Method Article

Automatisering van de micronucleustest met behulp van beeldvorming, flowcytometrie en kunstmatige intelligentie

DOI:

10.3791/64549

⸱

January 27th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micronucleus (MN) assay is een gevestigde test voor het kwantificeren van DNA-schade. Het scoren van de test met behulp van conventionele technieken zoals handmatige microscopie of op functies gebaseerde beeldanalyse is echter bewerkelijk en uitdagend. Dit artikel beschrijft de methodologie om een kunstmatig intelligentiemodel te ontwikkelen om de MN-test te scoren met behulp van imaging flow cytometriegegevens.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micronucleus (MN) assay wordt wereldwijd gebruikt door regelgevende instanties om chemicaliën te evalueren op genetische toxiciteit. De test kan op twee manieren worden uitgevoerd: door MN te scoren in eenmaal verdeelde, cytokinese-geblokkeerde binucleated cellen of volledig gedeelde mononucleated cellen. Historisch gezien is lichtmicroscopie de gouden standaardmethode geweest om de test te scoren, maar het is bewerkelijk en subjectief. Flowcytometrie is de afgelopen jaren gebruikt om de test te scoren, maar wordt beperkt door het onvermogen om belangrijke aspecten van cellulaire beelden visueel te bevestigen. Imaging flow cytometry (IFC) combineert high-throughput beeldopname en geautomatiseerde beeldanalyse en is met succes toegepast om snel beelden te verzamelen van en alle belangrijke gebeurtenissen in de MN-test te scoren. Onlangs is aangetoond dat kunstmatige intelligentie (AI) -methoden op basis van convolutionele neurale netwerken kunnen worden gebruikt om MN-testgegevens te scoren die door IFC zijn verkregen. Dit artikel beschrijft alle stappen om AI-software te gebruiken om een deep learning-model te maken om alle belangrijke gebeurtenissen te scoren en om dit model toe te passen om automatisch aanvullende gegevens te scoren. De resultaten van het AI deep learning-model zijn goed te vergelijken met handmatige microscopie, waardoor een volledig geautomatiseerde score van de MN-test mogelijk is door IFC en AI te combineren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De micronucleus (MN) assay is fundamenteel in de genetische toxicologie om DNA-schade te evalueren bij de ontwikkeling van cosmetica, farmaceutische producten en chemicaliën voor menselijk gebruik 1,2,3,4. Micronuclei worden gevormd uit hele chromosomen of chromosoomfragmenten die na deling niet in de kern worden opgenomen en condenseren in kleine, cirkelvormige lichamen die gescheiden zijn van de kern. MN kan dus worden gebruikt als een eindpunt om DNA-schade te kwantificeren in genotoxiciteitstests1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Data-acquisitie met behulp van imaging flow cytometrie

OPMERKING: Raadpleeg Rodrigues et al.16 met de volgende wijzigingen, waarbij wordt opgemerkt dat de acquisitieregio's die IFC gebruiken mogelijk moeten worden gewijzigd voor optimale beeldvastlegging:

  1. Voor de niet-Cyt-B-methode voert u een celtelling uit met behulp van een in de handel verkrijgbare cellenteller volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) op elke cultuur onmiddellijk vóór de kweek en onmiddellijk na de herstelperiode.
  2. Als u monsters uitvoert op een flowcytometer met één came....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont de workflow voor het gebruik van de AI-software om een model te maken voor de MN-test. De gebruiker laadt de gewenste .daf-bestanden in de AI-software en wijst vervolgens objecten toe aan de ground truth-modelklassen met behulp van de AI-ondersteunde cluster (figuur 2) en predict (figuur 3) tagging-algoritmen. Zodra alle ground truth-modelklassen zijn gevuld met voldoende objecten, kan het model worden getraind met be.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van deep learning-algoritmen om de scoring van de MN-test te automatiseren. Verschillende recente publicaties hebben aangetoond dat intuïtieve, interactieve tools het mogelijk maken om deep learning-modellen te maken om beeldgegevens te analyseren zonder de noodzaak van diepgaande computationele kennis18,19. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven met behulp van een softwarepakket met gebruikersinterface, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn in dienst van Luminex Corporation, een DiaSorin Company, de fabrikant van de ImageStream imaging flow cytometer en de Amnis AI-software die in dit werk wordt gebruikt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeFalcon352096
Cleanser - Coulter Clenz Beckman Coulter8546931Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
ColchicineMilliporeSigma64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter MilliporeSigmaCLS4307690.22 µm filter, 500 mL bottle
Cytochalasin BMilliporeSigma14930-96-25 mg bottle
Debubbler - 70% IsopropanolMilliporeSigma1.3704Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)MilliporeSigma67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra PurePolysciences, Inc.04018This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse Cell AnalyzerLuminex0500-3115A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used.
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/mL solution
MannitolMilliporeSigma69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex, a DiaSorin company100220A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used.
MIFC analysis software - IDEASLuminex, a DiaSorin company100220"Image analysis sofware"
The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRELuminex, a DiaSorin company100220"Image acquisition software"
This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AI softwareLuminex, a DiaSorin company100221"AI software"
This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data
Mitomycin CMilliporeSigma50-07-7
NEAA Mixture 100xLonza BioWhittaker13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100XGibco15070063
Potassium Chloride (KCl)MilliporeSigmaP9541
Rinse - Ultrapure water or deionized waterNANAUse any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1xHyCloneSH30027.01
Sheath - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BThis is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x  Ca++MG++ free.  Fill container with 900 mL of Sheath.
Sterile waterHyCloneSH30529.01
Sterilizer - 0.4%–0.7% HypochloriteVWRJT9416-1This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
T25 flaskFalcon353109
T75 flaskFalcon353136
TK6 cellsMilliporeSigma95111735

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  2. OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micronucleus AssayImaging Flow CytometryArtificial IntelligenceConvolutional Neural NetworkGenetic ToxicityAutomated Image AnalysisDeep Learning ModelCell Morphology ClassificationGenotoxicity ScreeningMononucleated Cells

Related Articles