Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels

Summary

Het doel van deze studie is om de haalbaarheid van op flotatie gebaseerde scheiding aan te tonen om primaire menselijke T-cellen te isoleren, activeren en uitbreiden.

Abstract

Het proces van het isoleren van T-cellen uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) om ex vivo culturen vast te stellen, is cruciaal voor onderzoek, klinische tests en celgebaseerde therapieën. In deze studie wordt een eenvoudig, nieuw protocol gepresenteerd om T-cellen ex vivo te isoleren, activeren en uitbreiden van PBMC's. Deze studie maakt gebruik van gefunctionaliseerde buoyancy-activated cell sorting (BACS) -technologie om T-cellen te isoleren en te activeren. In het kort omvat het protocol de positieve selectie van CD3 ⁺ -cellen uit van leukopak afgeleide PBMC's, gevolgd door een 48 uur co-stimulatie met voorgeconjugeerde anti-CD28-gebonden streptavidin microbubbels (SAMBs) voorafgaand aan transductie in 24-well platen. Gefunctionaliseerde microbubbels bieden een unieke kans om cellen te activeren, wat leidt tot proliferatieve fenotypen die expansie mogelijk maken met minimale uitputting. Deze techniek biedt verminderde uitputting omdat de co-stimulerende microbubbels drijvend blijven en terugkeren naar de top van het kweekmedium, waardoor de hoeveelheid tijd dat de expanderende cellen in contact komen met de co-stimulerende factoren wordt verminderd. De resultaten geven aan dat de geïsoleerde en gekweekte T-cellen voldoende stimulatie ontvangen om te activeren en te prolifereren, maar niet in een mate die leidt tot overactivatie, wat vervolgens leidt tot uitputting, zoals aangetoond door de aanwezigheid van overmatige PD-1.

Introduction

Meer dan 500 chimere antigeenreceptor (CAR)-T celtherapie klinische studies worden momenteel over de hele wereld uitgevoerd, en vier CAR-T celtherapie producten zijn beschikbaar op de markt¹. Er bestaan echter nog steeds tal van CAR-T-celonderzoeks- en productiebehoeften die moeten worden aangepakt om de werkzaamheid, schaalbaarheid en het succes op lange termijn van deze potentieel curatieve therapieën te verbeteren 2,3,4,5. Adoptief CAR-T-cel klinisch onderzoek en productie begint met T-celisolatie uit een perifeer ....

Protocol

1. Isolatie van T-cellen met microbubbels met behulp van positieve selectie

OPMERKING: Dit protocol beschrijft een kleinschalige CD3⁺ positieve selectiebenadering met samb's.

1. Incubeer 3 x 10⁸ commercieel verkregen PBMC's in 2,5 ml scheidingsbuffer met gebiotinyleerd anti-CD3 (OKT3) antilichaam in een concentratie van 25 ng antilichaam per 1 miljoen cellen (25 ng / M). Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
2. Voeg streptavidin microbubbels (SIB's) toe in een verhouding van 0,5 (SAMB-hoeveelheid):1 (celhoeveelheid) volgens d....

Results

T-cellen werden geïsoleerd uit gekochte PBMC's en verguld voor activering zoals beschreven in het protocol. De negatieve controlemonsters (gekochte PBMC's) werden niet geactiveerd. Deze controlemonsters werden opgenomen om het effect aan te tonen dat het microbubbelactiveringsproces had op de experimentele monsters in vergelijking met de onaangeroerde en niet-gestimuleerde T-celcontroles, om ervoor te zorgen dat de waargenomen activeringsmarkers het resultaat waren van de toegevoegde activeringsfactoren en niet inherent .......

Discussion

Het beschreven protocol maakt de isolatie van T-cellen uit PBMC-monsters en de activering van gesuspendeerde T-cellen in kweekmedia met microbubbels mogelijk. Deze methode is gebaseerd op gefunctionaliseerde microbubbels waarvan het inherente drijfvermogen een unieke kans biedt om co-stimulerende signalen in cellen te introduceren en ze te activeren terwijl ze in een kweekmedium zijn gesuspendeerd, waardoor de blootstelling van de uitdijende cellen aan langdurige stimulatie wordt verminderd; een dergelijke overstimulatie.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000