Methodenartikel

Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

DOI:

10.3791/64573

⸱

23 december 2022

 ,  ,  , 
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze studie is om de haalbaarheid van op flotatie gebaseerde scheiding aan te tonen om primaire menselijke T-cellen te isoleren, activeren en uitbreiden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het proces van het isoleren van T-cellen uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) om ex vivo culturen vast te stellen, is cruciaal voor onderzoek, klinische tests en celgebaseerde therapieën. In deze studie wordt een eenvoudig, nieuw protocol gepresenteerd om T-cellen ex vivo te isoleren, activeren en uitbreiden van PBMC's. Deze studie maakt gebruik van gefunctionaliseerde buoyancy-activated cell sorting (BACS) -technologie om T-cellen te isoleren en te activeren. In het kort omvat het protocol de positieve selectie van CD3 + -cellen uit van leukopak afgeleide PBMC's, gevolgd door een 48 uur co-stimulatie met voorgeconjugeerde anti-CD28-gebonden streptavidin microbubbels (SAMBs) voorafgaand aan transductie in 24-well platen. Gefunctionaliseerde microbubbels bieden een unieke kans om cellen te activeren, wat leidt tot proliferatieve fenotypen die expansie mogelijk maken met minimale uitputting. Deze techniek biedt verminderde uitputting omdat de co-stimulerende microbubbels drijvend blijven en terugkeren naar de top van het kweekmedium, waardoor de hoeveelheid tijd dat de expanderende cellen in contact komen met de co-stimulerende factoren wordt verminderd. De resultaten geven aan dat de geïsoleerde en gekweekte T-cellen voldoende stimulatie ontvangen om te activeren en te prolifereren, maar niet in een mate die leidt tot overactivatie, wat vervolgens leidt tot uitputting, zoals aangetoond door de aanwezigheid van overmatige PD-1.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meer dan 500 chimere antigeenreceptor (CAR)-T celtherapie klinische studies worden momenteel over de hele wereld uitgevoerd, en vier CAR-T celtherapie producten zijn beschikbaar op de markt1. Er bestaan echter nog steeds tal van CAR-T-celonderzoeks- en productiebehoeften die moeten worden aangepakt om de werkzaamheid, schaalbaarheid en het succes op lange termijn van deze potentieel curatieve therapieën te verbeteren 2,3,4,5. Adoptief CAR-T-cel klinisch onderzoek en productie begint met T-celisolatie uit een perifeer bloedmonster en de daaropvolgende stimulatie, transductie en uitbreiding van de geïsoleerde cellen. Parameters zoals T-celherstel, zuiverheid en activerings- / uitputtingssignalen vereisen zorgvuldige overweging bij het kiezen van de celisolatie- en stimulatietechnieken voor CAR-T-celonderzoek en productie 3,4,6. Belangrijk is dat verbetering van de therapeutische persistentie van CAR-T-celtherapieën door het minimaliseren van de biologische belemmeringen die het gevolg zijn van de huidige productieprocessen, zoals T-celuitputting, nodig is om de therapeutische werkzaamheid te verbeteren 6,7.

Als alternatief voor traditionele celisolatiemethoden zoals fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS), wordt hier buoyancy-activated cell sorting (BACS) met microbubbels voor T-celisolatie gedemonstreerd. Microbubbelscheiding maakt gebruik van drijvende, holle microsferen (microbubbels) om de doelen te binden en ze naar het oppervlak van vloeistofmonsters telaten drijven 8,9. Door microbubbels te functionaliseren met antilichamen (d.w.z. anti-CD3), kunnen de gewenste T-celpopulaties positief worden geselecteerd uit perifere bloedmonsters. Vervolgens wordt het gebruik van een andere populatie van antilichaam-gefunctionaliseerde microbubbels (d.w.z. anti-CD28) om positief geselecteerde T-cellen in suspensie te co-stimuleren en te activeren in dit werk aangetoond. Microbubbels bieden een eenvoudige en zeer instelbare isolatie- en activeringsworkflow die T-cellen genereert die klaar zijn voor zwevende celkweek en downstream-toepassingen zoals genetische modificatie en expansie. Van cruciaal belang is dat drijvende celactivering met microbubbels terughoudende celstimulatie bevordert om overmatige T-celuitputting te voorkomen7.

Voor deze studie was flowcytometrie het primaire hulpmiddel dat werd gebruikt om het isolatie-, activerings- en transductiesucces van de gefunctionaliseerde microbubbels te analyseren, evenals om gedetailleerde informatie te verstrekken over de specifieke subpopulaties die aanwezig zijn tijdens de groei- en expansiefasen na transductie. Naast flowcytometrie werden brightfield- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de celgezondheid, morfologie en transductiesucces te bevestigen. Op basis van deze resultaten bieden de microbubbeltechnologie en het protocol een afstembaarder en zachter alternatief voor de traditionele isolatie- en activeringsmethoden die momenteel worden gebruikt; in het bijzonder vertonen microbubbel-geactiveerde cellen een aanzienlijk lagere expressie van T-celuitputtingsmarkers dan die gewoonlijk wordt waargenomen met industriestandaard tools en kits.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolatie van T-cellen met microbubbels met behulp van positieve selectie

OPMERKING: Dit protocol beschrijft een kleinschalige CD3+ positieve selectiebenadering met samb's.

  1. Incubeer 3 x 108 commercieel verkregen PBMC's in 2,5 ml scheidingsbuffer met gebiotinyleerd anti-CD3 (OKT3) antilichaam in een concentratie van 25 ng antilichaam per 1 miljoen cellen (25 ng / M). Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Voeg streptavidin microbubbels (SIB's) toe in een verhouding van 0,5 (SAMB-hoeveelheid):1 (celhoeveelheid) volgens de door de fabrikant gerapporteerde SAMB-concentratie.
  3. Meng met behulp van een commerciële end-over-end (EOE) rotator bij 20 rpm gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur.
  4. Na centrifugatie bevinden de positief geselecteerde cellen zich aan de bovenkant van de suspensie met de SAMB's. De resterende niet-geselecteerde cellen bevinden zich in de celpellet aan de onderkant van de buis. Gebruik een 9 in glazen pipet, steek de punt onder de bubbelcellaag naar de bodem van de buis, adem de celpellet en subnatant op met een elektronische pipet en breng ze over naar een nieuwe buis.

2. Co-stimulatie (activering) van de positief geselecteerde T-cellen

  1. Resuspendeer de bellencellaag die in de oorspronkelijke buis achterblijft in 1 ml volledig T-celmedium (of een ander gewenst medium).
  2. Tel de cellen in het subnatant met brightfield-microscopie met behulp van een geautomatiseerde celteller en trek deze waarde af van het begincelnummer om het aantal cellen te bepalen dat in de bellencellaag is vastgelegd.
  3. Meng voorafgaand aan deze stap het gebiotinyleerde anti-CD28-antilichaam met commerciële SAMB's gedurende minimaal 2 uur om de geconjugeerde anti-CD28 SAMB's te maken. Neem contact op met de SAMB-fabrikant om de hoeveelheid anti-CD28-antilichaam te bepalen die nodig is voor conjugatie. Voeg de anti-CD28 geconjugeerde SIB's toe aan de bellencelsuspensie die het resultaat is van stap 2.1 met een verhouding van 1,5 (anti-CD28 SIB's):1 (cellen).
  4. Meng met behulp van EOE-rotatie gedurende 15 minuten en pas vervolgens het totale volume aan op 2 miljoen cellen per ml met volledig T-celmedium of een ander gewenst medium volgens het celnummer dat is verkregen in stap 2.2.

3. Expansie van de mede gestimuleerde cellen in celkweekmedium

  1. Verdeel 1 ml geactiveerde cellen uit stap 2.4 in een concentratie van 2 M/ml per put in een plaat met 24 putten. Incubeer in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 °C.
  2. Voeg na 24 uur 50 U/ml IL-2 en 25 ng/M oplosbare anti-CD3 (OKT3) toe om de expansie verder te stimuleren, zoals berekend met behulp van het initiële aantal cellen dat op dag 0 is verguld. Plaats de celplaat terug in de bevochtigde CO2-incubator en laat deze een nacht incuberen bij 37 °C.

4. Optioneel: Transductie van geactiveerde T-cellen met lentivirus

OPMERKING: De hier gehanteerde aanpak is overgenomen van Prommersberger et al. 10.

  1. Ontdooi het lentivirus bij kamertemperatuur en meng kort door pipetteren.
  2. Verwijder voorzichtig de mid-natant, 600 μL uit elke put, zonder de dochtercellen aan te raken die zich nu op de bodem van de put bevinden of de bellenlaag die aan het oppervlak van de oplossing is achtergebleven.
  3. Voeg 5 μg/ml hexadimethrinebromide per put toe om de virale transductie te verbeteren. Voeg de lentivirale deeltjes toe bij een veelheid van infectie (MOI) van 3 (lentivirale deeltjes per cel).
  4. Centrifugeer de plaat gedurende 45 minuten bij 800 x g en 32 °C met langzame versnelling en geen pauze voor vertraging. Incubeer de cellen gedurende 4 uur in een bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C.
  5. Voeg na 4 uur 600 μL in de handel verkrijgbaar, vers compleet T-celmedium en 50 U/ml IL-2 toe aan elke put en plaats de celplaat terug in de bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C voor T-celexpansie.

5. Expansie van de T-cellen (met of zonder voorafgaande transductie)

  1. Verwijder om de 2 dagen de helft van het medium uit het middennatuur, vervang het door een vers, compleet T-celmedium en voeg IL-2 toe in een concentratie van 50 U / ml.
  2. Tel de T-cellen twee keer per week om de celdichtheid te beoordelen. Wanneer de celdichtheid groter is dan 2 x 10 6-2,5 x 106 cellen / ml, breng de cellen over in een groter vat en verdun ze tot 5 x 105 cellen / ml.

6. Oogsten van de T-cellen en flowcytometrie

  1. Meng voorzichtig de inhoud van elk putje door op en neer te pipetteren. Verwijder de volledige inhoud van de put, inclusief de microbubbels, en breng ze over in een buis van 1,5 ml.
  2. Was elk putje met 400 μL calciumvrije en magnesiumvrije DPBS (−/−) en breng de oplossing over in een buis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Aspirateer het supernatant en resuspenseer de celpellet in 50 μL scheidingsbuffer.
  4. Beits met een activerings- en uitputtingsantilichaam / kleuringscocktail en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Bereid de vlekkende cocktails als volgt- activeringscocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; uitlaat cocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. Voeg 1 ml scheidingsbuffer toe en meng voorzichtig. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om overtollige antilichamen uit te spoelen. Adem het supernatant volledig op.
  6. Resuspendeer de celpellet in 1 ml scheidingsbuffer en breng over naar een geschikt vat (bijv. Een FACS-buis, een 96-well-plaat, enz.) voor de flowcytometrie-analyse. Het aanbevolen gatingschema voor flowcytometrieanalyse is gedetailleerd beschreven in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T-cellen werden geïsoleerd uit gekochte PBMC's en verguld voor activering zoals beschreven in het protocol. De negatieve controlemonsters (gekochte PBMC's) werden niet geactiveerd. Deze controlemonsters werden opgenomen om het effect aan te tonen dat het microbubbelactiveringsproces had op de experimentele monsters in vergelijking met de onaangeroerde en niet-gestimuleerde T-celcontroles, om ervoor te zorgen dat de waargenomen activeringsmarkers het resultaat waren van de toegevoegde activeringsfactoren en niet inherent ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol maakt de isolatie van T-cellen uit PBMC-monsters en de activering van gesuspendeerde T-cellen in kweekmedia met microbubbels mogelijk. Deze methode is gebaseerd op gefunctionaliseerde microbubbels waarvan het inherente drijfvermogen een unieke kans biedt om co-stimulerende signalen in cellen te introduceren en ze te activeren terwijl ze in een kweekmedium zijn gesuspendeerd, waardoor de blootstelling van de uitdijende cellen aan langdurige stimulatie wordt verminderd; een dergelijke overstimulatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs zijn op het moment van indiening werknemers van Akadeum Life Sciences, dat microbubbelscheidingsproducten produceert en verkoopt.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-MercaptoethanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well platesVWR 76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) AntibodyBiolegend302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) AntibodyBiolegend317320
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190-136
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061
Human Recombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCsBioIVTHUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue cultureVWR97063-708CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection ReagentMillipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat InactivatedInnovative ResearchISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPESGibco72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)Akadeum11110-000
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

T Cell IsolationMicrobubble ActivationPeripheral Blood MononuclearT Cell ExpansionBuoyancy Activated Cell SortingCD3 Positive SelectionAnti CD28 MicrobubblesFlow CytometryT Cell ExhaustionActivation Marker CD69

Gerelateerde artikelen