cyt-B methode)
  6. Om afbeeldingen van apoptotische en necrotische objecten uit de gegevens te verwijderen, start u het IDEAS 6.3-softwarepakket (hierna de "beeldanalysesoftware" genoemd; zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: De AI-software is ontworpen om te werken met .daf-bestanden die zijn verwerkt met behulp van de nieuwste versie van de beeldanalysesoftware. Zorg ervoor dat de beeldanalysesoftware up-to-date is.
  7. Sla dit werk op als een sjabloonbestand (.ast).

2. .daf-bestanden maken voor alle .rif-bestanden

  1. De AI-software staat alleen het importeren van .daf-bestanden toe. Maak .daf-bestanden voor alle RIF-bestanden in het experiment via batchverwerking.
  2. Klik in het menu Extra op Batchgegevensbestanden en klik vervolgens op Batch toevoegen.
  3. Selecteer in het nieuwe venster Bestanden toevoegen en selecteer de RIF-bestanden die aan de batch moeten worden toegevoegd. Selecteer onder de optie Selecteer een sjabloon of gegevensanalysebestand (.ast, .daf) het AST-bestand dat eerder is gemaakt.
  4. Wijs indien nodig een batchnaam toe en klik op OK om .daf-bestanden te maken voor alle geladen .rif-bestanden.

3. Een experiment maken in de AI-software

  1. Raadpleeg het stroomdiagram in figuur 1 dat het proces beschrijft van het maken van een deep learning-model met behulp van de AI-software.
  2. Start de AI-software en zorg ervoor dat de meest recente versie is geïnstalleerd door op Info in de linkerbenedenhoek van het venster te klikken. Als de meest recente versie niet is geïnstalleerd, neemt u contact met support@luminexcorp.com op om deze te verkrijgen.
  3. Het standaardscherm in de software is het scherm Nieuw experiment . Gebruik het mappictogram om te kiezen waar u het experiment wilt opslaan en typ een naam voor het experiment (bijvoorbeeld 'MN-model').
  4. Klik onder Experimenttype op het keuzerondje naast Trein om een trainingsexperiment te starten om te beginnen met het bouwen van het CNN-model. Klik op Volgende.
    1. Optioneel: als een model eerder is getraind, kan het worden gebruikt als sjabloon voor een nieuw AI-model en kan het worden geselecteerd als sjabloon voor het maken van een nieuw model in het scherm Sjabloonmodel selecteren . Als er geen sjabloonmodel bestaat, slaat u deze stap over door op Volgende te klikken.
  5. Het volgende scherm is het scherm Nieuw model definiëren . Onder Model wordt de naam die in stap 3.3 aan het model is gegeven, automatisch ingevuld.
    1. Typ onder Beschrijving een beschrijving voor het model (optioneel) en laat de maximale afbeeldingsgrootte op 150 pixels staan.
    2. Klik onder Kanalen op BF toevoegen om een brightfield-kanaal aan de lijst toe te voegen. Dubbelklik onder Naam op Brightfield en hernoem dit kanaal naar BF. Klik op FL toevoegen om een fluorescerend kanaal aan de lijst toe te voegen. Dubbelklik onder Naam op Fluorescerend en hernoem dit kanaal naar DNA.
    3. Klik onder Klassenamen op Toevoegen. Typ in het pop-upvenster Mononucleated en klik op OK. Hiermee wordt de klasse mononucleated toegevoegd aan de lijst met klassenamen. Herhaal dit proces om ervoor te zorgen dat de volgende zes klassen in de lijst worden gedefinieerd:
      Mononucleated
      Mononucleated met MN
      Binucleated
      Binucleated met MN
      Polynucleaat
      Onregelmatige morfologie
      Klik op Volgende.
      OPMERKING: Deze zes ground truth-modelklassen vertegenwoordigen de belangrijkste gebeurtenissen die moeten worden gescoord, evenals afbeeldingen met een morfologie die afwijkt van de geaccepteerde scorecriteria5.
      1. Optioneel: Indien gewenst kan de analysesjabloon uit 1.7 worden opgenomen om functies uit de beeldanalysesoftware te gebruiken. Als u deze functies in het AI-model wilt opnemen, bladert u naar het AST-bestand en kiest u vervolgens in de kanaalspecifieke vervolgkeuzelijsten de functiesubsets die u wilt opnemen.
    4. Klik onder Bestanden selecteren op Bestanden toevoegen en blader naar de gewenste bestanden die aan de AI-software moeten worden toegevoegd om de grondwaarheidsgegevens te bouwen. Klik op Volgende.
      OPMERKING: Het is belangrijk om meerdere gegevensbestanden toe te voegen (bijv. positieve en negatieve controlegegevens) die een voldoende aantal van alle belangrijke gebeurtenissen bevatten.
  6. Zoek vervolgens op het scherm Basispopulaties selecteren de niet-apoptotische populatie uit de populatiehiërarchie. Klik met de rechtermuisknop op de niet-apoptotische populatie en selecteer Alle overeenkomende populaties selecteren. Klik op Volgende.
    OPMERKING: Het is belangrijk om populaties uit te sluiten die niet geclassificeerd mogen worden (bijv. Kralen, puin, doubletten, enz.)
  7. Dit scherm is het scherm Waarheidspopulaties selecteren .
    1. Als getagde waarheidspopulaties van de belangrijkste gebeurtenissen niet zijn gemaakt in de beeldanalysesoftware, klik dan op Volgende.
    2. Als getagde waarheidspopulaties zijn gemaakt in de beeldanalysesoftware, wijst u deze toe aan de juiste modelklasse.
    3. Om een gelabelde waarheidspopulatie van MONO-cellen met MN toe te wijzen, klikt u op de klasse Mononucleated with MN onder Model Classes aan de linkerkant. Klik vervolgens op de juiste getagde waarheidspopulatie aan de rechterkant die deze gebeurtenissen bevat.
    4. Als de gelabelde waarheidspopulaties in meer dan één gegevensbestand zijn gemaakt, klikt u met de rechtermuisknop op een van de waarheidspopulaties en selecteert u Alle overeenkomende populaties selecteren om gelabelde populaties uit meerdere bestanden aan de juiste klasse toe te voegen.
    5. Zodra alle geschikte waarheidspopulaties zijn toegewezen, klikt u op Volgende.
  8. Kies op het scherm Kanalen selecteren de juiste kanalen voor het experiment. Stel hier BF in op kanaal 1 en Hoechst op kanaal 7. Klik met de rechtermuisknop op een kanaal en selecteer Toepassen op alles. Klik op Volgende.
  9. Klik ten slotte in het bevestigingsscherm op Experiment maken.
  10. De AI-software laadt afbeeldingen uit de gegevensbestanden en maakt de modelklassen die zijn gedefinieerd in stap 3.5.3 met de grondwaarheidsbeelden die zijn toegewezen in stap 3.7. Klik op Voltooien.
  11. Zodra het experiment is gemaakt, worden vijf opties weergegeven:
    Experiment: biedt details van het experiment, waaronder geladen gegevensbestanden, gekozen kanalen en gedefinieerde ground truth-modelklassen.
    Tagging: lanceert de tagging-tool waarmee gebruikers ground truth-gegevens kunnen invullen.
    Training: traint een model op basis van de ground truth data.
    Classificeren: maakt gebruik van getrainde modellen om gegevens te classificeren.
    Resultaten: geeft resultaten van zowel een trainingsexperiment als een classificatie-experiment.

4. De ground truth-gegevens invullen met behulp van AI-ondersteunde tagging-tools

  1. Klik op Tagging om de interface van de tagging-tool te starten.
    1. Klik op de zoomgereedschappen (vergrootglaspictogrammen) om de afbeeldingen bij te snijden voor een eenvoudigere weergave.
    2. Klik op de schuifbalk om de afbeeldingsgrootte aan te passen om te wijzigen hoeveel afbeeldingen in de galerij worden weergegeven.
    3. Klik op de optie Weergave-instelling en kies Min-Max, wat het beste contrastbeeld biedt voor het identificeren van alle belangrijke gebeurtenissen.
    4. Klik op Setup Gallery Display om de kleur van het DNA-beeld te wijzigen in geel of wit, wat de visualisatie van kleine objecten (bijv. MN) zal verbeteren.
  2. Klik op Cluster om het algoritme uit te voeren om objecten met een vergelijkbare morfologie samen te groeperen. Zodra het clusteren is voltooid, worden de afzonderlijke clusters met het aantal objecten per cluster weergegeven in een lijst onder Onbekende populaties. Selecteer de afzonderlijke clusters om de objecten binnen het cluster weer te geven en wijs deze objecten toe aan de juiste modelklassen.
  3. Nadat aan elke modelklasse minimaal 25 objecten zijn toegewezen, komt het Predict-algoritme beschikbaar. Klik op Voorspellen.
    OPMERKING: Objecten die niet goed in een populatie passen, blijven geclassificeerd als Onbekend. Naarmate er meer objecten aan de waarheidspopulaties worden toegevoegd, verbetert de nauwkeurigheid van de voorspelling.
  4. Ga door met het vullen van de ground truth-modelklassen met de juiste afbeeldingen totdat een voldoende aantal objecten in elke klasse is bereikt.
  5. Zodra er minimaal 100 objecten aan elke modelklasse zijn toegewezen, klikt u op het tabblad Training boven aan het scherm. Klik op de knop Trein om een model te maken met behulp van de Random Forest- en CNN-algoritmen.
    OPMERKING: De AI-software maakt modellen met behulp van zowel de Random Forest- als CNN-algoritmen, de selectievakjes maken het mogelijk om modellen te maken met alleen Random Forest of CNN-algoritmen.

5. Beoordeling van de nauwkeurigheid van het model

  1. Zodra de modeltraining is voltooid, klikt u op Resultaten bekijken.
  2. Gebruik het resultatenscherm om de nauwkeurigheid van het model te beoordelen. Gebruik het vervolgkeuzemenu om te schakelen tussen Random Forest en CNN.
    OPMERKING: De waarheidspopulaties kunnen worden bijgewerkt en het model kan opnieuw worden getraind of worden gebruikt zoals het is om aanvullende gegevens te classificeren.
    1. Om de waarheidspopulaties bij te werken, klikt u bovenaan op Tagging en volgt u sectie 4.

6. Gegevens classificeren met behulp van het model

  1. Start de AI-software. Het standaardscherm is het scherm Nieuw experiment . Gebruik het mappictogram om te kiezen waar u het experiment wilt opslaan en typ een naam voor het experiment .
  2. Klik onder Experimenttype op het keuzerondje naast Classificeren om een classificatie-experiment te starten. Klik op Volgende.
  3. Klik op het model dat u wilt gebruiken voor classificatie en klik vervolgens op Volgende.
  4. Klik in het scherm Bestanden selecteren op Bestanden toevoegen en blader naar de bestanden die moeten worden geclassificeerd volgens het CNN-model. Klik op Volgende.
  5. Klik vervolgens op het scherm Basispopulaties selecteren op het selectievakje naast de niet-apoptotische populatie in een van de geladen bestanden. Klik met de rechtermuisknop op de niet-apoptotische populatie en klik op Selecteer alle overeenkomende populaties om deze populatie te selecteren uit alle geladen bestanden. Klik op Volgende.
  6. Optioneel: als de te classificeren gegevens waarheidspopulaties bevatten, kunnen ze worden toegewezen aan de juiste modelklassen op het scherm Waarheidspopulaties selecteren. Klik anders op Volgende om deze stap over te slaan.
  7. Kies in het scherm Kanalen selecteren de optie Kanaal 1 voor brightfield en Kanaal 7 voor de DNA-kleuring. Klik met de rechtermuisknop op een kanaal en klik op Toepassen op iedereen. Klik vervolgens op Volgende.
  8. Klik ten slotte in het bevestigingsscherm op Experiment maken. De AI-software laadt het geselecteerde model en alle afbeeldingen uit de gekozen gegevensbestanden. Klik op Voltooien.
  9. Klik op Classificeren om het classificatiescherm te starten. Klik op de knop Classificeren . Hiermee begint het proces van het gebruik van het RF- en CNN-model om aanvullende gegevens te classificeren en alle objecten te identificeren die in de opgegeven modelklassen thuishoren.
    OPMERKING: De selectievakjes kunnen worden gebruikt om het RF-model en/of het CNN-model te selecteren.
  10. Zodra de classificatie is voltooid, klikt u op Resultaten bekijken.
  11. Klik op de knop DAF's bijwerken om het venster DAF's bijwerken met classificatieresultaten weer te geven. Klik op OK om de .daf-bestanden bij te werken.

7. Het genereren van een rapport van de classificatieresultaten

  1. Klik in het scherm Resultaten op Rapport genereren. Schakel het selectievakje naast Rapport maken voor elke invoer-DAF in als een afzonderlijk rapport voor elke invoer-DAF vereist is. Klik op OK.
  2. Als u klaar bent, opent u de map waarin de rapportbestanden zijn opgeslagen. In de map bevindt zich een experiment .pdf rapport en een map Resources .
  3. Open de .pdf om het rapport weer te geven. Het rapport bevat model- en experimentinformatie, de lijst met daf-invoerbestanden, de klassentellingen en klassepercentages in tabel- en histogramindeling en een verwarringsmatrix die de mediane voorspellingskans voor alle daf-invoerbestanden samenvat.
  4. Open de map Resources en vervolgens de map CNN . In deze map bevinden zich .png bestanden van de klassentelling en percentagebalkdiagrammen, evenals de verwarringsmatrix. Bovendien zijn er .csv bestanden met de klassentellingen en percentages voor elk invoerbestand.

8. Bepaling van MN-frequentie en cytotoxiciteit

  1. MN-frequentie berekenen
    1. Niet-Cyt-B-methode: Om de MN-frequentie te bepalen, opent u het class_count.csv bestand uit stap 7.4. Deel voor elk invoerbestand de tellingen in de populatie "Mononucleated with MN" door de tellingen in de "Mononucleated" populatie en vermenigvuldig met 100:
      figure-protocol-1
    2. Cyt-B-methode: Om de MN-frequentie te bepalen, opent u het class_count.csv bestand uit stap 7.4. Deel voor elk invoerbestand de tellingen in de populatie "Binucleated with MN" door de tellingen in de "Binucleated" populatie en vermenigvuldig met 100:
      figure-protocol-2
  2. Cytotoxiciteit berekenen
    1. Niet Cyt-B methode:
      1. Bereken met behulp van de initiële celtellingen en de celtellingen na de behandeling eerst de populatieverdubbeling (PD) voor elk monster2:
        figure-protocol-3
      2. Bereken vervolgens de relatieve bevolkingsverdubbeling2:
        figure-protocol-4
      3. Bereken ten slotte de cytotoxiciteit2 voor elk monster:
        figure-protocol-5
    2. Cyt-B methode:
      1. Om de Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2 te berekenen, gebruikt u de tellingen in de klassen mononucleated, binucleated en polynucleated voor elk monster uit het class_count.csv bestand:
        figure-protocol-6
      2. Om cytotoxiciteit2 te berekenen, gebruikt u de CBPI uit de controleculturen (C) en blootgestelde culturen (T):
        figure-protocol-7

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont de workflow voor het gebruik van de AI-software om een model te maken voor de MN-test. De gebruiker laadt de gewenste .daf-bestanden in de AI-software en wijst vervolgens objecten toe aan de ground truth-modelklassen met behulp van de AI-ondersteunde cluster (figuur 2) en predict (figuur 3) tagging-algoritmen. Zodra alle ground truth-modelklassen zijn gevuld met voldoende objecten, kan het model worden getraind met be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van deep learning-algoritmen om de scoring van de MN-test te automatiseren. Verschillende recente publicaties hebben aangetoond dat intuïtieve, interactieve tools het mogelijk maken om deep learning-modellen te maken om beeldgegevens te analyseren zonder de noodzaak van diepgaande computationele kennis18,19. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven met behulp van een softwarepakket met gebruikersinterface, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn in dienst van Luminex Corporation, een DiaSorin Company, de fabrikant van de ImageStream imaging flow cytometer en de Amnis AI-software die in dit werk wordt gebruikt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL centrifuge tubeFalcon352096
Cleanser - Coulter Clenz Beckman Coulter8546931Vul de container met 200 mL Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/0/
ColchicineMilliporeSigma64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter MilliporeSigmaCLS4307690,22 µm filter, 500 mL fles
Cytochalasin BMilliporeSigma14930-96-25 mg fles
Debubbler - 70% IsopropanolMilliporeSigma1.3704Vul de container met 200 mL Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)MilliporeSigma67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra PurePolysciences, Inc.04018Dit is wat wordt gebruikt voor de 4% en 1% Formalin. WAARSCHUWING: Formalin/Formaldehyde giftig bij inademing en als het wordt ingeslikt.  Irriterend voor de ogen, ademhalingswegen en huid.  Kan bij inademing of huidcontact sensibilisatie veroorzaken. Risico op ernstig oogletsel.  Mogelijk kankergevaar.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell AnalyzerLuminex0500-3115Een Guava Muse Cell Analyzer met standaardconfiguratie werd gebruikt.
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/mL oplossing
MannitolMilliporeSigma69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex, a DiaSorin company100220Een ImageStreamX Mark II met 2 camera's, uitgerust met de 405 nm, 488 nm en 642 nm lasers werd gebruikt.
MIFC analysis software - IDEASLuminex, a DiaSorin company100220"Beeldanalyse software"
De bijbehorende software voor de MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRELuminex, a DiaSorin company100220"Beeldacquisitiesoftware"
Dit is de software die de MIFC (ImageStreamX MKII) aanstuurt
Amnis AI softwareLuminex, a DiaSorin company100221"AI software"
Dit is de software die het maken van kunstmatige intelligentiemodellen toestaat om gegevens te analyseren
Mitomycin CMilliporeSigma50-07-7
NEAA Mixture 100xLonza BioWhittaker13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100XGibco15070063
Potassium Chloride (KCl)MilliporeSigmaP9541
Rinse - Ultrapure water or deionized waterNANAGebruik elk ultrapuur water of gedeioniseerd water.  Vul de container met 900 mL Rinse.
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1xHyCloneSH30027.01
Sheath - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BDit is hetzelfde als Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x  Ca++MG++ vrij.  Vul de container met 900 mL Sheath.
Sterile waterHyCloneSH30529.01
Sterilizer - 0,4%–0,7% HypochloriteVWRJT9416-1Dit is eigenlijk 10% Clorox bleekmiddel dat kan worden gemaakt door Clorox bleekmiddel te verdunnen met water.  Vul de container met 200 mL Sterilizer.
T25 flaskFalcon353109
T75 flaskFalcon353136
TK6 cellsMilliporeSigma95111735

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  2. OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , OECD Publishing. Paris. (2016).
  3. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
  4. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  5. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  6. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
  7. Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
  8. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  9. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
  10. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  11. Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  12. Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
  13. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
  14. Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
  15. Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20(2021).
  16. Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324(2019).
  17. Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
  18. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  19. Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Micronucleus AssayImaging Flow CytometryArtificial IntelligenceConvolutional Neural NetworkGenetic ToxicityAutomated Image AnalysisDeep Learning ModelCell Morphology ClassificationGenotoxicity ScreeningMononucleated Cells

Gerelateerde artikelen