Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64564

⸱

16 december 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Felsenstein Medical Research Center, 2Davidoff Center, Rabin Medical Center, 3BioInsight Ltd., 4Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Samenvatting

Ondanks opmerkelijke vooruitgang in het begrijpen van tumorbiologie, faalt de overgrote meerderheid van de kandidaat-oncologische geneesmiddelen die deelnemen aan klinische onderzoeken, vaak als gevolg van een gebrek aan klinische werkzaamheid. Dit hoge faalpercentage verlicht het onvermogen van de huidige preklinische modellen om de klinische werkzaamheid te voorspellen, voornamelijk vanwege hun ontoereikendheid in het weerspiegelen van tumorheterogeniteit en de micro-omgeving van de tumor. Deze beperkingen kunnen worden aangepakt met 3-dimensionale (3D) cultuurmodellen (sferoïden) die zijn vastgesteld op basis van menselijke tumormonsters die zijn afgeleid van individuele patiënten. Deze 3D-culturen vertegenwoordigen de biologie van de echte wereld beter dan gevestigde cellijnen die de heterogeniteit van de tumor niet weerspiegelen. Bovendien zijn 3D-culturen beter dan 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) omdat ze elementen van de tumoromgeving repliceren, zoals hypoxie, necrose en celadhesie, en de natuurlijke celvorm en -groei behouden. In de huidige studie werd een methode ontwikkeld voor het bereiden van primaire culturen van kankercellen van individuele patiënten die 3D zijn en groeien in meercellige sferoïden. De cellen kunnen rechtstreeks worden afgeleid van patiënttumoren of van de patiënt afgeleide xenografts. De methode is breed toepasbaar op solide tumoren (bijv. Dikke darm, borst en long) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder afhankelijk te zijn van gespecialiseerde apparatuur. Hierin wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. Deze meercellige sferoïden kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.

Inleiding

In vitro en in vivo studies vertegenwoordigen complementaire benaderingen voor het ontwikkelen van kankerbehandelingen. In vitro modellen maken de controle van de meeste experimentele variabelen mogelijk en vergemakkelijken kwantitatieve analyses. Ze dienen vaak als goedkope screeningplatforms en kunnen ook worden gebruikt voor mechanistische studies1. Hun biologische relevantie is echter inherent beperkt, omdat dergelijke modellen slechts gedeeltelijk de micro-omgeving van de tumor weerspiegelen1. In vivo modellen, zoals patiënt-afgeleide xenografts (PDX), vangen daarentegen de complexiteit van de tumormicro-omgeving en zijn meer geschikt voor translationele studies en individualisering van de behandeling bij patiënten (d.w.z. het onderzoeken van de respons op geneesmiddelen in een model afgeleid van een individuele patiënt)1. In vivo modellen zijn echter niet bevorderlijk voor high-throughput benaderingen voor geneesmiddelenscreening, omdat de experimentele parameters niet zo strak kunnen worden gecontroleerd als in in vitro modellen en omdat hun ontwikkeling tijdrovend, arbeidsintensief en kostbaar is 1,2.

In vitro modellen zijn al meer dan 100 jaar beschikbaar en cellijnen zijn al meer dan 70 jaar beschikbaar3. In de afgelopen decennia is de complexiteit van de beschikbare in vitro modellen van solide tumoren echter dramatisch toegenomen. Deze complexiteit varieert van 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) die ofwel tumor-afgeleide gevestigde cellijnen of primaire cellijnen zijn tot de meer recente benaderingen met 3-dimensionale (3D) modellen1. Binnen de 2D-modellen is een belangrijk onderscheid tussen de gevestigde en primaire cellijnen4. Gevestigde cellijnen worden vereeuwigd; Daarom kan dezelfde cellijn wereldwijd gedurende vele jaren worden gebruikt, wat vanuit een historisch perspectief samenwerking, de accumulatie van gegevens en de ontwikkeling van vele behandelingsstrategieën vergemakkelijkt. Genetische afwijkingen in deze cellijnen hopen zich echter op met elke passage, waardoor hun biologische relevantie in gevaar komt. Bovendien weerspiegelt het beperkte aantal beschikbare cellijnen niet de heterogeniteit van tumoren bij patiënten 4,5. Primaire kankercellijnen zijn rechtstreeks afgeleid van gereseceerde tumormonsters verkregen via biopsieën, pleurale effusies of resecties. Daarom zijn primaire kankercellijnen biologisch relevanter omdat ze elementen van de micro-omgeving van de tumor en tumorkenmerken behouden, zoals intercellulair gedrag (bijv. Cross-talk tussen gezonde en kankercellen) en de stamachtige fenotypen van kankercellen. De replicerende capaciteit van primaire cellijnen is echter beperkt, wat leidt tot een smalle kweektijd en het aantal tumorcellen beperkt dat kan worden gebruikt voor analyses 4,5.

Modellen met 3D-culturen zijn biologisch relevanter dan 2D-cultuurmodellen, omdat de in vivo omstandigheden behouden blijven. Zo behouden 3D-cultuurmodellen de natuurlijke celvorm en -groei en repliceren ze elementen van de tumoromgeving, zoals hypoxie, necrose en celadhesie. De meest gebruikte 3D-modellen in kankeronderzoek omvatten meercellige sferoïden, op steigers gebaseerde structuren en matrix-ingebedde culturen 4,6,7.

Het huidige protocol genereert 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en evalueert hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. De representatieve resultaten die hierin worden gepresenteerd, zijn van borst- en darmkanker; Dit protocol is echter breed toepasbaar op andere solide tumortypen (bijv. Cholangiocarcinoom, maag-, long- en alvleesklierkanker) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder te vertrouwen op gespecialiseerde apparatuur. De meercellige sferoïden die met behulp van deze aanpak worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.

Dit protocol is verdeeld in drie secties: (1) het genereren, verzamelen en tellen van de sferoïden ter voorbereiding op hun gebruik als model voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen; (2) MTT-test om de werkzaamheid van het geneesmiddel op de sferoïden te beoordelen; en (3) de microscopische evaluatie van morfologische veranderingen na de behandeling van de sferoïden met geneesmiddelen als een andere benadering voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen (figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De verzameling van menselijke tumormonsters die werden gebruikt voor de primaire tumorcelculturen werd uitgevoerd volgens de door de institutionele beoordelingsraad (IRB) goedgekeurde protocollen in het Rabin Medical Center met schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten. Patiënten die in aanmerking kwamen voor deelname aan de studie waren mannelijke en vrouwelijke volwassen en pediatrische kankerpatiënten met niet-gemetastaseerde borst-, darm-, lever-, long-, neuro-endocriene, eierstok- of pancreaskanker, kinderkanker of gemetastaseerde kanker. Het enige uitsluitingscriterium was het gebrek aan capaciteit om geïnformeerde toestemming te geven.

1. Generatie en verzameling van sferoïden

OPMERKING: De isolatie van primaire tumorcellen kan worden uitgevoerd zoals beschreven door Kodak et al.8. Belangrijk is dat primaire tumorcellen die worden gebruikt voor het genereren van de sferoïden direct kunnen worden afgeleid van patiëntmonsters verkregen door biopsie, resectie, enz., Of indirect met behulp van tumormonsters van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) -modellen, zoals beschreven door Moskovits et al.9.

  1. Bereid een eencellige suspensie van aanhangende primaire tumorcelculturen van 75% -100% samenvloeiing door een kleine kolf (T25) te nemen met een eencellige aanhangende primaire celcultuur, de celkweekmedia te verwijderen, te wassen met PBS en vervolgens 1 ml 1x Accutase (een celloslatingsoplossing) toe te voegen (zie de tabel met materialen) gedurende 3 minuten bij 37 °C.
  2. Neutraliseer de Accutase-oplossing door 5 ml celkweekmedium toe te voegen (RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 1:100 penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% L-glutamine; zie de tabel met materialen).
  3. Zuig de cellen op met een serologische pipet van 10 ml en deponeer ze in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de buis op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder het celkweekmedium, voeg 5 ml vers celkweekmedium toe aan de celkorrel en meng voorzichtig.
  5. Tel de levensvatbare cellen met een hemocytometer10. Neem hiervoor een aliquot van 50 μL van de celsuspensie en meng deze met 50 μL trypan blauw. Tel de levende cellen (de cellen die negatief zijn voor de blauwe kleur) en bereken het totale aantal levende cellen in de suspensie.
  6. Bereid een "3D-kweekmedium" voor (een celkweekmedium aangevuld met 5% keldermembraanmatrix; zie de materiaaltabel).
    OPMERKING: Het "3D-cultuurmedium" is vloeistofachtig bij kamertemperatuur. Bij 37 °C wordt de consistentie meer gelachtig (zodat de cellen bij elkaar blijven), hoewel het nog steeds kan worden gepipetteerd (omdat het slechts 5% keldermembraanmatrix bevat).
  7. Bereken het aantal cellen dat nodig is voor de bepaling en het totale benodigde volume; elke put moet 2.000-8.000 cellen bevatten in 200 μL medium.
  8. Bereid een celsuspensie met het gewenste aantal cellen (bijv. 4.000 cellen) in 200 μL van het "3D-kweekmedium" en meng voorzichtig met de pipet om een homogene verdeling te garanderen.
  9. Breng de suspensie over in een pipetteerreservoir. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 200 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een ultralage 96-putplaat (zie de materiaaltabel). Meng vóór elke verzameling van de cellen de suspensie goed.
  10. Centrifugeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g om de clustering van de cellen af te dwingen, waardoor de celaggregatie wordt verbeterd, en incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.
  11. Ververs elke 2-3 dagen het "3D-cultuurmedium". Centrifugeer de plaat op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, verwijder voorzichtig 50% van het medium (100 μL) en gooi het weg en voeg 100 μL vers "3D-kweekmedium" toe om de bestaande oplossing te vervangen. Herhaal stap 1.11 en plaats de plaat terug in de 37 °C, 5% CO2 bevochtigde incubator.
    OPMERKING: Het medium moet worden verwijderd wanneer de plaat op 45° wordt gehouden en het medium mag alleen uit het bovenste deel worden verzameld om te voorkomen dat de cellen worden verzameld. Een vacuümafzuigsysteem mag niet worden gebruikt. Het verse medium moet langzaam en voorzichtig worden toegevoegd om de sferoïden, die zich al beginnen te vormen, niet te verstoren.
  12. Inspecteer de cellen elke 1-2 dagen onder een microscoop om de vorming van sferoïden te controleren. Meet de diameter van de gevormde sferoïden met behulp van het hulpmiddel "schaal" in de beeldvormingssoftware (zie de materiaaltabel).
    OPMERKING: Microscopische inspectie moet eerst onregelmatige ronde tot ovale lichamen onthullen die een bolvormige vorm aannemen naarmate de tijd vordert11,12.
    1. Wanneer de sferoïde diameter 100-200 μm bereikt, voert u de experimenten met de werkzaamheid van het geneesmiddel uit.
      OPMERKING: De experimenten met de werkzaamheid van het geneesmiddel worden uitgevoerd wanneer de sferoïden deze diameter bereiken, omdat op dat moment de meerderheid van de cellen zich vermenigvuldigt, wat bevorderlijk is voor het evalueren van de respons op de behandeling. Sferoïden met een grotere diameter bevatten een necrotische kern en een rustlaag11,12, wat resulteert in een kleiner deel van de prolifererende cellen die reageren op de behandeling.
  13. Gebruik voor het verzamelen van sferoïden een pipet van 1.000 μL om de sferoïden uit elke put te verzamelen en deponeer ze in een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Sferoïden zijn inherent kwetsbaar en vereisen een voorzichtige behandeling. Wanneer u het medium met de sferoïden in de conische buis overbrengt, houdt u de buis op 45° en pipet u langzaam op de wand van de buis. Sferoïden zijn zichtbaar voor het oog.
  14. Centrifugeer de conische buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g en zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg met behulp van een pipet.
  15. Voeg 0,5 ml van het celkweekmedium toe en resuspensie de pellet goed maar voorzichtig. Vermijd het maken van bubbels.
  16. Voer sferoïde tellen uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Gebruik een plaat met 96 putten en teken een plusteken aan de onderkant van een put om de put in kwadranten te verdelen (om de telling bij te houden).
    2. Voeg 50 μL van de suspensie toe aan de put en tel de sferoïden handmatig onder de microscoop (met behulp van een 10x objectieflens).
    3. Tel de sferoïden in elk kwadrant, pas op dat u niet dubbel telt en bereken het totale aantal sferoïden in de put.
      OPMERKING: Voor de nauwkeurigheid van de telling, tel ten minste 50 sferoïden in een put. Als er minder dan 50 sferoïden zijn, meng dan voorzichtig de suspensie om een homogene verdeling te garanderen en tel opnieuw met behulp van een groter volume van de suspensie toegevoegd aan een nieuwe put. Als alternatief, als er minder dan 50 sferoïden in een put zijn, kunnen de sferoïden worden gecentrifugeerd en voorzichtig worden geresuspendeerd in een volume van <0,5 ml. Als er meer dan 100 sferoïden zijn, voeg dan celkweekmedium toe aan de sferoïde suspensie, meng voorzichtig en vertel.
    4. Bereken de sferoïdeconcentratie (sferoïde telling/telvolume [μL]) en bereken vervolgens het totale aantal sferoïden in de suspensie (sferoïdeconcentratie × totale volume).

2. Drug efficacy assay (MTT assay)

NOOT: Voor details, zie van Meerloo et al.13. Ook moet voor de MTT-test alleen het celkweekmedium worden gebruikt en niet het "3D-kweekmedium" (het toevoegen van de keldermembraanmatrix is niet nodig en kan mogelijk de MTT-test verstoren).

  1. Bereid in een nieuwe buis een sferoïde suspensie in een concentratie van 200 sferoïden per 200 μL celkweekmedium (RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 1:100 penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% L-glutamine).
    1. Bereid voor elke medicamenteuze behandeling een voorraad sferoïden voor in een buis van 15 ml. Bereken de hoeveelheid die nodig is voor elk medicijn door het aantal putten dat nodig is voor herhalingen: (5-8) × 200 μL. Voeg het medicijn toe aan de buis tot de uiteindelijke concentratie die nodig is.
      OPMERKING: Zie de representatieve resultatensectie met betrekking tot de geneesmiddelen die voor deze studie worden gebruikt en hun dosering. Ook worden de commerciële details van de geneesmiddelen vermeld in de tabel met materialen.
  2. Breng 200 μL van de sferoïde suspensie over in de putjes van een ultralage 96-putplaat en incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO 2-bevochtigde incubator. Gebruik niet de externe rijen en kolommen van de 96-putplaat voor de test, omdat deze putten worden gekenmerkt door verhoogde verdamping, wat kan leiden tot verhoogde variabiliteit tussen de herhalingsexperimenten; voeg in plaats daarvan PBS toe aan deze putten.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat de cultuur van de sferoïden homogeen is voordat de cultuur wordt gealiquoteerd in de 96-putplaat. Ook moet een controlevoorwaarde (d.w.z. onbehandelde sferoïden) in elk experiment worden opgenomen.
  3. Na het incuberen van de sferoïden met het onderzoeksgeneesmiddel gedurende 24-72 uur, centrifugeert u de plaat gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g en verwijdert u voorzichtig 170 μL van het celkweekmedium, waardoor 30 μL (inclusief de sferoïden) op de bodem van de put achterblijft.
    OPMERKING: Het verwijderen van de 170 μL celkweekmedium moet zorgvuldig worden gedaan, om de sferoïden niet te verwijderen. Houd de plaat op 45° en plaats één hand (met een donkere handschoen voor contrast) onder de putjes zodat de sferoïden zichtbaar zijn (witte stippen).
  4. Bereid de MTT-oplossing (0,714 mg/ml in fenolvrije RPMI, zie de tabel met materialen).
  5. Voeg 70 μL MTT-oplossing toe aan elk putje tot een eindvolume van 100 μL per put (de uiteindelijke MTT-concentratie in de put is 0,05 mg per 100 μL). Bereid bovendien "Blanke" putten voor met MTT-oplossing zonder cellen.
    OPMERKING: MTT is lichtgevoelig. Daarom moet het licht in de kap worden uitgeschakeld en moet de buis met de MTT-oplossing worden bedekt met aluminiumfolie.
  6. Incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 3-4 uur totdat een verandering in de kleur van de oplossing in de putten (paarse kleur vertegenwoordigt levende cellen) wordt waargenomen.
  7. Wanneer een verandering wordt waargenomen, voegt u 100 μL stopoplossing (0,1N HCl in isopropanol) toe aan elke put en mengt u voorzichtig de inhoud van de putten zonder bubbels te creëren.
  8. Lees de absorptie van de plaat af in een Fluorometer-ELISA-lezer (zie de Materiaaltabel) bij een golflengte van 570 nm en een achtergrondgolflengte van 630-690 nM.
    OPMERKING: Als de beschikbare fluorometer-ELISA-lezer de 96-putplaat met ultralage bevestiging niet kan lezen, breng dan de inhoud van elke put over naar een overeenkomstige 96-putplaat met vlakke bodem.
  9. Bereken de levensvatbaarheid van de cel volgens de onderstaande stappen.
    1. Bereken voor elke put het "specifieke signaal" ("specifiek signaal" = het signaal bij 570 nm - het signaal bij 630-690 nm). Bereken vervolgens de gemiddelde waarde van de "Blanke" putten en trek deze waarde af van elke put.
    2. Bereken het gemiddelde van de "specifieke signalen" in de controleputten die cellen bevatten die niet met het onderzoeksgeneesmiddel zijn behandeld ("AV-SS-unt").
    3. Bereken de levensvatbaarheid (percentage) van cellen in elke put ten opzichte van de putten met onbehandelde cellen.
      OPMERKING: Levensvatbaarheid = (specifiek signaal in elke put/"AV-SS-unt") × 100

3. Monitoren en analyseren van de morfologische veranderingen in de sferoïden

OPMERKING: Wat de MTT-test betreft, mag bij deze evaluatie alleen het celkweekmedium en niet het "3D-kweekmedium" worden gebruikt (het toevoegen van de keldermembraanmatrix is niet nodig en kan de analyse mogelijk verstoren).

  1. Na het tellen van de sferoïden, verdunt u de suspensie in celkweekmedium (RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS, 1:100 penicilline-streptomycine, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% L-glutamine) tot ongeveer 1-2 sferoïden per 20 μL.
  2. Plaats 80 μL celkweekmedium in de putjes van een ultralage 96-putplaat en voeg vervolgens 20 μL van de sferoïde suspensie toe aan de putjes.
    OPMERKING: De putten bevatten daarom 1-2 sferoïden in een volume van 100 μL.
  3. Controleer de putten zorgvuldig onder de microscoop en markeer de putten die één sferoïde bevatten, omdat ze voor deze analyse zullen worden gebruikt.
  4. Bereid het onderzoeksgeneesmiddel voor in een concentratie die tweemaal de concentratie van belang is. Voeg 100 μL van de geneesmiddeloplossing toe aan de relevante putten (de totale concentratie in de put is dan 1x).
  5. Leg een afbeelding van elke put vast op dag 0 (voordat u het onderzoeksgeneesmiddel toevoegt) en gebruik de "schaal" -tool in de beeldvormingssoftware (zie de tabel met materialen) om de diameters van de sferoïden te bepalen.
  6. Incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator en onderzoek de morfologie en meet de diameter van de sferoïden (met behulp van de "schaal" -tool) dagelijks gedurende 3-7 dagen, afhankelijk van wanneer het geneesmiddeleffect wordt waargenomen (bijv. Celverspreiding, invasieve peulen, structuurvernietiging, enz.).
  7. Plot aan het einde van het experiment de veranderingen in sferoïde diameters (ten opzichte van dag 0) in de loop van de tijd.
    OPMERKING: Verandering (percentage) = (sferoïde diameter op een specifieke dag/de diameter van die sferoïde op dag 0) × 100

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol presenteert procedures voor het genereren van een homogene cultuur van sferoïden uit primaire tumorcellen, het kwantitatief evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen op sferoïdecultuur (MTT-test) en het bepalen van het effect van studiegeneesmiddelen op sferoïde morfologie. Gegevens van de representatieve experimenten in sferoïden gegenereerd uit colon- en borstkankercelculturen worden gepresenteerd. Vergelijkbare experimenten werden uitgevoerd met behulp van andere tumortypen, waaronder cholangiocarc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het genereren van 3D primaire celculturen (sferoïden) afgeleid van menselijke tumormonsters. Deze sferoïden kunnen worden gebruikt voor verschillende analyses, waaronder het evalueren van potentiële kandidaat-geneesmiddelen en medicijncombinaties, het identificeren van potentiële biomarkers of therapeutische doelen en het onderzoeken van de mechanismen van respons en resistentie. Het protocol maakt gebruik van primaire tumorcellen die rechtstreeks zijn afgeleid ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5 FluorouracilTEVA Israellot 16c22NAFluorouracil, Adrucil
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutase Cell Dissociation
CisplatinTEVA Israel20B06LAAbiplatin, 
Cultrex Trevigen3632-010-02Basement membrane matrix, type 3
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650-100ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific2391595
Flurometer ELISA readerBiotekSynergy H1Gen5 3.11
Hydrochloric acid (HCl) Sigma Aldrich320331voor stopoplossing
ImageJNational Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Versie 1.52aOpen-source software ImageJ
IsopropanolGadotP180008215voor stopoplossing
L-glutamineGibco1843977
MTT Sigma AldrichM5655-1G3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide
Non-essential amino acids Gibco11140050
Palbociclib  Med Chem ExpressCAS # 571190-30-2
PBSGibco14190094Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Zonder Calcium en Magnesium
Penicillin-streptomycin Invitrogen2119399
Phenol-vrij RPMI 1640Biological industries, Israel01-103-1A
Pippeting reservoirAlexredRED LTT012025
RPMI-1640 kweekmedium Gibco11530586
SunitinibMed Chem ExpressCAS # 341031-54-7
TrastuzumabF. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Zwitserland10172154 ILHerceptin
Trypan blauw 0,5% oplossingBiological industries, Israel03-102-1B
Ultra-lage aanhechting 96-wells plaatGreiner Bio-one650970
VinorelbineEbewe11733027-03Navelbine

Referenties

  1. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
  2. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4(2020).
  3. Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  4. Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381(2021).
  5. Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
  6. Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284(2022).
  7. Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
  8. Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
  9. Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665(2022).
  10. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  11. Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
  12. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).
  13. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
  14. Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D tumorsfero dendrug sensitiviteitsassaymulticellulaire sfero denprimaire kankercellentumor micro omgevingMTT assayultra low attachment plaatsfero dvormingcelviabiliteit
Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.