Methodenartikel

Popliteale vasculaire lymfeklierresectie in de achterpoot van het konijn voor secundaire lymfoedeeminductie

DOI:

10.3791/64576

⸱

30 november 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microsurgery, Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre, 2Department of Plastic Surgery, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt de chirurgische inductie van stabiel verworven lymfoedeem in de achterpoot van het konijn beschreven. Dit proefdier kan worden gebruikt om het effect van lymfoedeembehandeling door middel van microchirurgische technieken verder te onderzoeken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lymfoedeem is een veel voorkomende aandoening die vaak wordt geassocieerd met kanker en de behandeling ervan, wat leidt tot schade aan het lymfestelsel, en de huidige behandelingen zijn meestal palliatief in plaats van curatief. De hoge incidentie bij oncologische patiënten wijst op de noodzaak om zowel de normale lymfefunctie als de pathologische disfunctie te bestuderen. Om chronisch lymfoedeem te reproduceren, is het noodzakelijk om een geschikt proefdier te kiezen. Pogingen om diermodellen op te stellen worden beperkt door het herstellend vermogen van het lymfestelsel. Van de potentiële kandidaten is de achterpoot van het konijn gemakkelijk te hanteren en te extrapoleren naar het klinische scenario bij de mens, waardoor het voordelig is. Bovendien zorgt de grootte van deze soort voor een betere selectie van lymfevaten voor gevasculariseerde lymfeklierresectie.

In deze studie presenteren we een procedure van vasculaire lymfeklierresectie in de achterpoot van het konijn voor het induceren van secundair lymfoedeem. Verdoofde dieren werden onderworpen aan omtrekmeting, patentblauwe V-infiltratie en indocyaninegroene lymfografie (ICG-L) met behulp van real-time nabij-infraroodfluorescentie, een techniek die de identificatie van enkele popliteale klieren en lymfekanalen mogelijk maakt. Toegang tot de geïdentificeerde structuren wordt bereikt door de popliteale knoop weg te snijden en de mediale en laterale afferente lymfevaten af te binden. Er moet speciale aandacht worden besteed om ervoor te zorgen dat elk lymfevaat dat zich in de dij bij het femorale lymfestelsel verbindt zonder de knieholte binnen te gaan, kan worden geïdentificeerd en afgebonden.

Postoperatieve evaluatie werd uitgevoerd 3, 6 en 12 maanden na inductie met behulp van omtrekmetingen van de achterpoot en ICG-L. Zoals aangetoond tijdens de follow-up, ontwikkelden de dieren een dermale terugstroming die tot de 12emaand werd gehandhaafd, waardoor dit proefdier nuttig was voor nieuwe langetermijnevaluaties bij de behandeling van lymfoedeem. Concluderend, de hier beschreven aanpak is haalbaar en reproduceerbaar. Bovendien kan het gedurende het gepresenteerde tijdsbestek representatief zijn voor menselijk lymfoedeem, waardoor het een nuttig onderzoeksinstrument is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lymfoedeem is een chronische aandoening die speciale aandacht verdient vanwege de wereldwijde incidentie, het gebrek aan curatieve en gestandaardiseerde behandeling en de ernstige impact op de kwaliteit van leven van patiënten 1,2.

In ontwikkelde landen wordt lymfoedeem voornamelijk verworven en is het secundair aan borstkanker, vanwege de hoge prevalentie van deze maligniteit; De cumulatieve incidentie van borstkankergerelateerd lymfoedeem 10 jaar na de operatie kan oplopen tot 41,1%3. Ziekten zoals melanoom, gynaecologische kankers, urogenitale tumoren en hoofd-halsneoplasmata worden echter ook in verband gebracht met een hoge incidentie van deze ziekte4. Regionale lymfeklierresectie, als onderdeel van de noodzakelijke oncologische behandeling om de overlevingskansen te verhogen, leidt tot verstoring van de functionele lymfedrainage. In sommige gevallen resulteert dit in compensatiemechanismen die het ontstaan van lymfoedeem voorkomen of vertragen5. Wanneer chemotherapie en radiotherapie worden toegediend, zijn deze mechanismen echter niet in staat om de verandering te compenseren en treedt lymfoedeem op. Dit heeft een negatieve invloed op de kwaliteit van leven van patiënten en beïnvloedt hun functioneel, sociaal en psychologisch welzijn 6,7.

De behoefte aan een effectieve remedie voor lymfoedeem vereist begrip van de fysiopathologie van het lymfestelsel, evenals een diep inzicht in de complexe cellulaire mechanismen en hun reacties in zowel normale als disfunctionele lymfestelsels 8,9,10. Dergelijke inzichten kunnen in eerste instantie worden verkregen uit experimentele diermodellen die chronische ziekten bij de mens kunnen reproduceren11.

Er zijn veel pogingen gedaan om lymfoedeem te repliceren in experimentele diermodellen; De meesten van hen werden echter gehinderd door enkele beperkingen, waaronder het onvermogen om chronische lymfatische insufficiëntie te reproduceren in een stabiel diermodel, de kosten van het onderzoek en vooral het grote regeneratieve vermogen van het lymfestelsel, waardoor het de bloedsomloop kan herstellen12,13.

Deze studie presenteert de experimentele benadering voor het chirurgisch induceren van stabiel verworven lymfoedeem met behulp van de achterpoot van het konijn. Op basis van literatuuronderzoek kan dit dier als optimaal worden beschouwd voor de ontwikkeling van lymfoedeem vanwege de consistente anatomie van het lymfestelsel van de achterpoot, dat een enkele knieholteklier omvat die de achterpoot afvoert en het belangrijkste femorale lymfestelsel in het been bereikt14,15.

De specifieke anatomie van de achterpoot van het konijn maakt de reproductie mogelijk van de chirurgische ingrepen die bij mensen worden uitgevoerd om secundair lymfoedeem te induceren. Daarom kan deze procedure worden gebruikt voor microchirurgische training en preklinisch onderzoek om de resultaten te extrapoleren naar de menselijke geneeskunde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van het Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Center en de welzijnsrichtlijnen van de regionale overheid, die gebaseerd zijn op Europese wetgeving.

1. Preoperatieve en chirurgische voorbereiding

  1. Huisvest negen vrouwelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen met een gewicht van 4-4,5 kg en een leeftijd van 4 maanden in aparte kooien die op een temperatuur van 22-25 °C worden gehouden, met vrije toegang tot voedsel en water. Zorg ervoor dat de kooien een polysulfonbak bevatten met een oppervlakte van 3m2 en een hoogte van 40 cm, evenals een bed met houtkrullen.
    1. Identificeer de kooien met de projectcode en het identificatienummer van het dier.
    2. Acclimatiseer de dieren 1 week voor de operatie om door stress veroorzaakte problemen te voorkomen. Verzamel preoperatieve laboratoriumwaarden van bloedmonsters om ervoor te zorgen dat elk dier in goede gezondheid verkeert voorafgaand aan de anesthesie.
  2. Zorg ervoor dat alle konijnen 12 uur vasten voor elke chirurgische ingreep.
    1. Preoxygeneer de konijnen na premedicatie met behulp van een gezichtsmasker (Hall-masker) gedurende 5 minuten met 100% zuurstof en een verse gasstroom van 3-5 L/min. Voer de co-inductiefase met midazolam (0,3 mg/kg) en propofol (10 mg/kg) intraveneus uit.
  3. Intubeer de konijnen met 3,0-3,5 endotracheale tubes, met pneumotaponatie, aangesloten op een semi-gesloten cirkelvormig circuit dat is aangesloten op een ventilator met een stroom verse gassen van 1 l/min gedurende een eerste 5 minuten, en vervolgens ingesteld op 0,5 l/min.
    1. Voer onderhoudsanesthesie uit door inhalatie van sevofluraan in een concentratie van 3%-3,5% ingesteld op de verdamper.
  4. Dien tijdens de chirurgische ingreep een continue infusie van Ringer's lactaatoplossing (2-4 ml/kg/uur) via de marginale ader van het oor toe aan de verdoofde konijnen.
    1. Gebruik een beschermende oogzalf om het oogoppervlak te beschermen.
  5. Algemene anesthesiebewaking: gebruik een rectale thermometer om de temperatuur op 38.7-39.7 °C te controleren, inspecteer de kleur van de slijmvliezen en controleer deO 2-verzadiging op >95% en de hartslag op 180-240 bpm met behulp van een konijnenpulsoximeter.
  6. Plaats een thermische ondersteuning zodat het dier tijdens de procedure een constante temperatuur behoudt.
  7. Dien ketorolac (1,5 mg/kg) plus tramadol (3 mg/kg) intraveneus toe voor intraoperatieve analgesie.
  8. Dien antibiotica (7,5 mg/(kg∙dag) enrofloxacine subcutaan toe [s.c.]) vóór de operatie en 5 dagen na de operatie, evenals postoperatieve analgesie (10 μg/(kg∙dag) buprenorfine s.c.) gedurende 5 dagen.
  9. Zet de konijnen in rugligging en scheer de achterpoten en liesstreek van het dier. Plaats het dier in rug-/rugligging en knip het haar van de achterpoot en liesstreek.
  10. Voer huidantisepsis uit door 0,5% chloorhexidine en 70% ethanol op de eerder geschoren huid aan te brengen. Nadat het gebied is gedesinfecteerd, bedek je het konijn met een steriele doek, behalve de linker achterpoot.

2. Popliteale vasculaire lymfeklierresectiechirurgie (Figuur 1)

  1. Infiltreer 0,2-0,3 ml indocyaninegroen (ICG) intradermaal in de tweede en derde interdigitale ruimte van de linker achterpoot. Masseer, buig zachtjes en strek de achterpoot een paar minuten uit om de opname van de kleurstof in de lymfevaten te vergemakkelijken. Gebruik het contralaterale ledemaat als controle.
  2. Gebruik een real-time, nabij-infrarood fluorescentiecamera om de lymfevaten die ter hoogte van de knie en de popliteale lymfeklier (PLN) op de huid kruisen, te visualiseren en te markeren (Figuur 2).
  3. Injecteer patent blauw V (0,2 ml) in het interdigitale gebied voor latere identificatie van de lymfevaten en lymfeklieren.
  4. Zodra de PLN is geïdentificeerd met behulp van een realtime, nabij-infrarood fluorescentiecamera (Figuur 3), maakt u een incisie van 2 cm in het midden van de knieholtefossa, in de lengterichting van de lange as van de achterpoot door de zitbeenader, die zichtbaar is door de huid.
    1. Om real-time panoramische beelden van het lymfestelsel te verkrijgen met de real-time, nabij-infrarood fluorescentiecamera, gebruikt u de optische kop die is uitgerust met een laser van klasse 1 als excitatielichtbron en een nabij-infraroodgevoelige camera, van de enkel tot de knie van de achterpoot van het dier.
    2. Visualiseer de lymfevaten boven de spierfascia door het onderhuidse vet te verwijderen5. De lymfevaten lijken blauw door de duidelijke blauwe V-kleuring in stap 2.3.
    3. Gebruik een microchirurgische tang om de incisie uit te rekken en de PLN bloot te leggen, inclusief de vasculaire en afferente lymfesteeltjes. Zorg voor een duidelijk zicht op alle lymfe- en vaatstructuren (Figuur 4).
    4. Identificeer de PLN, met een diameter van 0,8 mm, onder de zitbeenader en tussen de biceps femoris en de mediale hamstringspieren.
  5. Identificeer de twee belangrijkste lymfevaten aan de mediale kant van de PLN. Deze vaten bevinden zich evenwijdig aan de distale vena saphena en splitsen zich in een netwerk van microvaten naarmate ze de PLN naderen (Figuur 5).
  6. Ontleed de pedikel van de lymfeklier en vermijd schade aan de omliggende weefsels en bloedvaten (Figuur 6).
  7. Ligate de mediale slagader (een tak van de knieholteslagader) en de laterale vena saphena distaal en proximaal met behulp van 10/0 nylon niet-resorbeerbare hechtingen.
  8. Identificeer en schroei de twee groepen afferente lymfevaten dicht die rechtstreeks aansluiten bij het femorale lymfestelsel in de dij, maar niet in de PLN terechtkomen (Figuur 7).
    OPMERKING: De eerste groep komt overeen met de mediale afferente lymfevaten die lymfe uit het bovenbeen en de kuit afvoeren. De tweede groep bestaat uit lymfevaten in de spieren van de onderste ledematen. Deze bloedvaten lopen langs de gastrocnemius-spier, samen met de vena saphena.
  9. Bevestig volledige verstoring van het lymfestelsel door real-time nabij-infrarood fluorescentiebeeldvorming te herhalen.
  10. Verwijder het omliggende vetweefsel volledig om mogelijke lymfangiogenese te voorkomen.
  11. Hecht de huidincisie met 4-0 polyglycolzuur (PGA) resorbeerbare gevlochten hechtingen (met een 16 mm 3/8 driehoekige naald) met behulp van een continu intradermaal patroon om postoperatieve automutilatie te voorkomen.
  12. Huisvesting van de konijnen afzonderlijk in kooien na de operatie; bewaar ze onder toezicht en bij een kamertemperatuur tussen 16 en 22 °C.

3. Postoperatieve evaluatie

  1. Voer postoperatieve beoordelingen uit 3, 6 en 12 maanden na inductie.
  2. Verdoof de konijnen volgens de eerder gebruikte stappen (stappen 1.2-1.7).
  3. Meet de omtrek van de achterpoten van de verdoofde konijnen met een meetlint. Meet om de 2 cm, waarbij het eerste punt bij de enkel ligt en het laatste bij de knie. Bereken het totale volume met behulp van de afgekapte kegelformule.
  4. Gebruik indocyanine groene lymfografie (ICG-L) voor het beoordelen van de lymfefunctie.
    1. Infiltreer 0,2-0,3 ml ICG intradermaal in de tweede en derde interdigitale ruimte en masseer zachtjes gedurende 1 minuut om de opname van ICG in de lymfevaten te vergemakkelijken.
  5. Verzamel beelden na 15 minuten met behulp van het nabij-infrarood fluorescentiesysteem om de dermale terugstroming te beoordelen.
  6. Zodra de follow-ups zijn voltooid, euthanaseert u het konijn volgens hetzelfde anesthesieprotocol als bij de ingreep. Zodra het gewenste anesthesievlak is bereikt, wordt intraveneus kaliumchloride in de oorader toegediend met een gemiddelde snelheid van 2 meq/kg.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negen konijnen ondergingen in deze studie lymfoedeeminductie, maar drie konijnen stierven tijdens de onmiddellijke postoperatieve periode en konden niet worden geëvalueerd. Studiegegevens werden 3, 6 en 12 maanden na de operatie verkregen door drie onafhankelijke onderzoekers. Metingen van de achterpoten en ICG-L werden uitgevoerd onder algemene anesthesie om de functie van het lymfestelsel en de dermale terugstroming te beoordelen.

De gegevens die ICG-L 3 maa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resectie van de PLN bij een proefdier is een relatief nieuwe procedure die secundair lymfoedeem in de ledematen kan veroorzaken voor beoordeling en onderzoek. Na lymfeklierresectie is er een periode van verandering van de functionaliteit van het lymfestelsel, lymfaccumulatie en histologische veranderingen van lymfevaten die verwijd lijken. Wanneer deze lymfaccumulatie voldoende niveaus bereikt, kan de karakteristieke dermale terugstroming van lymfoedeem, vergelijkbaar met die waargenomen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoeksproject werd uitgevoerd in het Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Center (CCMIJU), dat deel uitmaakt van het ICTS Nanbiosis. Het onderzoek werd uitgevoerd met de hulp van de volgende Nanbiose-eenheden: U21, experimentele operatiekamer, en U22, dierenverblijven. Dit werk werd ondersteund door Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Dit werk is gedeeltelijk gefinancierd door de Junta de Extremadura, het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (subsidienummer GR21201). De financier speelde een rol bij het ontwerp van het onderzoek, het verzamelen van gegevens, de analyse, de beslissing om te publiceren en de voorbereiding van het manuscript. Speciale dank gaat uit naar María Pérez voor het voorbereiden van de cijfers en naar de afdeling Microchirurgie van JUMISC voor het voortdurend aanmoedigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bleu Patente V sodique (Guerbet)Guerbet. Villepinte, Frankrijk2,5 g/100 mL
Buprenorfine (Bupaq)Richter Pharma. Wels, Oostenrijk0820645AA3 mg/10 mL
FluobeamFluoptics. Grenoble, FrankrijkFluorescentie beeldvorming
IBM SPSS-softwareIBMversie 21.0
Indocyaangroen (Verdye, Diagnostic Green GmbH)Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Duitsland5 mg/mL
Ketorolac  (Normon) Normon, S.A. Madrid, SpanjeT01H30 mg/mL
Microsoft ExcelMicrosoftversie 16.66.1
Midazolam (Normon) Normon, S.A. Madrid, SpanjeT35M15 mg/3 mL
Pentero 800-microscoop, fluorescentiemoduleCarl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Duitsland302581-9245-000
Kaliumchloride (Braun)B.Braun. Barcelona, Spanje1926201020 mmol/10 mL
Propofol (Propomitor, Orion Pharma) Orion Pharma. Spoo, Finland20R039B200 mg/20 mL
RÜSCH endotracheale tubesTeleflex Medical IDA Business and Technology Park. Athione, Ierland.12CE 12Grootte buis 4,0 I.D. mm
Sevofluraan (SevoFlo, Zoetis)Zoetis Belgium. Louvain-la-Neuve, België60935591000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)Normon, S.A. Madrid, SpanjeT08U100 mg/2 mL

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, G. W. Lymphoedema. Postgraduate Medical Journal. 35 (399), 2-7 (1959).
  2. Weissleder, H., Schuchhardt, C. Lymphedema Diagnosis and Therapy. 2nd ed. , Kagerer Kommunikation. (1997).
  3. Pereira, A. C. P. R., Koifman, R. J., Bergmann, A. Incidence and risk factors of lymphedema after breast cancer treatment: 10 years of follow-up. The Breast. 36, 67-73 (2017).
  4. Coriddi, M., et al. Systematic review of patient-reported outcomes following surgical treatment of lymphedema. Cancers. 12 (3), 565(2020).
  5. Fernández Peñuela, R., Casaní Arazo, L., Masiá Ayala, J. Outcomes in vascularized lymph node transplantation in rabbits: A reliable model for improving the surgical approach to lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 17 (4), 413-417 (2019).
  6. Armer, J. M., et al. ONS GuidelinesTM for cancer treatment–related lymphedema. Oncology Nursing Forum. 47 (5), 518-538 (2020).
  7. Villanueva, T. Avoiding lymphedema. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 121(2014).
  8. Clavin, N. W., et al. TGF-β 1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  9. Schulte-Merker, S., Sabine, A., Petrova, T. V. Lymphatic vascular morphogenesis in development, physiology, and disease. The Journal of Cell Biology. 193 (4), 607-618 (2011).
  10. Padberg, Y., Schulte-Merker, S., Van Impel, A. The lymphatic vasculature revisited—new developments in the zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 221-238 (2017).
  11. Cornelissen, A. J. M., et al. Outcomes of vascularized versus non-vascularized lymph node transplant in animal models for lymphedema. Review of the literature. Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 32-36 (2017).
  12. Hadamitzky, C., Pabst, R. Acquired lymphedema: An urgent need for adequate animal models. Cancer Research. 68 (2), 343-345 (2008).
  13. Shin, W. S., Szuba, A., Rockson, S. G. Animal models for the study of lymphatic insufficiency. Lymphatic Research and Biology. 1 (2), 159-169 (2003).
  14. Soto-Miranda, M. A., Suami, H., Chang, D. W. Mapping superficial lymphatic territories in the rabbit. Anatomical Record. 296 (6), 965-970 (2013).
  15. Bach, C., Lewis, G. P. Lymph flow and lymph protein concentration in the skin and muscle of the rabbit hind limb. The Journal of Physiology. 235 (2), 477-492 (1973).
  16. Mayer, J. Use of behavior analysis to recognize pain in small mammals. Lab Animal. 36 (6), 43-48 (2007).
  17. Jones-Bolin, S. Guidelines for the care and use of laboratory animals in biomedical research. Current Protocols in Pharmacology. 59 (1), 4(2012).
  18. Hawkins, P. Recognizing and assessing pain, suffering and distress in laboratory animals: a survey of current practice in the UK with recommendations. Laboratory Animals. 36 (4), 378-395 (2002).
  19. Kohn, D. F., et al. Public statement: Guidelines for the assessment and management of pain in rodents and rabbits. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (2), 97-108 (2007).
  20. Wolfe, J. H., Rutt, D., Kinmonth, J. B. Lymphatic obstruction and lymph node changes–a study of the rabbit popliteal node. Lymphology. 16 (1), 19-26 (1983).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Konijnenmodel voor achterpootpopliteale lymfeklierligatie van lymfevatenindocyaninegroen lymfografienabij infrarood fluorescentiePatent Blue Vchronisch lymoedeemmodeldermale terugstroom
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen