Immunolabeling van abnormaal prioneiwit met behulp van immunohistochemieprotocollen vereist specifieke monster- en anti-PrP-antilichaamvoorbereidingsmethoden. Het huidige protocol beschrijft de belangrijkste stappen in epitoopontmaskering om te zorgen voor een goede PrP-immunolabeling en om niet-specifieke achtergrondkleuring te minimaliseren. Ook houdt deze benadering rekening met bioveiligheidsmaatregelen bij het uitvoeren van immunohistochemische studies met de prion-geïnfecteerde weefsels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van abnormaal prioneiwit door immunohistochemie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Abnormale prioneiwitten (PrPSc) zijn de ziekte-geassocieerde isovorm van cellulair prioneiwit en diagnostische markers van overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). Deze neurodegeneratieve ziekten treffen mensen en verschillende diersoorten en omvatten scrapie, zoönotische boviene spongiforme encefalopathie (BSE), chronische verspillingsziekte van hertachtigen (CWD) en de nieuw geïdentificeerde kameel prionziekte (CPD). De diagnose van TSE's is gebaseerd op immunodetectie van PrPSc door toepassing van zowel immunohistochemie (IHC) als westerse immunoblotmethoden (WB) op encefalonweefsels, namelijk de hersenstam (obex-niveau). IHC is een veelgebruikte methode die primaire antilichamen (monoklonaal of polyklonaal) gebruikt tegen antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. De antilichaam-antigeenbinding kan worden gevisualiseerd door een kleurreactie die gelokaliseerd blijft in het gebied van het weefsel of de cel waar het antilichaam op gericht was. Als zodanig worden bij prionziekten, net als in andere onderzoeksgebieden, de immunohistochemische technieken niet alleen gebruikt voor diagnostische doeleinden, maar ook in pathogenesestudies. Dergelijke studies omvatten het detecteren van de PrPSc-patronen en -typen van de eerder beschreven patronen om de nieuwe prionstammen te identificeren. Aangezien BSE mensen kan infecteren, wordt aanbevolen dat faciliteiten en/of praktijken van bioveiligheidslaboratoria niveau 3 (BSL-3) worden gebruikt voor het hanteren van monsters van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen die in de TSE-bewaking zijn opgenomen. Daarnaast worden containment en prion-dedicated apparatuur aanbevolen, waar mogelijk, om verontreiniging te beperken. De PrPSc IHC-procedure bestaat uit een mierenzuur epitoop-deasking stap die ook fungeert als een prion-inactivatiemaatregel, omdat formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels die in deze techniek worden gebruikt, besmettelijk blijven. Bij het interpreteren van de resultaten moet ervoor worden gezorgd dat niet-specifieke immunolabeling wordt onderscheiden van doeletikettering. Voor dit doel is het belangrijk om artefacten van immunolabeling te herkennen die zijn verkregen in bekende TSE-negatieve controledieren om die te onderscheiden van specifieke PrP Sc-immunolabelingtypen, die kunnen variëren tussen TSE-stammen, gastheersoorten en prnp-genotype, verder hierin beschreven.
Inleiding
Volgens de prionhypothese is de abnormale isovorm (PrPSc) de primaire of enige component van het infectieuze agens in overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). Bevestiging voor de diagnose van TSE is gebaseerd op immunodetectie van PrPSc door toepassing van immunohistochemie (IHC) protocollen en/of westerse immunoblotmethoden (WB) van encefalonweefsels1.
IHC is een methode waarbij monoklonale of, in sommige gevallen, polyklonale antilichamen (als primaire antilichamen) worden gebruikt als eerste stap in immunostaining van specifiek gerichte antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. Elke effectieve primaire antilichaam-antigeenbinding wordt vervolgens gevisualiseerd met behulp van secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de primaire antilichamen. Deze secundaire antilichamen worden geconjugeerd aan enzymen, zoals mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP). Visualisatie wordt vervolgens bereikt door een substraat aan deze enzymen toe te voegen, waardoor onoplosbare kleurproducten worden geproduceerd die zijn gelokaliseerd in gebieden waar de primaire antilichamen zijn gebonden aan de beoogde antigenen. Verbeterde visualisatie kan worden bereikt door counterstaining, waarbij een kleurstof wordt gebruikt om een contrast te creëren tussen immunogelabeld en niet-immunogelabeld weefsel2.
Met IHC met behulp van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefsels (FFPE), kan formalinefixatie de effectiviteit van primaire antilichamen tenietdoen als gevolg van cross-linking door formaldehyde en verwarming en uitdroging tijdens paraffine-inbedding. Deze veranderen de conformatie van eiwitten, vernietigen, denatureren of maskeren de epitopen, waardoor hun detectie wordt verminderd of ingetrokken3. Als zodanig vereist dit antigeen retrieval (AR). De AR-technieken verstoren formaldehyde-gerelateerde chemische groep cross-linking in de antigene moleculen, waardoor de oorspronkelijke antigeen-eiwitconformatie wordt hersteld of ontmaskerd. Dit resulteert in het herstellen van de antilichaam-antigeen (epitoop) affiniteit voor immunolabeling. De uiteindelijke werkzaamheid van AR hangt af van de kwaliteiten van het beoogde antigeen en/of het primaire antilichaam2.
Heat-induced antigen (epitope) retrieval (HIER) is een procedure van AR3 en wordt routinematig gebruikt voor PrPSc IHC-detectie, zoals hierin beschreven. IHC is essentieel voor de diagnose en wordt gebruikt in onderzoekslaboratoria om de weefselverdeling van een pathologie-geassocieerd antigeen te bepalen. Het wordt veel gebruikt bij het diagnosticeren en onderzoeken van kanker, neurowetenschappen en infectieziekten4, onder anderen. Voor TSE's speelt IHC een belangrijke rol in diagnose en onderzoek voor het bevestigen en onderzoeken van PrPSc-distributie in natuurlijke gastheren en experimentele modellen. IHC draagt bij aan prionpathogenesestudies en de analyse van PrP Sc-depositietypen en -patronen, namelijk in neurale weefsels5, om afwijkingen van routinematig beschreven infecties te detecteren en vermeende nieuwe prionstammen te identificeren.
Omdat prionen van boviene spongiforme encefalopathie (BSE) de mens kunnen infecteren, kunnen bepaalde laboratoriumprotocollen die betrokken zijn bij het werk met BSE het gebruik van BSL-3-faciliteiten en -praktijken vereisen6. Deze omvatten het gebruik van een verzegelde secundaire container om potentiële met BSE geïnfecteerde weefselmonsters binnen het instituut en het laboratorium te vervoeren. Het omvat ook het aanwijzen van inperkingsgebieden en prionspecifieke apparatuur voor BSE-onderzoek en -analyse, waar mogelijk. Dit wordt gedaan om besmetting buiten het werkgebied te voorkomen en een besloten ruimte te bieden, omdat decontaminatieprocedures noodzakelijk worden.
Dienovereenkomstig volgt het Laboratorium voor Pathologie van INIAV de aanbevolen bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) faciliteiten en praktijken6 om potentiële prion-geïnfecteerde monsters van weefsels van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen in verband met de TSE-surveillance te beheren.
Formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels opgenomen in TSE diagnostische of onderzoeksprocedures, vooral in het centrale zenuwstelsel, kunnen potentieel besmettelijk zijn. Daarom moeten deze vaste weefsels worden behandeld met mierenzuur om de infectiviteit van prionen, indien aanwezig, voorafgaand aan weefselverwerking te verminderen. Dit wordt uitgevoerd door vaste, bijgesneden weefsels (ongeveer 2-4 mm dikte) in een verwerkingscassette te plaatsen. De cassette wordt vervolgens ondergedompeld in 98% mierenzuur (gedurende 1 uur). Na onderdompeling worden de cassettes met weefsels gedurende 30 minuten in stromend leidingwater gewassen en teruggebracht naar het fixatief voor verdere verwerking. Als weefselsecties niet vóór de verwerking worden behandeld, moeten postmicrotomische weefselsecties gedurende ten minste 5 minuten vóór histologische kleuring in onverdund mierenzuur worden ondergedompeld7. Het IHC-protocol voor PrPSc bevat een routinematige mierenzuur-epitoop-ontmaskeringsstap, die ook dient om prionen7 te inactiveren. Na deze prioninactiveringsstappen kunnen de resulterende vaste weefsels vervolgens worden verwerkt bij BSL-2 met behulp van standaard BSL-2-praktijken.
De minimale weefselbemonsteringsvereiste voor TSE-diagnose bij elk dier dat onder TSE-surveillance valt, is het verzamelen van de hersenstam (op obex-niveau). Bovendien wordt voor het opsporen van atypische BSE en scrapie geadviseerd om ook een deel van het cerebellum te verzamelen 1,8. Voor CWD-diagnose moeten zowel hersenstam (obex) als retrofaryngeale lymfeklieren worden getest, omdat PrP Sc kan worden gedetecteerd in lymfoïde weefsels zonder detecteerbare PrPSc in obex9, beoordeeld door Machado et al.10.
Het obex-gedeelte van de hersenstam omvat diagnostische TSE-doellocaties, namelijk de dorsale vagale kern (DVN), solitaire tractuskern (STN) en spinale tractuskern van de trigeminuszenuw (V). Deze gebieden vertonen consequent bilaterale PrP Sc-accumulatie, zelfs in de vroege stadia van BSE en klassieke scrapie. In klinische gevallen van gevorderde TSE vertonen alle grijze stofgebieden in de hersenstam een wijdverspreide PrPSc-distributie 11.
Voordat de hersenmonsters worden gesegmenteerd en verwerkt, worden ze geëvalueerd (figuur 1) om het niveau van autolyse en de aanwezigheid van weefselschade vast te stellen die mogelijk de geschiktheid van het monster voor IHC-gebaseerde bevestigende diagnose8 in gevaar brengt. Om de integriteit van de voorbereidende protocollen en de analyseresultaten te valideren, worden de positieve en negatieve weefselmonsters van TSE opgenomen als controles in combinatie met de bereiding van weefsels uit testgevallen in elke test.
Figuur 1: De PrPSc IHC procedure. Representatie van de stapsgewijze volgorde van de PrPSc IHC-procedure van deparaffinisatie van weefselsecties tot uiteindelijke immunostaining en detectie (FFPE - Formaline-fixed paraffine-embedded; Mab - monoklonaal antilichaam; DAB - 3,3' diaminobenzidine). Deze figuur is gemaakt in BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De hierin beschreven IHC-procedure is een onderdeel van het onderzoeksproject FAIRJ-CT98-7021, "De oprichting van een Europees netwerk voor de surveillance van TSE's van herkauwers en de standaardisatie en harmonisatie van het proces en de criteria voor de identificatie van verdachte gevallen". Het volgt de diagnostische criteria die zijn gedefinieerd door de Wereldorganisatie voor diergezondheid, WOAH (voorheen het Office International des Épizooties, OIE)1 en het Europees referentielaboratorium voor dierlijke TSE's 8,11. De beschreven IHC-procedure is sinds 2008 ook geaccrediteerd volgens NPISOIEC17025 (algemene vereisten voor de competentie van test- en kalibratielaboratoria). Een dergelijke accreditatie impliceert een kwalitatief hoogstaand managementsysteem met standaard operationele procedures, gekwalificeerd personeel, nauwkeurig gekalibreerde apparatuur, strenge controle van gegevens en reagentia, deelname aan interlaboratoriumvaardigheidstests, niet-conform werk en risicobeoordeling om de effectiviteit van het managementsysteem te vergroten, betere resultaten te behalen en laboratoriumrisico's te voorkomen. Prion-geïnfecteerde weefselcontroles met BSE, klassieke scrapie, atypische scrapie en CWD werden verzameld (formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed, FFPE) uit verschillende bronnen. De runder- en schapensecties zijn afkomstig van de gevallen die zijn gediagnosticeerd in het kader van een TSE-bewakingsprogramma voor dieren. De CWD-secties zijn afkomstig van de controlemonsters die in 2003 door professor Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) zijn verstrekt en van de CWD Proficiency testing 2008 georganiseerd door het European Reference Laboratory for TSEs (APHA, Weybridge).
1. Weefseldoorsnede en diavoorbereiding
- Snijd secties van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels met een dikte van 3-5 μm met behulp van een microtoom.
- Laat delen drijven op gezuiverd water met een temperatuur van ongeveer 10 °C onder het smeltpunt van de gebruikte paraffine. Til de secties uit het water op speciaal behandelde microscoopglaasjes (zie materiaaltabel). Laat het water goed weglopen van de glijbanen.
- Incubeer de dia's een nacht bij 50 °C om de schuifhechting van weefsels te verbeteren.
OPMERKING: Het verdient de voorkeur om vers gesneden weefsels voor IHC-protocollen voor te bereiden, hoewel TSE-positieve en negatieve controlesecties van tevoren kunnen worden voorbereid en opgeslagen. Stap 2 tot en met 4 moeten worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.
2. Deparaffinisatie en rehydratatie
- Plaats de dia's met de weefselsecties in een roestvrijstalen beitsmand (zie materiaaltabel). Dompel de mand gedurende 3 minuten onder in een xyleen bad (roestvrijstalen vlekcontainer), verwijder en dompel opnieuw onder.
- Verwijder xyleen en rehydrateer secties door ze gedurende 3 minuten onder te dompelen in een absoluut ethanolbad. Verwijder en dompel opnieuw onder.
- Droog de secties aan de lucht en plaats ze gedurende 1 minuut in een 90% ethanolbad. Breng nog een minuut over naar een 70% ethanolbad, gevolgd door een laatste overbrenging naar een 50% ethanolbad gedurende 1 minuut. Voor elke behandeling met ethanolbad roert u de schuifkorf twee keer voorzichtig en laat u de mand leeglopen voordat u de volgende keer overbrengt.
3. Epitoop ophalen
- Dompel de weefselsecties voorzichtig onder in 98% mierenzuur bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Spoel de secties gedurende 5 minuten in leidingwater, gevolgd door twee keer spoelen in gedestilleerd water.
LET OP: Mierenzuur is zeer corrosief. Het dragen van een veiligheidsbril en handschoenen is verplicht. - Voer heat-induced antigen retrieval (HIER) uit volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd door gehydrateerd autoclaveren bij 121 °C gedurende 30 minuten in een specifieke drukkamer (zie materiaaltabel).- Verwarm de citraatbuffer (10 mM, pH 6.1, zie materiaaltabel) gedurende ongeveer 20 minuten voor op 98 °C in een roestvrijstalen kleuringscontainer die in de drukkamer is geplaatst en is gevuld met 500 ml gedestilleerd water.
OPMERKING: Voor de huidige studie was het programma Set Point 1 (SP1) voor de specifieke gebruikte apparatuur. - Nadat het alarm aangeeft dat de apparatuur de geprogrammeerde tijd en temperatuur heeft bereikt, dompelt u de mand onder met dia's en start u het programma naar Punt 2 (121 ° C gedurende 30 minuten). Plaats voor kwaliteitscontroledoeleinden een gedeelte van zelfklevende autoclaafindicatortape op de mand om de temperatuur en druk te controleren en noteer de begin- en einddruk van dit programma.
- Als het aantal te absorberen dia's de capaciteit van de mand niet bereikt, gebruik dan schone, lege dia's om lege posities in te nemen. Nadat het programma is beëindigd, laat u de passieve terugkeer van de kamer naar omgevingsdruk (ten minste 30 minuten).
OPMERKING: Langere duur kan niet-specifieke achtergrondvlekken verminderen. - Breng de schuifmand voorzichtig over in een roestvrijstalen beitscontainer gevuld met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- Verwarm de citraatbuffer (10 mM, pH 6.1, zie materiaaltabel) gedurende ongeveer 20 minuten voor op 98 °C in een roestvrijstalen kleuringscontainer die in de drukkamer is geplaatst en is gevuld met 500 ml gedestilleerd water.
4. Inactivatie van endogene peroxidase
- Dompel de schuifkorf met de monstersecties gedurende 30 minuten onder in een bad van 3% waterstofperoxide (H 2 O2) in methanol. Spoel de secties af onder stromend water (5 min). Giet af en dompel de secties onder in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voor nog eens 5 minuten.
5. Immunodetectie
OPMERKING: Voor deze studie werd immunodetectie uitgevoerd met behulp van het capillaire spleetformaat7 met behulp van een in de handel verkrijgbaar schuifclipassemblagesysteem (zie materiaaltabel). Andere immunohistochemische schuifsystemen zijn ook van toepassing.
- Plaats elke dia op een in de handel verkrijgbare afdekplaathouder (zie materiaaltabel) die vooraf is bevochtigd met TBS, waarbij bellen worden vermeden, waarbij de weefselzijde naar de houder is gericht en de schuifranden samenvallen met de twee onderste punten van de houder.
- Houd de schuifhouder tussen de duim en de wijsvinger, met één vinger bovenop de monsterplaat en de andere aan de onderkant van de houder. Plaats vervolgens de assemblage in de galerij van het systeem.
- Om ervoor te zorgen dat de set goed is gemonteerd, vult u de put tussen de monsterplaat en de houder met TBS, die niet onmiddellijk mag overlopen. Zorg er vanaf dit punt voor dat ongeveer 80 μL TBS tussen de houder en de dia moet worden gehouden. Laat de secties niet drogen.
- Eenmaal in het systeem, om achtergrondkleuring voorafgaand aan de behandeling met primair antilichaam (anti-PrP, zie tabel met materialen) te verminderen, incubeert u de monsterglaasjes vooraf met 20% normaal serum van dezelfde soort als de secundaire antilichaamgastheer die wordt gebruikt voor immunostaining (in dit geval paardenserum) gedurende 30 minuten in TBS.
- Ontdooi het aantal aliquots antilichamen dat moet worden gebruikt volgens de onderzochte diersoort, het aantal te onderzoeken monstersecties en de hoeveelheid werkverdunning.
OPMERKING: Gebruik voor de beste resultaten 10% normaal serum van dezelfde soort als de bron van het secundaire antilichaam en de primaire antilichaamoplossingen. Indien mogelijk, voor de beste resultaten, moet de gastheerbron van het normale serum en secundaire antilichaam van dezelfde soort zijn. - Breng zonder de secties te wassen de primaire antilichaamoplossing rechtstreeks (200 μL) aan in elk putje van de diahouderset en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Vul voor het wassen de putjes van de schuifhoudersets met TBS en wacht 5 minuten. Herhaal dit twee keer.
- Verdun het gebiotinyleerde secundaire antilichaam (monoklonaal anti-murine Horse Ab, zie Tabel van Materialen) bij 1/200 in TBS met 10% paardenserum. Bereid het benodigde volume voor, afhankelijk van het aantal te behandelen secties.
- Breng de secundaire antilichaamoplossing (200 μL) aan op elk putje van de diahouderset. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen zoals beschreven in stap 5.5.
- Voor incubatie met avidine-biotinecomplex peroxidase (ABC/HRP-complex, zie materiaaltabel), bereidt u het reagens 30 minuten voor gebruik voor. Breng de ABC/HRP complexe oplossing (200 μL) aan in elke put van de schuifplaathouderset. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen zoals beschreven in stap 5.5.
6. Ontwikkeling met DAB-chromogeen
LET OP: DAB is een potentieel carcinogeen. Als gevolg hiervan is passende zorg nodig tijdens het werken met dit reagens, inclusief oogbescherming, laboratoriumjassen, handschoenen en goede laboratoriumprocedures. Verwijder de lokale regelgeving.
- Verdun chromogeen volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) onmiddellijk voor gebruik. Breng de chromogeenoplossing (400 μL) aan op elk putje van de schuifplaatset.
- Incubeer gedurende maximaal 30 minuten bij kamertemperatuur. In PrPSc-positieve secties is een incubatietijd van 10 minuten meestal voldoende.
- Verwijder de resterende chromogeenoplossing door de glaasjes in gedestilleerd water te wassen. Verwijder de dia's van de afdekplaathouders en plaats ze in een plastic container met gedestilleerd water.
7. Hematoxyline tegenkleuring
- Dompel de roestvrijstalen beitsmand met de secties gedurende 1 minuut onder in het bad met hematoxyline-oplossing (zie materiaaltabel). Spoel zachtjes af in koud stromend water gedurende 10 minuten of lauw water gedurende 5 minuten.
- Droog de secties uit door ze gedurende 1 minuut in 90% ethanol te plaatsen, gevolgd door één bad in absolute ethanol gedurende 1 min. Plaats vervolgens de dia's gedurende 1 minuut in een xyleenbad.
- Monteer de secties met een in de handel verkrijgbaar montagemedium (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Deze stappen worden uitgevoerd in een chemische zuurkast bij kamertemperatuur (19 °C-24 °C). Deze procedure omvat een testverslag (aanvullend dossier 1) voor het registreren van de voltooiing van alle stappen, de gebruikte apparatuur en de laborant. Bovendien is een werkblad (aanvullend dossier 2) ontworpen om eenvoudig de volumes van de reagentia te bepalen op basis van het aantal secties in elke test, de werkverdunningen en de instructies van de fabrikant, evenals om de kamertemperatuur, apparatuur en reagensbatches te registreren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Aangezien niet-specifieke doelimmunolabeling mogelijk is, is het belangrijk om het niveau van niet-specifieke immunolabeling bij bekende TSE-negatieve controledieren vast te stellen. Dit is een belangrijke stap om specifieke PrPSc immunolabeling7 goed te interpreteren (figuur 2). Non-target labeling door anti-PrP-antilichamen is waargenomen als discrete intraneuronale fijnstofkleuring (duidelijker in de hypoglossale kern en accessoire cuneaatkern)...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
TSE's zijn potentiële zoönotische ziekten. Na het opduiken van BSE in 1986 in het Verenigd Koninkrijk werd Portugal een van de lidstaten van de Europese Unie met een hogere incidentie van deze ziekte14,15. Om deze ziekte onder controle te houden, zijn andere TSE's die zijn opgedoken (klassieke en atypische scrapie, BSE-varianten en momenteel de bewaking van chronische verspillingsziekte bij hertachtigen), bewakingsmechanismen ontwikkeld door het directoraat-gener...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit artikel werd gefinancierd door het project POCI-01-0145-FEDER-029947 "Chronic wasting disease risk assessment in Portugal" ondersteund door FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Ook ontvingen de auteurs van de onderzoekseenheid CECAV financiering van de FCT, in het kader van het project UIDB / CVT / 0772 / 2020.We bedanken Bruce C. Campbell, Research Director (gepensioneerd), Western Regional Research Center, USDA, voor zijn hulp.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Onbetiteld |
| Verdund 90%, 70% en 50% in gedistilleerd water | |||
| Avidin-biotine complex en peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase | Vector Laboratories | PK-6100 | Bereid en meng voorzichtig 30 min voor gebruik volgens kitinstructies. Niet mengen na staan. |
| Gebiotinyleerd secundair antilichaam (Paard anti-muis IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Verdun bij 1/200 in TBS met 10% normaal paardenserum. Bereid het vereiste volume voor afhankelijk van het aantal secties. |
| Chromogeen Diaminobenzidine- DAB, substraatkit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Bereid voor gebruik volgens kitinstructies. Gebruik 400 µL oplossing per sectie. |
| DakoCytomation Pascal drukkamer | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylinen: | |||
| Hematoxyline | Merck | 115938 | Los 2 g hematoxyline op in 100 mL absolute ethanol. Voeg 100 mL gedistilleerd water, 10 mL glazuur azijnzuur en 15 g kaliumaluin toe met constant roeren. Voeg 100 mL glycerine toe. Het natuurlijke oxidatieproces duurt 2 maanden, voor gebruik. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glazuur azijnzuur | Merck | 101830 | |
| Kaliumaluin | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerine | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogene Peroxidase Blok oplossing (3% concentratie H2O2): | 40 mL Waterstofperoxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Bereid voor gebruik | ||
| Waterstofperoxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Mierenzuur 98% | Merck | 1.00264.1000 | Onverdund |
| Microtoom | Shandon-AS325 | Microtoom | Shandon-AS325 |
| Montagemedium Entellan | Merck | 107960 | Klaar voor gebruik. |
| Normaal serum (20% ) blokoplossing in TBS: Paard normaal serum | Gibco | 16050-122 | Bereid het eindvolume voor volgens het aantal secties in de test (200 µL oplossing per sectie). |
| Primair antilichaam anti-PrP Muis MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Schapen inclusief atypische scrapie, herten, katten. Niet geschikt voor runderen. Afhankelijk van het aantal secties in de test (200 µL oplossing per sectie) en antilichaamverdunning, bereid het eindvolume in TBS aangevuld met 10% van normaal serum van de soort waarin het secundaire antilichaam is opgewekt (paard normaal serum) Gewone antilichaamdunning: MAb 2G11 1/100 maar de werkdunning moet in elke nieuwe batch worden vastgesteld om de concentratie te krijgen die de sterkste markering geeft met de laagste achtergrond. Voor opslag bevries aliquootvolumes van minimaal 10 μL in steriele microbuisjes. Ontdooi en gebruik een aliquoot tegelijk. |
| Primair antilichaam anti-PrP Muis MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Runderen, niet geschikt voor schapen Gewone antilichaamdunning: 1/200 maar de werkdunning moet ook worden vastgesteld. Bereid als MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM kamer | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining glijrail | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Citraatbufferoplossing (10 mM pH 6.1): | 2,55 g Trinatriumcitraatdihydraat en 0,255 g Citroenzuur in één liter gezuiverd water. Pas de pH van de werkoplossing aan tot 6,1 met behulp van 10 mM citroenzuuroplossing (1,05 g citroenzuur in 500 mL gezuiverd water) Bereid op de testdag. | ||
| Trinatriumcitraatdihydraat | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citroenzuur | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Kleurvat en mand | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscoopglazen | VWR | 631-0108 | |
| Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0,8% NaCI; pH 7,6): | 10xTBS (stockoplossing 0,5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g en NaCl 80 g in 800 mL gezuiverd water. Pas de pH van de stockoplossing aan met behulp van zoutzuur 37% en het eindvolume tot één liter met gezuiverd water (houd 5± 3 °C tot 2 maanden) Verdun TBS-stockoplossing 1/10 op de testdag. | ||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Natriumchloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xyleen | Panreac Applied Chem ITW reagents | 2517 |
Referenties
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and methods of immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry). Journal Pharmacy Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
- Orge, L., et al. Neuropathology of Animal Prion Diseases. Biomolecules. 11 (3), 466(2021).
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al. Identification of H-type BSE in Portugal. Prion. 9 (1), 22-28 (2015).
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F. Atlas of veterinary pathology. Biopathology. Lidel VII. 195 (6), 179-180 (2004).
- Pires, M. A., et al. Immunology protocols, didactic series. Applied Sciences. , 357(2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
