Methodenartikel

Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

DOI:

10.3791/64563

⸱

23 december 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie beschrijft methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, kleuren, labelen en onderzoeken van volledige sferoïden en organoïden onder verschillende microscopen, terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden en sferoïden, driedimensionale groeistructuren in celkweeklaboratoria, worden steeds meer erkend als superieure modellen in vergelijking met tweedimensionale kweekmodellen, omdat ze het menselijk lichaam beter nabootsen en voordelen hebben ten opzichte van dierstudies. Deze studies hebben echter vaak problemen met reproduceerbaarheid en consistentie. Tijdens de lange experimentele processen - met overdrachten van organoïden en sferoïden tussen verschillende celkweekvaten, pipetteren en centrifugeren - worden deze gevoelige en fragiele 3D-groeistructuren vaak beschadigd of verloren. Uiteindelijk worden de resultaten aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. De hier beschreven methoden minimaliseren deze stressvolle stappen en zorgen voor een veilige en consistente omgeving voor organoïden en sferoïden gedurende de hele verwerkingssequentie terwijl ze zich nog in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat bevinden. De onderzoekers kunnen groeien, bevriezen, ontdooien, verwerken, vlekken, labelen en vervolgens de structuur van organoïden of sferoïden onderzoeken onder verschillende hightech-instrumenten, van confocale tot elektronenmicroscopen, met behulp van een enkel multifunctioneel apparaat. Deze technologie verbetert de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en validiteit van de studies, terwijl een stabiele en beschermende omgeving voor de 3D-groeistructuren tijdens de verwerking behouden blijft. Bovendien minimaliseert het elimineren van stressvolle stappen afhandelingsfouten, vermindert het de benodigde tijd en vermindert het het risico op besmetting.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toekomst van celonderzoek en -therapie ligt binnen 3D-celculturen 1,2,3. Organoïde en sferoïde modellen dichten de kloof tussen in vitro experimenten en diermodellen door betere modellen te maken die de ontwikkeling van het menselijk lichaam, fysiologie en ziekten nabootsen 4,5,6,7,8,9. De reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid van deze modellen blijven echter een uitdaging. Bovendien resulteert het hanteren, oogsten, overbrengen en centrifugeren van deze structuren met de huidige technologieën in verlies of beschadiging van de organoïden en sferoïden in veel omstandigheden, wat de resultaten aanzienlijk beïnvloedt.

Ondanks vele protocollen voor histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering en cryopreservatie, is er geen universele benadering met betrekking tot het standaardiseren van experimentele omstandigheden, het hanteren en verwerken van deze delicate structuren zonder ze te verliezen of te beschadigen. De huidige protocollen zijn ook ongelooflijk lang, afwisselend van enkele dagen tot enkele weken, en omvatten complexe procedures met verschillende reagentia 10,11,12,13,14. Bovendien veroorzaken het oogsten, pipetteren, centrifugen en overbrengen van 3D-groeistructuren tussen celkweekvaten en cryovialen veranderingen in de positionering van de structuren en mechanische krachten en beïnvloeden ze uiteindelijk de differentiatie en rijping van de organoïden en sferoïden. Er is gemeld dat weefseltopologie, positionering van de cellen en mechanische krachten een significante invloed hebben op celdifferentiatie en rijping 6,15,16,17.

Daarom is het wenselijk om de huidige conventionele technologieën te verbeteren om organoïden en sferoïden met stabiele kwaliteit te genereren. Een methode/apparaat dat de hierboven beschreven centrifugatie en andere stappen overslaat en het materiaal van het begin tot het einde van de meerdere processen in één veilige omgeving levert, zou gunstig zijn om de meest consistente en betrouwbare gegevens te bereiken. Bovendien zal dit de tijds-, arbeids- en kostenbeperkingen verminderen.

Het hier beschreven multipurpose device (MD) biedt één veilige omgeving voor meerdere processen van organoïden en sferoïden (aanvullende figuur 1). Dit apparaat en aanvullende protocollen elimineren de stappen voor het oogsten, pipetteren, overbrengen en centrifugeren. De organoïden en sferoïden blijven in hun in vitro omgeving tijdens de sequentiële processen. Deze omgeving bestaat voornamelijk uit natuurlijke of synthetische extracellulaire matrixcomponenten, zoals in de handel verkrijgbare hydrogels. Met andere woorden, de hier beschreven methoden maken het mogelijk om een monster van organoïden / sferoïden in zijn geheel te verwerken, te onderzoeken en te invriezen terwijl het nog in een hydrogeldruppel zit.

Het biocompatibele apparaat is bestand tegen temperaturen tussen 60 °C en -160 °C, wat het mogelijk maakt om de organoïden/steroïden in een tank met vloeibare stikstof bij -160 °C te herstellen of om harsblokken voor te bereiden voor elektronenmicroscopie bij 60 °C. De niche in het apparaat is ontworpen om een beperkte ruimte voor 3D-groeistructuren te definiëren en de vorming van sferoïden of organoïden te stimuleren op basis van de vorige studies 18,19,20,21,22,23. Dat deel van het apparaat is transparant en bevat een specifieke kunststof die een hoge optische kwaliteit biedt (brekingsindex: 1,43; abbewaarde: 58; dikte: 7,8 mil [0,0078 in of 198 μm]). Zowel de nis als het omringende 'zijdeel' veroorzaken autofluorescentie. De transparante nis in het midden heeft een 80 mm2-oppervlak, terwijl het zijgedeelte 600 mm2 is. De diepte van de container is 15 mm en de dikte is 1,5 mm. Deze kenmerken, naast de grootte en het ontwerp van het apparaat, maken het mogelijk om waarnemingen te doen onder verschillende soorten hightech microscoop en de monsters voor te bereiden op elektronenmicroscopisch onderzoek (figuur 2). Het sluitsysteem van het apparaat biedt twee posities, een verzegeld in de vriezer en de andere waardoor gasstroom in de incubator mogelijk is. CCK8-proliferatie- en cytotoxiciteitstests tonen vergelijkbare effecten op cellen in vergelijking met de traditionele celkweekschalen (aanvullende figuur 2). Trypan blue exclusion test toont een hoge levensvatbaarheid van cellen (94%) tijdens de celkweek in de MD (figuur 3).

De processen die kunnen worden uitgevoerd voor één monster in het enkele apparaat omvatten (1) kweken, (2) histologische kleuring, (3) immunostaining, inclusief immunohistochemische en immunofluorescentielabeling, (4) invriezen, (5) ontdooien, (6) onderzoeken onder optische microscopen, zoals brightfield,darkfield, fluorescentie, confocale en superresolutie microscopen, (7) coating en onderzoek rechtstreeks onder een scanning elektronenmicroscoop, of (8) voorbereiding op transmissie-elektronenmicroscopie ( Figuur 2).

Er bestaan verschillende methodologieën voor histologische kleuring, immunohistochemische etikettering of fluorescerend labelen van organoïden en sferoïden 10,11,12,13,14,24,25. Het oogsten van hen uit de hydrogel is de eerste en belangrijkste stap van de huidige technologie. Na deze stap maken sommige methoden immuno-labeling met hele mount mogelijk. De geoogste organoïden zijn ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gelabeld voor kleuring en immunostaining in anderen. Het is echter mogelijk dat de secties niet het volledige monster presenteren en slechts beperkte gegevens bevatten met betrekking tot de 3D-architectuur van de structuur. Bovendien zijn schade aan deze 3D-structuren en verlies van antigeniciteit bekende bijwerkingen van deze technologieën.

De aanvullende nieuwe protocollen voor microscopisch onderzoek in dit artikel maken een analyse mogelijk van monsters van de hele montering die nog in een hydrogel zitten. De hier beschreven protocollen omvatten twee nieuw ontwikkelde formuleringen: oplossing voor immunohistochemie (S-IHC) en oplossing voor immunofluorescentie-etikettering (S-IF). De methoden met deze oplossingen stellen onderzoekers in staat om nauwkeurigere gegevens te verkrijgen, omdat er geen schadelijke effecten zijn van traditionele workflows, zoals centrifuging, pipetteren en overbrengen van de delicate structuren. Het hier beschreven protocol elimineert ook de noodzaak voor het oogsten, blokkeren, opruimen en ophalen van antigeen en verkort de hele procedure tot 6-8 uur. Bovendien maakt de methodologie het mogelijk om tegelijkertijd één tot drie antilichamen toe te voegen aan dezelfde S-IF. Daarom is het mogelijk om de resultaten op dezelfde dag te krijgen, zelfs na de meerdere etiketteringsexperimenten, wat een ander voordeel is van het hier beschreven protocol; traditionele immunofluorescentie-etiketteringsprotocollen met hele mount duren meestal tussen de 3 dagen en enkele weken 10,11,12,13,14.

Paraffine-inbedding, een andere schadelijke stap die de antigeniciteit vermindert, wordt ook weggelaten. De 3D-structuur blijft in zijn in vitro omgeving van het begin tot het einde van het microscopisch onderzoek. Omdat de 3D-structuur in zijn groeiomstandigheden blijft, bootsen de eiwitexpressie- en lokalisatiegegevens in vivo omstandigheden beter na. Er worden nauwkeurigere resultaten verwacht, omdat de methodologie de stappen elimineert die de antigeenexpressie van het monster beïnvloeden. Tabel 1 en tabel 2 laten zien hoe deze nieuwe protocollen stappen elimineren, tijd en arbeid in het laboratorium besparen en kosten en afvalproducten verlagen in vergelijking met traditionele workflows.

Naast de cruciale stappen die hierboven zijn beschreven, is een ander probleem het bieden van een cryopreservatiemedium en een methode om de 3D-structuur van het monster te behouden met hogere levensvatbaarheidssnelhedenvan cellen 26,27,28,29,30,31. Cryopreservatie is essentieel voor het creëren van een stabiel modelsysteem en het mogelijk maken van de biobanking van organoïden en sferoïden32,33. Biobanking van de hele originele 3D-structuur zal een meer getrouwe recapitulatie van de natuurlijke gezondheidstoestand of ziekte mogelijk maken. De belangrijkste overwegingen zijn het gemak en de betrouwbaarheid van cryopreservatie en het ontdooien van organoïden / sferoïden. Post-dooi organoïde herstel is zeer laag in de meeste huidige technologieën, vaak minder dan 50%. Recente studies hebben echter veelbelovende resultaten laten zien met verbeterde overlevingskansenvan 26,27,28,29. Lee et al. toonden aan dat 78% van de sferoïde cellen overleefde na cryopreservatie toen ze de oplossing van de Universiteit van Wisconsin gebruikten die 15% DMSO28 bevatte. De celoverlevingsratio steeg tot 83% in de studie van Arai et al.29. De resultaten na cryopreservatie worden echter aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. Bovendien zijn serumvrije reagentia vereist voor goede productiepraktijken in farmaceutische en diagnostische omgevingen. Traditionele workflows gebruiken een medium met foetaal runderserum (FBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) voor de langzaam invriezende methode, die beide geassocieerd zijn met handicaps. FBS is een dierlijk product en kan batchvariaties hebben. DMSO is een zeer succesvol cryoprotectant, maar langdurige blootstelling, vooral tijdens het ontdooien, kan cytotoxische effecten veroorzaken30,31.

Dit artikel beschrijft ook de bevriezings-/ontdooimethode van hele organoïden of sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten. In het onderzoek worden twee formules voor het invriezen van organoïden en sferoïden gebruikt: (1) 10% DMSO met traditionele vriesoplossing (FS) en (2) een serum- en DMSO-vrij cryopreservatiemedium. Dit cryopreservatiemedium bevat extracellulaire matrixcomponenten, die verschillen van de huidige formules. De extracellulaire matrix bestaat uit twee hoofdklassen van macromoleculen, proteoglycanen en vezelige eiwitten, die essentieel zijn voor fysieke steigers voor de cellulaire bestanddelen, maar ook processen initiëren die nodig zijn voor weefselmorfogenese, differentiatie en homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Collageen biedt treksterkte, reguleert de celadhesie, ondersteunt chemotaxis en migratie en directe weefselontwikkeling37. Bovendien bieden elastinevezels terugslag naar weefsels die herhaalde rek ondergaan38. Een derde vezelig eiwit, fibronectine, stuurt de organisatie van de interstitiële extracellulaire matrix en heeft een cruciale rol bij het bemiddelen van celaanhechting en functioneert als een extracellulaire mechano-regulator39. Du et al. hebben het cryoprotectieve effect van kippencollageenhydrolysaat op het natuurlijke actomyosinemodelsysteem41 aangetoond. Hun resultaten suggereren dat collageenhydrolysaat de groei van ijskristallen kan remmen, eiwitbevriezing en oxidatie kan verminderen, vergelijkbaar met commerciële cryoprotectanten, en een betere gelstructuur kan bieden na vries-dooicycli. Daarom biedt het toevoegen van extracellulaire matrixcomponenten aan de cryopreservatiemedia een veiligere en beschermende omgeving voor het monster en ondersteunt het de levende structuren om te genezen na bevriezing-ontdooien.

Bovendien beschrijft de huidige studie een eenvoudig protocol om cytoplasmatische membranen en kernen van levende organoïden en sferoïden te labelen terwijl ze zich nog in de hydrogel bevinden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kweken van organoïden en sferoïden

  1. Leg de hydrogel een nacht op ijs (in een koelkast of een koude ruimte) om te ontdooien.
  2. Plaats het in de handel verkrijgbare multifunctionele apparaat (MD; zie materiaaltabel) 1 dag voor het experiment (37 °C, 5% CO2) in de incubator om op te warmen.
  3. Plaats steriele pipetpunten met brede uiteinden in de koelkast bij 4 °C.
    OPMERKING: Stappen 1.1-1.3 moeten worden uitgevoerd op dag 0 en stappen 1.4-1.11 moeten worden uitgevoerd op dag 1.
  4. Plaats de hydrogel op ijs in een laminaire stromingskap gedurende 15 minuten.
    1. Optioneel: Verdun de hydrogel in koud celkweekmedium volgens de aanbeveling van de fabrikant.
  5. Plaats de buis met een pellet hepG2-cellen (commercieel verkregen hepatocellulair carcinoom cellijn; zie materiaaltabel) op ijs.
  6. Plaat 30-35 μL van 100% hydrogel in de nis van het voorverwarmde apparaat om een geldruppel te creëren.
  7. Plaats 10.000 HepG2-cellen in het midden van de bovenkant van elke hydrogeldruppel (figuur 2) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
  8. Bedek de hydrogeldruppel met 200 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% Foetaal Runderserum.
  9. Bedek het deksel van de MD in de juiste positie om gasstroom mogelijk te maken en plaats het apparaat in de incubator.
  10. Voed de cellen om de dag met 200 μL DMEM met 10% FBS.
  11. Controleer de groei van de sferoïden onder een omgekeerde microscoop (figuur 3). De vorming van sferoïden begint na de3e dag. Video 1 toont de locatie van sferoïden op verschillende niveaus in een hydrogelkoepel.
    OPMERKINGEN: Het wordt sterk aanbevolen om de vloeistof rond de hydrogel voorzichtig op te zuigen en langzaam de nieuwe vloeistof aan het milieu toe te voegen om beschadiging van de hydrogeldruppels te voorkomen.

2. Hematoxyline en Eosine kleuring van whole-mount organoïden / sferoïden in een hydrogel

  1. Verwarm het fixeermiddel (4% paraformaldehyde; PFA), PBS en Hematoxyline (zie materiaaltabel) tot 37 °C.
  2. Adem het medium rond de hydrogeldruppel aan met een pipet, voeg 100-200 μL 4% PFA toe om te fixeren en incubeer gedurende 15-20 minuten bij 37 °C.
  3. Aspirateer de 4% PFA en voeg 200 μL PBS toe om 3x gedurende 5 minuten elk op 37 °C te wassen. Aspirateer vervolgens de PBS en incubeer met 200 μL Hematoxyline-oplossing gedurende 15-20 minuten bij 37 °C.
  4. Aspirateer de Hematoxyline en voeg 200 μL dH2O toe om 3x gedurende 10 minuten te wassen bij 37 °C. Giet de dH2O aan en incubeer met 200 μL ethanol gedurende 5-10 min bij 37 °C.
  5. Adem de ethanol op en incubeer met 200 μL eosine (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C. Adem de Eosine aan en voeg 200 μL dH2O toe om gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) te wassen.
  6. Adem de dH2O aan en voeg 100 μL glycerol toe om de hydrogeldruppel als montagemedium te bedekken.
  7. Optioneel: Monteer de nis met een coverslip. Deze stap kan worden weggelaten om te voorkomen dat organoïden / sferoïden van aanzienlijke omvang worden samengeknepen.
  8. Sluit het deksel van MD stevig om uitdroging tot onderzoek te voorkomen. Het monster is stabiel voor onderzoek gedurende ten minste 6 maanden.

3. Immunohistochemie van organoïden/sferoïden in een hydrogel

  1. Verwarm de commercieel verkregen oplossing voor immunohistochemie (S-IHC; zie materiaaltabel) tot 37 °C.
  2. Incubeer de organoïden of sferoïden in de hydrogel met 3% waterstofperoxide (H2O2) in 200 μL dH2O gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  3. Giet de waterstofperoxideoplossing aan en was in dH2O gedurende 5 minuten bij 37 °C. Aspirateer de dH2O en incubeer tweemaal met 100 μL S-IHC bij 37 °C gedurende elk 10 minuten.
  4. Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL primair antilichaam (zie materiaaltabel) verdund in S-IHC gedurende 1-2 uur bij 37 °C (volgens de aanbevelingen van de fabrikant met betrekking tot werkverdunning).
  5. Aspirateer de primaire antilichaamoplossing en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C.
  6. Aspirateer 100 μL S-IHC en incubeer met een gebiotinyleerd secundair antilichaam (zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C.
  7. Aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C. Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL mierikswortelperoxidase (HRP) met het label streptavidin (zie Materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C.
  8. Aspirateer de HRP gelabelde streptavidin en incubeer met 100 μL S-IHC 3x gedurende 5 minuten elk bij 37 °C.
  9. Aspirateer de S-IHC en incubeer met 100 μL DAB/AEC chromogeenoplossingsmengsel (zie materiaaltabel) gedurende 5-10 minuten bij 37 °C.
  10. Controleer de intensiteit van de kleuring onder een lichtmicroscoop.
  11. Wassen met dH2O 3x gedurende 2 min elk.
  12. Optioneel: Incubeer met 100 μL hematoxyline (zie materiaaltabel) voor nucleaire tegenstaining gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  13. Aspirateer de Hematoxyline en was in dH2O gedurende 5 min.
  14. Adem de dH2O op en bedek de hydrogeldruppel met 100 μL glycerol als montagemedium.
  15. Sluit het deksel van de MD stevig tot microscopisch onderzoek.
    OPMERKINGEN: Antigeen ophalen en eiwit blokkerende stappen zijn weggelaten in dit protocol, omdat S-IHC deze stappen elimineert.

4. Immunofluorescentie-etikettering van organoïden/sferoïden in een hydrogel

  1. Warm de volgende materialen op tot 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, primaire antilichaamoplossing in S-IF, secundaire antilichaamoplossing in S-IF, nucleaire vlek en glycerol (zie materiaaltabel).
  2. Aspirateer het celkweekmedium en fixeer met 200 μL 4% PFA gedurende 15-30 min bij 37 °C. Giet het fixeermiddel aan en was het in S-IF 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C.
  3. Voeg dH2O toe aan de zijkant rond de nis om vochtigheid te bieden tijdens de volgende stappen.
  4. Aspirateer de S-IF rond de hydrogeldruppel en incubeer de hydrogeldruppel met 100 μL primaire antilichaamoplossing (zie Materiaaltabel) in S-IF gedurende 30-60 min bij 37 °C.
  5. Aspirateer de primaire antilichaamoplossing en was in S-IF 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C.
  6. Aspirateer de S-IF en incubeer met 100 μL secundaire antilichaamoplossing (zie materiaaltabel) in S-IF gedurende 30-60 min bij 37 °C in het donker.
  7. Aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en was met PBS 3x gedurende 10 minuten elk bij 37 °C in het donker.
  8. Aspirateer de PBS en incubeer met 100 μL kern-DNA-vlek die in het donker een bevestigingsmedium of glycerol bij 37 °C bevat.
  9. Vul de nis met glycerol om uitdroging te voorkomen.
  10. Optioneel: Bedek de nis met een coverslip. Deze stap kan worden weggelaten om te voorkomen dat de organoïden / sferoïden worden samengeknepen.
  11. Sluit de MD goed af. Monsters in MD's kunnen gedurende ten minste 6 maanden bij 4 °C in het donker worden bewaard met minimaal verlies van fluorescentie.
  12. Gebruik de volgende instellingen voor confocaal microscopisch onderzoek: stel de pinhole-waarde van alle kanalen in op 20,1, houd de gain master constant op 550 voor 488 nm, 485 voor 550 nm en 450 voor 594 nm, houd het laservermogen constant voor alle experimenten en het laagste percentage op 2,0.
    OPMERKINGEN: Primaire antilichamen: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumine (1:50), Anti-Beta-galactosidase (1:25), Antimitochondrial antibody (1:100), Anti-Golgi Antibody (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6 antilichaam (1:100). Secundaire antilichamen: Goat anti-Rabbit IgG (H+L)- 488, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-550, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-488, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-550, Goat anti-Chicken IgY(H+L)-647. De verdunning voor alle secundaire antilichamen is 1:100. Daarnaast wordt ook FITC-Phalloidin (1:100), een geconjugeerd antilichaam, gebruikt (zie Materiaaltabel).

5. Plasmamembraan en kernetikettering van levende organoïden en sferoïden in een hydrogel

  1. Bereid etiketteringsoplossing met Alexa fluor tarwekiem agglutinine (5,0 μg / ml) en Hoechst (2 μM) in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), volgens de aanbevelingen van de fabrikant (zie Tabel met materialen), en warm op tot 37 °C.
  2. Aspirateer het celkweekmedium en voeg 100 μL etiketteeroplossing toe om de hydrogeldruppel te bedekken. Incubeer gedurende 15-30 min bij 37 °C.
  3. Verwijder de etiketteeroplossing en was tweemaal in PBS 2x gedurende 10 minuten elk op 37 °C. Optioneel: Fixeer met 200 μL 4% formaldehyde gedurende 15 min bij 37 °C.
  4. Bedek de hydrogeldruppel met glycerol als bevestigingsmedium. Optioneel: Monteer de nis met een afdekglas.
  5. Sluit het deksel van de MD goed en bewaar het gekoeld in het donker tot fluorescentie / confocaal microscopisch onderzoek. Het is stabiel voor ten minste 6 maanden.

6. Invriezen en ontdooien van organoïden/sferoïden in een hydrogel

  1. Vries de organoïden in volgens de onderstaande stappen.
    1. Warm de in de handel verkregen vriesoplossing (FS; zie materiaaltabel) op tot 37 °C.
    2. Adem de celkweekmedia rond de hydrogelkoepel voorzichtig aan.
    3. Voeg voorzichtig 200 μL FS toe. Incubeer het monster met FS bij 37 °C gedurende 1 uur.
    4. Sluit het deksel van het apparaat goed en plaats het in een schuimdoos. Plaats deze schuimdoos in een andere schuimdoos, zoals weergegeven in aanvullende figuur 3. Sluit beide schuimdozen goed af. Twee schuimdozen in elkaar zorgen voor een temperatuurkoelingsgradiëntbereik van 1 tot 2° C/min van het monster in een vriezer van -20 °C.
    5. Plaats de doos gedurende 2 uur op -20 °C. Breng de doos over in een vriezer van -80 °C en laat hem een nacht staan.
    6. Haal het monster uit de dozen. Het monster in de MD kan gedurende 6 maanden in de vriezer van -80 °C worden bewaard.
    7. Breng de MD die het monster bevat over naar de tank met vloeibare stikstof voor opslag op langere termijn.
  2. Ontdooi de organoïden volgens de onderstaande stappen.
    1. Haal het MD met het monster uit de vriezer/stikstoftank en plaats het direct in een incubator bij 37 °C. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Voeg 200 μL warm kweekmedium toe aan de nis (de verhouding tussen FS en celkweekmedium is 1:1) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    3. Voeg meer warm kweekmedium toe aan de niche (de verhouding tussen FS en celkweekmedium is 1:2) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    4. Aspirateer het medium en FS mengsel voorzichtig. Ga verder met scanning elektronenmicroscopie (stap 7) en transmissie-elektronenmicroscopie (stap 8) beeldvorming van de organoïden/sferoïden in de hydrogel.

7. Scanning elektronenmicroscopie van organoïden/sferoïden met hele montering

  1. Warm Karnovsky's fixatieve en post-fixatieve oplossing (zie Tabel van Materialen) op tot kamertemperatuur (RT).
  2. Aspirateer het celkweekmedium rond de hydrogel in de MD. Plaats het monster in de MD op ijs in de laminaire stromingskap gedurende 15 minuten.
  3. Adem de vloeibare hydrogel rond de organoïden/sferoïden heel voorzichtig aan. Een beperkte hoeveelheid matrigel kan in de niche blijven om te voorkomen dat het monster wordt beschadigd en verloren.
  4. Fix met Karnovsky's fixatief (2% PFA, 2,5% glutaaraldehyde in 0,15 M cacodylaatbuffer en 2 mM CaCl2; zie Tabel van materialen) bij RT gedurende 1 uur.
  5. Giet het fixeermiddel voorzichtig aan en was met gedestilleerd water (dH2O) 3x gedurende 15 minuten per stuk.
  6. Adem de dH2O voorzichtig aan en fixeer met postfixatieve oplossing (1% waterig osmiumtetroxide [OsO4]; zie Materiaaltabel) bij RT gedurende 1 uur.
  7. Aspirateer het postfixatiemiddel voorzichtig en was met gedestilleerd water (dH2O) 3x gedurende 15 minuten elk.
  8. Droog uit in een gesorteerde reeks ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mengsel van ethanol/aceton (1:1; 1:2) en absolute aceton bij RT gedurende elk 15 minuten.
  9. Droog met een kritische puntdroger.
  10. Bekleed het monster in het apparaat met 6 nm goud/palladium met behulp van een sputtercoater (zie Materiaaltabel) gedurende 90 s.
  11. Observeer onder een scanning elektronenmicroscoop met een in-lens secundaire elektronendetector bij 2-3 kV in vacuümmodus (5 x 10-6 mA). Maak foto's met een werkafstand van 8,1-8,2 mm en met vergrotingen van 675x, 1050x en 1570x.
    OPMERKINGEN: Alle stappen worden uitgevoerd in de MD. Gebruik 200-250 μL oplossing voor elke stap.

8. Transmissie-elektronenmicroscopie van organoïden/sferoïden in een hydrogel

  1. Warm Karnovsky's fixatief op tot 37 °C. Aspirateer het celkweekmedium rond de hydrogel in de MD.
  2. Bevestig het monster met Karnovsky's fixatief op RT gedurende 1 uur. Was met dH2O 3x gedurende 15 minuten per stuk.
  3. Post-fix met 2% waterig OsO4 en 2,5% kaliumferrocyanide bij RT gedurende 45 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
  4. Incubeer in 0,5% Thiocarbohydrazide (TCH; zie Tabel van Materialen) bij RT gedurende 30 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
  5. Incubeer in 2% waterige OsO4 op RT gedurende 30 min. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
  6. Incubeer in 2% uranylacetaatoplossing (zie materiaaltabel) bij RT gedurende 1 uur.
    OPMERKING: In deze stap kunnen sferoïden 's nachts bij 4 °C worden gehouden.
  7. Incubeer in lood aspartaatoplossing (zie materiaaltabel) bij 60 °C gedurende 45 minuten. Wassen met dH2O 3x gedurende 10 min elk.
  8. Droog uit in een gegradeerde reeks ethanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) en absolute aceton bij RT gedurende elk 15 minuten.
  9. Behandel met een mengsel van (1:1; 1:2) aceton/eponhars en zuivere eponhars (zie materiaaltabel) op RT gedurende elk 2 uur.
  10. Polymeriseer de hars bij 60 °C 's nachts (minimaal 16 uur). Verwijder na de polymerisatie het harsblok uit de MD, zoals weergegeven in aanvullende figuur 4.
  11. Bevestig het harsblok aan een groter blok met een harslijm. Snijd het blok bij en bereik de locatie van organoïden of sferoïden.
  12. Krijg halfdunne (1.000 nm) en ultradunne secties (60 nm) met behulp van een ultramicrotoom (zie Materiaaltabel).
  13. Plaats de ultradunne secties op 100 mesh koperen roosters en observeer onder een scanning elektronenmicroscoop met een STEM-detector bij een versnellende spanning van 30 kV. Leg beelden vast met een werkafstand van 44 mm en met vergrotingen van 2580x, 5020x en 6060x.
    OPMERKINGEN: Gebruik 200-250 μL oplossing voor elke stap. Stappen 8.1-8.10 worden uitgevoerd in de MD.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel vertegenwoordigt een multifunctioneel apparaat (MD) en vormt een aanvulling op methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering, coating en verwerking van volledige organoïden of sferoïden terwijl ze zich nog in een hydrogel bevinden in een enkele uniek ontworpen omgeving. De huidige studie is ontworpen om HepG2-leverkankersferoïden te bereiden in 35 hydrogeldruppels in 35 MD's. Experimenten werden uitgevoerd in driev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De MD, als aanvulling op formuleringen en protocollen die hier worden beschreven, vergemakkelijkt snelle en spontane 3D-groei van organoïden en sferoïden in een meer gecontroleerde omgeving en zet het experiment voort in dezelfde omstandigheden. Het monster blijft gedurende het hele proces in dezelfde omgeving en bijna 100% van de 3D-groeiarchitecturen blijven intact in de container. Dit verbetert de homogeniteit tijdens de sequentiële experimenten en maakt een langere kweekperiode mogelijk. Bovendien is het aantal stapp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ranan Gulhan Aktas is eigenaar van MD, S-IHC, S-IF en FS patentaanvragen. Olgu Enis Tok was betrokken bij de ontwikkeling van deze producten. Olgu Enis Tok en Gamze Demirel zijn R&D-teamleden van het bedrijf genaamd Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut en Ozgecan Kayalar hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn Dale Mertes van de Universiteit van Chicago dankbaar voor het opstellen van diagrammen, dr. Mehmet Serif Aydin voor zijn technische ondersteuning aan het Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, en dr. Rana Kazemi van de Maltepe University voor het redigeren van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Absolute Ethanol (EtOH)Merck8187602500Verdunnen in dH2O om 30%, 50%, 70%, 80%, 90% en 96% oplossing te maken en bewaar bij RT
AcetoneMerck8222512500Bewaar bij RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin en Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)  InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Bewaar bij -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal AntibodyBiocare MedicalCP 028 ABewaar bij +4 °C
Anti-albumin antibodyAbcamEPR20195Bewaar bij +4 °C, Dilutie: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonalAbcam134435Bewaar bij +4 °C, Dilutie: 1:25
Anti-cytokeratin 5Abcam53121Bewaar bij +4 °C, Dilutie: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal AntibodyBiocare MedicalACI 3058 A, BBewaar bij +4 °C, Dilutie: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC1016-500GOplossen in Karnovsky's fixatiemiddel om 2 mM CaCl2 te maken; bewaar bij RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Centrifuge tubes, 15 mL Nest601051
Centrifuge tubes, 50 mL Nest602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 IncubatorPanasonicKM-CC17RU2
Copper GridsElectron Microscopy SciencesG100-CuUltradunne secties op de roosters; 100 lijnen/inch vierkante mesh
Critical Point DryerLeicaEM CPD300Voor het drogen van biologische monsters voor SEM toepassingen in absolute aceton
DAB/AEC chromogen solution mixture  Sigma AldrichAEC101Bewaar bij +4 °C
Diamond knifeDiatomeUltra 45°, 40-USGebruik voor ultradunne secties voor TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biologyBiofroxx67-68-5
Disposable Plastic Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco41966-029Bewaar bij +4 °C
Eosin Y Solution AlcoholicBright Slide2.BS01-105-1000
Epon resin Sigma45359-1EA-FEpoxy Embedding Medium kit, Bewaar bij +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive FortifierPan BiotechP30-3304Bewaar bij +4 °C
Freezing Solution (FS)CelloramaCellO-FBewaar bij +4 °C
Glass knife makerLeicaEM KMR3Voor het maken van glazen messen in 8 mm dikte
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)Leica7890-08Gebruik voor ultra- of semi-dunne secties voor TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% Electron Microscopy Sciences16210Verdunnen in dH2O om 2.5% oplossing te maken en bewaar bij +4 °C
Glycerol solutionSigma Aldrich56-81-5Bewaar bij -20 C, Dilutie :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647InvitrogenA32933Bewaar bij RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35502Bewaar bij +4 °C,  Dilutie :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84540Bewaar bij +4 °C,  Dilutie :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488Invitrogen35552Bewaar bij +4 °C,  Dilutie :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550Invitrogen84541Bewaar bij +4 °C
Hematoxylin Harris Bright Slide2.BS01-104-1000
HepG2 cellsATCCHB-8065Bewaar in stikstoftank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6R&D SystemsMAB2020Bewaar bij -20 °C
HydrogelCorning354248Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Bewaar bij -20 °C
HydrogelCorning354234Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Bewaar bij -20 °C
HydrogelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HydrogelBiotechne, R&D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, Bewaar bij -20 °C
Karnovsky's fixative%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; vers bereiden; gebruik voor TEM & SEM monsters
L-Aspartic acidSigma11189-100GBewaar bij RT
Lead aspartate solutionLos 40

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208(2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578(2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907(2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159(2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149(2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133(2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614(2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Organo dkweekSfero dkweekHydrogelbewerkingMultifunctioneel apparaatImmunofluorescentielabelingConfocale microscopieElektronenmicroscopieWhole mount imaging3D celmodellenCryopreservatieprotocol

Gerelateerde artikelen