Methodenartikel

In Silico Identificatie en karakterisering van circRNA's tijdens gastheer-pathogeen interacties

DOI:

10.3791/64565

⸱

21 oktober 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR), Universiti Malaya

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier ingediende protocol verklaart de volledige in silico-pijplijn die nodig is om circRNA's te voorspellen en functioneel te karakteriseren uit RNA-sequencing transcriptoomgegevens die gastheer-pathogeeninteracties bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circulaire RNA's (circRNA's) zijn een klasse van niet-coderende RNA's die worden gevormd via back-splicing. Deze circRNA's worden voornamelijk bestudeerd voor hun rol als regulatoren van verschillende biologische processen. Met name opkomend bewijs toont aan dat gastheer circRNA's differentieel tot expressie kunnen worden gebracht (DE) bij infectie met pathogenen (bijv. Influenza en coronavirussen), wat een rol suggereert voor circRNA's bij het reguleren van aangeboren immuunresponsen van de gastheer. Onderzoek naar de rol van circRNA's tijdens pathogene infecties wordt echter beperkt door de kennis en vaardigheden die nodig zijn om de noodzakelijke bioinformatische analyse uit te voeren om DE-circRNA's te identificeren uit RNA-sequencing (RNA-seq) -gegevens. Bioinformatica voorspelling en identificatie van circRNA's is cruciaal voor elke verificatie, en functionele studies met behulp van kostbare en tijdrovende wet-lab technieken. Om dit probleem op te lossen, wordt in dit manuscript een stapsgewijs protocol van in silico-voorspelling en karakterisering van circRNA's met behulp van RNA-seq-gegevens verstrekt. Het protocol kan worden onderverdeeld in vier stappen: 1) Voorspelling en kwantificering van DE-circRNA's via de CIRIquant-pijplijn; 2) Annotatie via circBase en karakterisering van DE circRNA's; 3) CircRNA-miRNA interactie voorspelling via Circr pijplijn; 4) functionele verrijkingsanalyse van circRNA-oudergenen met behulp van Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Deze pijplijn zal nuttig zijn bij het stimuleren van toekomstig in vitro en in vivo onderzoek om de rol van circRNA's in gastheer-pathogeen interacties verder te ontrafelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastheer-pathogeen interacties vertegenwoordigen een complex samenspel tussen de pathogenen en gastheerorganismen, dat de aangeboren immuunresponsen van de gastheren veroorzaakt die uiteindelijk resulteren in de verwijdering van binnendringende pathogenen 1,2. Tijdens pathogene infecties wordt een groot aantal immuungenen van de gastheer gereguleerd om de replicatie en afgifte van pathogenen te remmen. Gemeenschappelijke interferon-gestimuleerde genen (ISG's) gereguleerd op pathogene infecties omvatten bijvoorbeeld ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I en OASL 3,4. Naast eiwitcoderende genen hebben studies ook gemeld dat niet-coderende RNA's zoals lange niet-coderende RNA's (lncRNA's), microRNA's (miRNA's) en circulaire RNA's (circRNA's) ook een rol spelen en gelijktijdig worden gereguleerd tijdens pathogene infecties 5,6,7. In tegenstelling tot eiwitcoderende genen die voornamelijk coderen voor eiwitten als functionele moleculen, is het bekend dat niet-coderende RNA's (ncRNA's) functioneren als regulatoren van genen op transcriptionele en post-transcriptionele niveaus. Studies met de deelname van niet-coderende RNA's, met name circRNA's, bij het reguleren van de immuungenen van de gastheren zijn echter niet goed gerapporteerd in vergelijking met de eiwitcoderende genen.

CircRNA's worden op grote schaal gekenmerkt door hun covalent gesloten continue lusstructuur, die wordt gegenereerd door een niet-canoniek splicingproces dat back-splicing8 wordt genoemd. Het proces van back-splicing, in tegenstelling tot het splicingproces van verwante lineaire RNA's, omvat de ligatie van de downstream donorplaats naar de upstream acceptorplaats, waardoor een cirkelvormige structuur wordt gevormd. Momenteel zijn drie verschillende back-splicing mechanismen voor de biogenese van circRNA's voorgesteld. Dit zijn RNA binding protein (RBP) gemedieerde circularisatie9,10, intron-pairing-gedreven circularisatie 11 en lariat-gedreven circularisatie12,13,14. Aangezien circRNA's end-to-end verbonden zijn in een cirkelvormige structuur, hebben ze de neiging om van nature resistent te zijn tegen normale exonuclease-verteringen en worden ze daarom als stabieler beschouwd dan hun lineaire tegenhangers15. Een ander gemeenschappelijk kenmerk van circRNA's omvat de cel- of weefseltypespecifieke expressie in gastheren16.

Zoals geïmpliceerd door hun unieke structuur en cel- of weefselspecifieke expressie, is ontdekt dat circRNA's belangrijke biologische functies in cellen spelen. Tot op heden is een van de prominente functies van circRNA's hun rol als microRNA (miRNA) sponzen17,18. Deze regulerende rol van circRNA's vindt plaats door de complementaire binding van circRNA-nucleotiden met het zaadgebied van miRNA's. Een dergelijke circRNA-miRNA-interactie remt de normale regulerende functies van de miRNA's op doel-mRNA's, waardoor de expressie van genenwordt gereguleerd 19,20. Bovendien is ook bekend dat circRNA's genexpressie reguleren door interactie met RNA-bindende eiwitten (RBP's) en het vormen van RNA-eiwitcomplexen21. Hoewel circRNA's worden geclassificeerd als niet-coderende RNA's, zijn er ook aanwijzingen dat circRNA's kunnen fungeren als sjablonen voor eiwittranslatie22,23,24.

Onlangs is aangetoond dat circRNA's een cruciale rol spelen bij het reguleren van de gastheer-pathogeen interacties, met name tussen de gastheren en virussen. Over het algemeen wordt aangenomen dat gastheercircRNA's helpen bij het reguleren van de immuunresponsen van de gastheer om de binnendringende pathogenen te elimineren. Een voorbeeld van circRNA dat immuunresponsen van de gastheer bevordert, is circRNA_0082633, gerapporteerd door Guo et al.25. Dit circRNA verbetert type I interferon (IFN) signalering in A549-cellen, wat helpt om influenzavirusreplicatiete onderdrukken 25. Bovendien rapporteerden Qu et al. ook een humaan intronisch circRNA, circRNA AIVR genaamd, dat de immuniteit bevordert door de expressie van CREB-bindend eiwit (CREBBP), een signaaltransducer van IFN-β26,27, te reguleren. Er bestaan echter ook circRNA's waarvan bekend is dat ze de pathogenese van ziekte bij infectie bevorderen. Yu et al. rapporteerden bijvoorbeeld onlangs de rol die een circRNA uit het GATA-zinkvingerdomein met het 2A-gen (circGATAD2A) speelt bij het bevorderen van de replicatie van het H1N1-virus door de remming van autofagie van de gastheercel28.

Om circRNA's effectief te bestuderen, wordt meestal een genoombreed circRNA-voorspellingsalgoritme geïmplementeerd, gevolgd door een in silico-karakterisering van de voorspelde circRNA-kandidaten voordat functionele studies kunnen worden uitgevoerd. Een dergelijke bioinformatica-benadering om circRNA's te voorspellen en te karakteriseren is minder kostbaar en tijdsefficiënter. Het helpt om het aantal kandidaten dat functioneel moet worden bestudeerd te verfijnen en kan mogelijk leiden tot nieuwe bevindingen. Hier bieden we een gedetailleerd op bioinformatica gebaseerd protocol voor de in silico-identificatie , karakterisering en functionele annotatie van circRNA's tijdens de gastheer-pathogeen interacties. Het protocol omvat de identificatie en kwantificering van circRNA's uit RNA-sequencing datasets, annotatie via circBase en de karakterisering van de circRNA-kandidaten in termen van circRNA-typen, aantal overlappende genen en voorspelde circRNA-miRNA-interacties. Deze studie biedt ook de functionele annotatie van de circRNA-oudergenen via Gene Ontology (GO) en de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werden gedeïdentificeerde ribosomale RNA (rRNA)-uitgeputte RNA-seq bibliotheek datasets bereid uit de influenza A virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen gedownload en gebruikt uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database. De volledige bioinformatica-pijplijn van voorspelling tot functionele karakterisering van circRNA's is samengevat in figuur 1. Elk deel van de pijplijn wordt verder uitgelegd in de onderstaande secties.

1. Voorbereiding, download en setup vóór gegevensanalyse

OPMERKING: Alle softwarepakketten die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn gratis en open-source.

  1. De vereiste tools downloaden op het Linux-platform
    1. Download en installeer de vereiste software en hulpprogramma's die worden vermeld in de materiaaltabel op een krachtige Linux-computer aan de hand van de instructies van de ontwikkelaar.
      OPMERKING: De meeste tools en software hebben hun eigen online GitHub-pagina's of documentatie met instructies voor het installeren en gebruiken van hun tools (raadpleeg de Materiaaltabel).
    2. Download de gewenste RNA-seq datasets voor circRNA detectie en analyse van sequence archive websites (bijv. European Nucleotides Archive en Gene Expression Omnibus).
    3. Download de referentiegenoom(s) (FASTA-indeling) en annotatiebestanden (GTF/GFF3-indeling), compatibel met de host waaruit de RNA-seq-dataset is samengesteld. Hostreferentiegenoom (en) en annotatiebestanden zijn meestal te vinden op online genoombrowsers zoals het National Center for Biotechnology Information (NCBI), de University of California Santa Cruz (UCSC) en de Ensembl-websites.
  2. Kwaliteitscontrole van RNA-seq
    1. Voer de FASTQ-bestanden in het FASTQC-programma in om de kwaliteit van RNA-sequenties te bepalen. Als de kwaliteit van de FASTQ-bestanden laag is (bijv. 29,30.

2. Voorspelling en differentiële expressieanalyse van circRNA's met behulp van CIRIquant

OPMERKING: Een meer gedetailleerde handleiding voor het installeren en uitvoeren van differentiële expressieanalyse is te vinden in de sectie codebeschikbaarheid van het CIRIquant-artikel31. De aanvullende gegevens omvatten ook enkele van de basiscommando's die in dit protocol worden gebruikt.

  1. CircRNA voorspellingen
    1. Indexeer eerst het referentiegenoom van de gastheer met behulp van BWA- en HISAT2-aligners. Voer vervolgens op een Linux-terminal de opdrachten bwa index 32 en hisat2-build33 uit in de map van het referentiegenoom van de host om het te indexeren.
    2. Bereid vervolgens een YML-configuratiebestand voor met de naam van het bestand, het pad van tools (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), het pad naar de gedownloade referentiebestanden (FASTA-bestanden van het referentiegenoom van de host, annotatiebestanden) en het pad naar de indexbestanden uit stap 2.1.1.
    3. Voer de CIRIquant-tool uit vanaf de terminal met behulp van de standaard- of handmatige parameters. De gebruiker kan het bibliotheektype (gestrand of niet-gestrand) van de RNA-seq-gegevens opgeven bij het uitvoeren van de CIRIquant-tool.
      OPMERKING: Het bibliotheektype van de RNA-seq-gegevens kan worden bepaald door het type bibliotheekvoorbereidingskit te kennen dat wordt gebruikt. Als de identiteit van de bibliotheekvoorbereidingskit onbekend is, kan een RNA-seq-controlebio-informaticapakket genaamd RSeQC36 worden gebruikt om de gestrandheid van RNA-seq-gegevens te bepalen.
  2. Differentiële expressieanalyse
    OPMERKING: CIRIquant-pakket bevat prep_CIRIquant, prepDE.py en CIRI_DE_replicate; Daarom zijn er geen extra downloads nodig voor deze drie tools.
    1. Bereid een tekstbestand (.lst) voor met een lijst met gegevens die het volgende bevatten:
      1ekolom : ID's van de RNA-seq-gegevens die in stap 2.1.3 zijn gebruikt
      2e kolom: pad naar de GTF-bestanden die door CIRIquant zijn uitgevoerd
      3e kolom: groepering van de RNA-seq data, of het nu een controle of behandelde groep is.
    2. Zie tabel 1 hieronder voor een voorbeeld.
      OPMERKING: Het is niet nodig om de kopteksten in te voeren, omdat ze alleen ter referentie zijn.
    3. Voer op de Linux-terminal prep_CIRIquant uit met het tekstbestand (.lst) dat is voorbereid in stap 2.2.1 als invoer. De run genereert een lijst met bestanden: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv en circRNA_ratio.csv.
    4. Bereid een tweede tekstbestand voor met een lijst met gegevens die de RNA-seq-ID's en het pad naar hun respectieve StringTie-uitvoer bevatten. De bestandslay-out moet vergelijkbaar zijn met het tekstbestand in stap 2.2.1 zonder de kolom groeperen.
    5. Voer prepDE.py uit met het tekstbestand dat is voorbereid in stap 2.2.4 als invoer om de matrixbestanden voor het aantal genen te genereren.
    6. Voer CIRI_DE_replicate uit met de library_info.csv - en circRNA_bsj.csv-bestanden uit stap 2.2.3 en het gene_count_matrix.csv-bestand uit stap 2.2.5 als invoer om het uiteindelijke circRNA_de.tsv-bestand uit te voeren.
  3. Filteren van DE-circRNA's
    1. Gebruik R (in de computerterminal of RStudio) of een spreadsheetsoftware (bijvoorbeeld Microsoft Excel) om het circRNA_de.tsv-bestand te openen dat is gegenereerd uit stap 2.2.6 om het aantal differentieel uitgedrukte (DE) circRNA's te filteren en te bepalen.
    2. Filter de DE-circRNA's volgens de criteria LogFC > |2| en FDR < 0,05.
    3. Maak een bestand met de naam DE_circRNAs.txt om de informatie van DE-circRNA's op te slaan.

3. Karakterisering en annotatie van voorspelde DE-circRNA's

  1. Annotatiestatus van DE-circRNA's
    1. Laad het bestand met de naam DE_circRNAs.txt in RStudio , dat bestaat uit de lijst met DE-circRNA's die zijn gefilterd uit stap 2.3.3. Neem andere informatie op, zoals de genomische posities (Chr, Start, End), strengoriëntaties (+ of -), gennaam en circRNA-type. Voordat u verder gaat, converteert u de circRNA genomische startcoördinaten van CIRIquant naar 0-gebaseerd door 1 basenpaar af te trekken.
      OPMERKING: De andere hierboven vermelde informatie kan worden verkregen uit de GTF-bestanden die zijn uitgevoerd door CIRIquant (Aanvullend Bestand 1).
    2. Bepaal de annotatiestatus van de voorspelde DE-circRNA's door een bibliotheek te downloaden met de genomische posities van de circRNA-database (bijv. circBase) gedeponeerde circRNA's.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de genoomversie die wordt gebruikt om de circRNA's te voorspellen identiek is aan de circRNA-databasebibliotheek voordat u de vergelijking maakt. Het circBase-gegevensbestand dat hier wordt gebruikt, is vrij beschikbaar in de schijfmap in Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37.
    3. Zodra beide bestanden uit stap 3.1.1 en stap 3.1.2 zijn voorbereid, voert u het R-script uit dat wordt gegeven in Aanvullend bestand 1. Chromosomale locaties van DE-circRNA's worden opgevraagd bij de bibliotheek voordat de status Geannoteerd of Niet-geannoteerd wordt toegewezen.
  2. Karakterisering van DE-circRNA's
    1. Gebruik R en andere spreadsheetsoftware om het aantal circRNA's samen te vatten volgens de circRNA-typen (d.w.z. exon, intron, intergeen en antisense) en het aantal genen dat de circRNA's overspannen (1 of >1) (aanvullend bestand 1).OPMERKING: CIRIquant kan slechts vier soorten circRNA's detecteren (exon, intron, intergeen en antisense). Exon-intron circRNA's, ook bekend als ElciRNA's, kunnen niet worden gedetecteerd door CIRIquant.

4. Het voorspellen van de circRNA-miRNA interactie met behulp van Circr

OPMERKING: Een meer gedetailleerde handleiding over het installeren en gebruiken van Circr voor de circRNA-miRNA-interactieanalyse is te vinden op: https://github.com/bicciatolab/Circr37.

  1. Voorbereiding van dossiers
    1. Pak de inhoud van het Circr.zip-bestand uit en pak het uit nadat u het hebt gedownload van de Circr GitHub-pagina met behulp van de relevante software zoals "WinRar" of "7-zip" in een nieuwe map waar de analyse zal worden uitgevoerd.
    2. Installeer de vereiste softwaretoepassingen (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools en samtools) voordat u de circRNA-miRNA-analyse uitvoert.
    3. Referentiegenomen en annotatiebestanden voor verschillende organismen van belang, rRNA-coördinatenbestand, gevalideerd miRNA-interactiebestand en circRNA-bestanden circRNA-bestanden worden geleverd door de Circr-auteur op de Github-pagina (https://github.com/bicciatolab/Circr)37. Nadat u op de ondersteuningsbestanden in de stationsmap hebt geklikt, selecteert u de map voor het gewenste organisme, de miRNA-map en het circBase-tekstbestand en downloadt u deze.
    4. Na het downloaden van de benodigde bestanden in stap 4.1.3, maakt u een nieuwe map met de naam support_files in de map die wordt vermeld in stap 4.1.1. Pak vervolgens de inhoud uit en pak deze uit in de map support_files .
    5. Indexeer het referentiegenoombestand van het organisme van belang met behulp van het samtools faidx-commando (aanvullend bestand 1).
    6. Bereid een invoerbestand voor dat bestaat uit de coördinaten van DE-circRNA's van belang in een door tabs gescheiden BED-bestand, zoals weergegeven in tabel 2.
      OPMERKING: Omdat circRNA's voorspeld door CIRIquant niet op 0 zijn gebaseerd, is het noodzakelijk om min 1 bp te zijn op de begincoördinaat (zoals vermeld in stap 3.1.1) voordat ze worden geconverteerd naar het BED-formaat. De headers in tabel 2 zijn slechts ter referentie en zijn niet nodig in de BED-bestanden.
    7. Zorg er op dit punt voor dat de verwachte mapstructuur voor Circr-analyse is zoals in figuur 2.
  2. Hardlopen Circr.py
    1. Voer Circr.py uit met Python 3 en geef als argumenten het circRNA-invoerbestand, het FASTA-genoom van het gewenste organisme, de genoomversie van het geselecteerde organisme, het aantal threads en de naam van het uitvoerbestand op de opdrachtregel op.
    2. Als het organisme van belang niet is opgenomen in de stationsmap die wordt vermeld in stap 4.1.3 of als de gebruiker liever een aangepaste set bestanden heeft om de analyse uit te voeren, moeten aanvullende opdrachten die de locatie van deze bestanden specificeren, worden opgenomen bij het uitvoeren van Circr.py.
    3. Nadat de Circr-analyse is voltooid, voert het programma een circRNA-miRNA-interactiebestand uit in het csv-formaat.
    4. Filter de circRNA-miRNA interactieresultaten op basis van de gebruikersspecifieke voorkeur. Voor deze studie worden de voorspellingen gefilterd met behulp van Rstudio volgens de onderstaande criteria:
      -Gedetecteerd door alle drie de softwaretools
      -Twee of meer bindingssites gerapporteerd door zowel Targetscan als miRanda
      -Geïdentificeerd in de kolommen "AGO" of "gevalideerd"
      -Filter geen interacties tussen zaadregio's uit
    5. Schrijf de circRNA's die de gefilterde voorwaarden uit stap 4.2.3 doorgeven naar een nieuw tekstbestand met de naam circRNA_miRNA.txt. Een dergelijke filtering kan het vertrouwen van de voorspelde interacties vergroten.

5. Aanleg van het ceRNA-netwerk

OPMERKING: Een gedetailleerde handleiding voor het gebruik van Cytoscape is te vinden op: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ en https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

  1. Download en voorbereiding
    1. Download de nieuwste versie van Cytoscape38 van: https://cytoscape.org/download.html.
    2. Voer de installatiewizard uit die is gedownload in stap 5.1.1 en selecteer de bestandslocatie voor de Cytoscape-software.
    3. Bereid een door tabs gescheiden bestand voor met de circRNA's van belang en hun doel-miRNA. De eerste kolom bestaat uit de circRNA-naam; de tweede kolom specificeert het type RNA uit de eerste kolom; de derde kolom is het doel-miRNA; en de vierde kolom specificeert het type RNA uit de derde kolom. Een voorbeeld van het bestand is weergegeven in tabel 3.
  2. Het construeren van de ceRNA-netwerkkaart
    1. Open de Cytoscape-software die is geïnstalleerd in stap 5.1.2.
    2. Navigeer in Cytoscape naar Bestand > Importeer > netwerk uit Bestand. Selecteer het bestand dat is voorbereid in stap 5.1.3.
    3. Selecteer in het nieuwe tabblad de eerste en tweede kolom als "Bronknooppunt" en "Bronknooppuntkenmerk" terwijl u de derde en vierde kolom selecteert als respectievelijk "Doelknooppunt" en "Doelknooppuntkenmerk". Klik op OK en het netwerk verschijnt rechtsboven in Cytoscape.
    4. Om de visuele stijl van het netwerk te wijzigen, drukt u op de knop Stijl aan de linkerkant van Cytoscape.
    5. Druk op de pijl aan de rechterkant van Vulkleur. Kies Type voor de kolom en Discrete toewijzing voor het toewijzingstype. Selecteer vervolgens de gewenste kleur voor elk van de RNA-typen.
    6. Nadat u de kleur hebt gewijzigd, wijzigt u de vorm van de knooppunten door naar Vorm te gaan en stap 5.2.5 te volgen.

6. Functionele verrijkingsanalyse

  1. Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyse voor het oudergen van de circRNA's
    1. Zorg ervoor dat de clusterProfiler 39,40 en org. Hs.eg.db41 pakketten zijn geïnstalleerd in Rstudio. De organisatie. Hs.eg.db41-pakket is een genoombreed annotatiepakket alleen voor mensen. Als het organisme van belang een andere soort is, raadpleegt u: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
    2. Importeer de DE_circRNA informatie uit stap 2.3.1 in de Rstudio-werkruimte.
    3. Gebruik het oudergen van de circRNA's in dit bestand voor verrijkingsanalyse in de komende stappen. Als de gebruiker het gensymbool echter wil converteren naar andere formaten, zoals de Entrez-ID, gebruik dan een functie zoals "bitr".
    4. Door de gen-ID als invoer te gebruiken, voert u de GO-verrijkingsanalyse uit met behulp van de enrichGO-functie in het clusterProfiler 39,40-pakket met behulp van standaardparameters.
    5. Door de gen-ID als invoer te gebruiken, voert u de KEGG-verrijkingsanalyse uit met behulp van de enrichKEGG-functie binnen het clusterProfiler 39,40-pakket met behulp van de standaardparameters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol dat in de vorige sectie is ingeschakeld, is aangepast en geconfigureerd voor het Linux OS-systeem. De belangrijkste reden is dat de meeste modulebibliotheken en pakketten die betrokken zijn bij de analyse van circRNA's alleen op het Linux-platform kunnen werken. In deze analyse werden gedeïdentificeerde ribosomale RNA (rRNA)-uitgeputte RNA-seq bibliotheekdatasets bereid uit de influenza A-virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen gedownload uit de GEO-database42 en gebruikt om de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het nut van dit protocol te illustreren, werd RNA-seq van influenza A-virus-geïnfecteerde menselijke macrofaagcellen als voorbeeld gebruikt. CircRNA's die functioneren als potentiële miRNA-sponzen in gastheer-pathogeen interacties en hun GO- en KEGG-functionele verrijking binnen een gastheer werden onderzocht. Hoewel er verschillende circRNA-tools online beschikbaar zijn, is elk van hen een op zichzelf staand pakket dat niet met elkaar communiceert. Hier hebben we enkele van de tools samengesteld die nodig zijn voor c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur wil Tan Ke En en Dr. Cameron Bracken bedanken voor hun kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Fundamental Research Grant Scheme (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) en University of Malaya High Impact Research Grant (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BedtoolsGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/Verwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr.
BWABurrows-Wheeler Alignerhttp://bio-bwa.sourceforge.net/Verwijzend naar sectie 2.1.1 en 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren en om het genoom te indexeren
CircrGitHubhttps://github.com/bicciatolab/CircrVerwijzend naar sectie 4. Gebruik om de miRNA-bindingsplaatsen te voorspellen
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantVerwijzend naar sectie 2.1.3. Om circRNA's te voorspellen
ClusterprofilerGitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerVerwijzend naar sectie 7. Voor GO en KEGG functionele verrijking
CPUIntel Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Kernen: 6-core CPU Geheugen: 65 GB Grafische kaart: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) Specificaties gebruikt om dit hele protocol uit te voeren.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlVerwijzend naar sectie 5.2. Nodig om ceRNA-netwerk te plotten
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Verwijzend naar sectie 1.2.1. Kwaliteitscontrole op Fastq-bestanden
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/Verwijzend naar sectie 2.1.1 en 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren en om het genoom te indexeren
LinuxUbuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)https://releases.ubuntu.com/focal/Nodig om het hele protocol uit te voeren. Andere Ubuntu-versies kunnen nog steeds geldig zijn om het protocol uit te voeren.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doVerwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr
Pybedtoolspybedtools 0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/Nodig voor genomische manipulatie van BED-bestanden
PythonPython 2.7 en 3.6 of hogerhttps://www.python.org/downloads/Om noodzakelijke bibliotheekmodules uit te voeren
RThe Comprehensive R Archive Networkhttps://cran.r-project.org/Om dataframes te manipuleren
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridVerwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr
RStudioRStudiohttps://www.rstudio.com/Een werkruimte om R uit te voeren
samtools SAMtoolshttp://www.htslib.org/Verwijzend naar sectie 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren
StringTieJohns Hopkins University: Center for Computational Biologyhttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlVerwijzend naar sectie 2.1.2. Nodig om CIRIquant uit te voeren
TargetScanGitHubhttps://github.com/nsoranzo/targetscanVerwijzend naar sectie 4.1.2. Nodig voor Circr

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024(2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454(2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081(2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806(2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540(2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659(2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15(2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390(2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721(2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483(2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90(2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834(2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141(2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. Carlson, M. org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0. , Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022).
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178(2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87(2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20(2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), New York, N.Y. 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138(2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1(2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106(2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Circulaire RNA sdifferenti le expressieRNA sequencingbio informatica analysevoorspelling van circRNAkarakterisering van circRNAGene Ontology analyseKEGG verrijkingcircRNA miRNA interactie

Gerelateerde artikelen