Method Article

Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering

DOI:

10.3791/64578

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft de verspreiding van het Zika-virus (ZIKV) in niercellen van Vero Afrikaanse groene apen en de kwantificering van ZIKV met behulp van celgebaseerde colorimetrische immunodetectiemethoden in formaten met 24 wells en 96 wells (hoge doorvoer).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zikavirus (ZIKV) is een door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus. ZIKV-infectie is in verband gebracht met aangeboren hersenafwijkingen en mogelijk syndroom van Guillain-Barré bij volwassenen. Onderzoek naar ZIKV om de ziektemechanismen te begrijpen is belangrijk om de ontwikkeling van vaccins en behandelingen te vergemakkelijken. De methode om virussen te kwantificeren is cruciaal en fundamenteel op het gebied van virologie. De focusvormende test (FFA) is een viruskwantificeringstest die het virale antigeen met antilichamen detecteert en de infectiehaarden van cellen identificeert met behulp van de peroxidase-immunokleuringstechniek. De huidige studie beschrijft het protocol voor virusvoortplanting en -kwantificering met behulp van zowel 24-wells als 96-wells (high throughput) formaten. In vergelijking met andere vergelijkbare onderzoeken heeft dit protocol de optimalisatie van de foci-grootte verder beschreven, wat als leidraad kan dienen om het gebruik van deze test voor andere virussen uit te breiden. Eerst wordt de ZIKV-vermeerdering gedurende 3 dagen uitgevoerd in Vero-cellen. Het kweeksupernatans dat ZIKV bevat, wordt geoogst en gekwantificeerd met behulp van de FFA. In het kort wordt de viruskweek geïnoculeerd op Vero-cellen en gedurende 2-3 dagen geïncubeerd. De vorming van foci wordt vervolgens bepaald na geoptimaliseerde kleuringsprocessen, waaronder celfixatie, permeabilisatie, blokkering, antilichaambinding en incubatie met peroxidasesubstraat. De gekleurde virushaarden worden gevisualiseerd met behulp van een stereomicroscoop (handmatig tellen in 24-wells-formaat) of software-analysator (geautomatiseerd tellen in 96-wells-formaat). De FFA geeft reproduceerbare, relatief snelle resultaten (3-4 dagen) en is geschikt om te worden gebruikt voor verschillende virussen, waaronder niet-plaquevormende virussen. Vervolgens is dit protocol nuttig voor de studie van ZIKV-infectie en kan het worden gebruikt om andere klinisch belangrijke virussen te detecteren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zika-virus (ZIKV)-infectie is een opkomende door muggen overgedragen virale ziekte. De eerste isolatie van ZIKV was in Oeganda in 1947 1,2; Het bleef verwaarloosd van 1947 tot 2007, omdat de klinische symptomen meestal asymptomatisch zijn en worden gekenmerkt door zelfbeperkende koortsziekte. In 2007 begon de Zika-epidemie op de Yap-eilanden 3,4, gevolgd door grotere epidemieën in de Stille Oceaan (Frans-Polynesië, Paaseiland, Cookeilanden en Nieuw-Caledonië) van 2013 tot 2014 5,6,7,8, waar de ernstige neurologische complicatie Guillain-Barré-syndroom (GBS) voor het eerst bij volwassenen werd gemeld 9. In 2015 en 2016 raasde de eerste wijdverspreide ZIKV-epidemie over Noord- en Zuid-Amerika na de opkomst van het Aziatische genotype van ZIKV in Brazilië al in 201310. Tijdens deze uitbraak werden 440.000 tot 1,3 miljoen gevallen van microcefalie en andere neurologische aandoeningen gemeld bij pasgeboren baby's. Er is momenteel geen specifieke remedie of behandeling voor ZIKV-infectie; daarom is er een dringende medische behoefte aan ZIKV-vaccins die infecties kunnen voorkomen, vooral tijdens de zwangerschap.

Viruskwantificering is een proces om het aantal virussen in een monster te bepalen. Het speelt een belangrijke rol in onderzoek en academische laboratoria betrekken veel gebieden, zoals geneeskunde en levenswetenschappen. Dit proces is ook belangrijk in commerciële sectoren, zoals de productie van virale vaccins, recombinante eiwitten, virale antigenen of antivirale middelen. Er kunnen veel methoden of tests worden gebruikt voor de kwantificering van virussen12. De keuze van methoden of tests hangt normaal gesproken af van de viruskenmerken, het gewenste nauwkeurigheidsniveau en de aard van het experiment of onderzoek. Over het algemeen kunnen methoden voor het kwantificeren van virussen worden onderverdeeld in twee categorieën: moleculaire tests die de aanwezigheid van viraal nucleïnezuur (DNA of RNA) detecteren en tests die de besmettelijkheid van virussen in vitro meten 12. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR, voor DNA) of kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR, voor RNA)13 en digitale druppel PCR14 zijn voorbeelden van veelgebruikte moleculaire technieken die worden gebruikt om het virale nucleïnezuur in een bepaald monster te kwantificeren15. Deze zeer gevoelige moleculaire technieken kunnen echter geen onderscheid maken tussen levensvatbare en niet-levensvatbarevirussen15. Daarom kan onderzoek waarvoor informatie nodig is over biologische kenmerken, zoals de besmettelijkheid van virussen op cellen, niet worden voltooid met behulp van de bovengenoemde moleculaire technieken; Er zijn tests nodig die de aanwezigheid van levensvatbare virussen kunnen meten en bepalen. Tests die de besmettelijkheid van virussen meten, zijn onder meer de plaquevormende test (PFA), 50% infectieuze dosis weefselkweek (TCID50), de fluorescerende focustest en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)12.

De PFA, ontwikkeld door Renato Dulbecco in 1952, is een van de meest gebruikte methoden voor virustitratie, ook voor ZIKV16. Het wordt gebruikt om de virale concentraties voor infectieuze lytische virionen direct te bepalen. De methode is gebaseerd op het vermogen van een lytisch virus om cytopathische effecten (CPE's; zones van celdood of plaques, een infectiegebied omgeven door niet-geïnfecteerde cellen) te produceren in een geïnoculeerde celmonolaag na virale infectie. Er zijn echter verschillende nadelen aan de test die van invloed zijn op het nut ervan. De test is tijdrovend (duurt ongeveer 7-10 dagen, afhankelijk van virussen), CPE-afhankelijk en foutgevoelig. In de huidige studie rapporteren we een immunocolorimetrische techniek, de focus forming assay (FFA), voor het detecteren en kwantificeren van ZIKV in plaatformaten met 24 putjes en platen met 96 putjes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Verspreiding van virussen

  1. Cel voorbereiding
    1. Kweek Vero-cellen in een 75 cm2-cellige kweekkolf met 12 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 2 mM L-glutamine (zie materiaaltabel). Incubeer de cellen in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.
    2. Bewaak de cellen onder een microscoop; zodra de cellen 70%-90% confluentie hebben bereikt, zijn ze klaar voor gebruik (Figuur 1A).
      OPMERKING: De Vero-cellen verdubbelen ongeveer elke 24 uur17. Verdunningen van 1:10 moeten 3 tot 4 dagen duren om 80%-90% confluentie te bereiken in een kolf van 75 cm2 . Bewaak de cellen dagelijks of om de dag.
  2. Infectie van de celmonolaag
    1. Verwijder het groeimedium uit de celkweekkolf met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Spoel de kolf 2x met 3 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (dPBS) met behulp van een serologische pipet van 5 ml.
      OPMERKING: Er moet een bekerglas met 10% natriumhypochloriet worden bereid om eventueel weggegooid besmettelijk vloeibaar afval uit kolven/borden te desinfecteren.
    2. Voeg 2 ml serumvrije DMEM (DMEM aangevuld met 2 mM L-glutamine zonder FBS) en 20 μl ZIKV-inoculum toe aan de celkweekkolf. Incubeer de kolf gedurende 1 uur zachtjes schommelen bij kamertemperatuur om virusadsorptie mogelijk te maken.
      OPMERKING: Titratie van de initiële ZIKV-voorraad is nuttig om het volume van de ZIKV-entstof te bepalen (stap 2).
      LET OP: ZIKV is geclassificeerd als een ziekteverwekker van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2). Alle procedures met materialen die ZIKV bevatten, moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde bioveiligheidskast en moeten alle standaard operationele procedures (SOP's) van het laboratorium volgen met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
  3. Toevoeging van het overlay-medium
    1. Verwijder na de incubatie van 1 uur het verdunde virusinoculum en gooi het weg met een serologische pipet van 5 ml. Spoel de celkweekkolf 2x met 3 ml dPBS.
    2. Voeg 12 ml onderhoudsmedia (DMEM aangevuld met 2% FBS, 2 mM L-glutamine en 100 E/ml penicilline-streptomycine) toe aan de celkweekkolf om de geïnfecteerde cellen in stand te houden.
    3. Incubeer de geïnfecteerde Vero-cellen gedurende 3 dagen in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Controleer dagelijks op de CPE van geïnfecteerde Vero-cellen onder een microscoop.
  4. Oogsten van supernatans voor celkweek dat ZIKV bevat
    1. Op dag 3 na infectie kan celafronding en -loslating (CPE) worden waargenomen (Figuur 1B-D). Oogst het celkweeksupernatans met de ZIKV in een centrifugebuis van 50 ml met behulp van een serologische pipet van 10 ml.
    2. Gebruik een polyethersulfonspuitfilter van 0,22 μm (zie materiaaltabel) om de supernatant van de celkweek te filteren. Aliquot 500 μL van het gefiltreerde celkweeksupernatans in 2,0 ml schroefdopbuisjes en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik.
      OPMERKING: Geoogste ZIKV kan worden opgeslagen bij -80 °C voor langdurige opslag.
      LET OP: Er moeten extra voorzorgsmaatregelen worden genomen als een injectienaald wordt gebruikt, omdat de naald de huid kan doorboren. Er moeten SOP's voor laboratoria worden opgesteld.

2. Kwantificering van virussen

  1. Cel voorbereiding
    1. Zaad Vero-cellen in daarvoor bestemde platen (plaat met 24 putjes: 0,5 ml/putje, 7,5 x 104 cellen/putje; plaat met 96 putjes: 0,1 ml/putje, 1,5 x 104 cellen/putje) en incubeer het plaatje een nacht in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 .
      OPMERKING: Er zijn vijf verschillende tijdstippen die moeten worden getest (plaat met 24 putjes: 48 uur, 60 uur, 72 uur, 84 uur en 96 uur na infectie; plaat met 96 putjes: 24 uur, 36 uur, 48 uur, 60 uur en 72 uur na infectie); Zet daarom voor elk tijdstip één bord klaar.
    2. Na de incubatie van 24 uur en zodra de cellen 70%-90% confluentie hebben bereikt (Figuur 1E), is de plaat klaar voor infectie. Ga verder met het bereiden van de verdunde virusvoorraad (stap 2.2) voorafgaand aan infectie van de celmonolaag.
  2. Verdunning van het virus
    1. Bereid voor platen met 24 en 96 putjes zes steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor elke plaat om een tienvoudige verdunning (10-1 tot 10-5) uit te voeren, inclusief een negatieve controle. Voeg voor de experimentopstelling voor een plaat met 24 putjes 450 μL serumvrije DMEM toe aan alle zes microcentrifugebuisjes. Voeg voor de experimentopzet voor een plaat met 96 putjes 135 μL serumvrije DMEM toe aan zes buisjes.
      NOTITIE: Label elke buis duidelijk om de verdunning van de inhoud aan te geven voordat u de tienvoudige seriële verdunning uitvoert.
    2. Om seriële verdunning uit te voeren, voegt u voor de proefopstelling met 24 putjes 50 μL ZIKV-bouillon toe die is geoogst uit stap 1 in de 10-1 buis die 450 μL serumvrije DMEM bevat. Voeg voor de opstelling van het plaatexperiment met 96 putjes 15 μL ZIKV-bouillon toe aan de 10-1 tube die 135 μL serumvrije DMEM bevat.
    3. Draai elke buis om het virus en het medium te mengen. Dit is de eerste tienvoudige verdunning.
      OPMERKING: Juiste menging van virus en kweekmedium in elke verdunningsbuis is vereist om een nauwkeurige seriële verdunning te garanderen.
    4. Gebruik voor de proefopstelling met 24 putjes een verse pipetpunt om het 10-1-buisje te resuspenderen en 50 μL verdunde ZIKV over te brengen in het 10-2-buisje als een tweede tienvoudige verdunning. Gebruik voor de proefopstelling met 96 putjes een verse pipetpunt om het 10-1 buisje te resuspenderen en 15 μL verdunde ZIKV over te brengen in het 10-2 buisje als een tweede tienvoudige verdunning.
    5. Herhaal stap 2.2.4 viermaal tot aan het vijfde buisje (negatieve controle uitsluiten).
      OPMERKING: Gebruik na elke pipettestap een nieuwe pipetpunt om kruisbesmetting te voorkomen.
  3. Infectie van de celmonolaag
    1. Verwijder het geconditioneerde medium uit elk putje en gooi het weg (plaat met 24 putjes: 0,5 ml/putje; plaat met 96 putjes: 0,1 ml/putje).
    2. Spoel elk putje 2x met dPBS (plaat met 24 putjes: 300 μl/putje; plaat met 96 putjes: 60 μl/putje).
    3. Werk van de hoogste naar de laagste verdunning en voeg elk serieel verdund virusinoculum toe aan het putje (plaat met 24 putjes: 200 μl/putje; plaat met 96 putjes: 40 μl/putje).
      OPMERKING: De infectie van elke verdunning zal worden uitgevoerd in gedupliceerde putjes. Handhaaf twee niet-geïnfecteerde putten als negatieve controle. Label de plaat en de putjes duidelijk om verwarring te voorkomen. Vervang de pipetpunten na elke pipetteerstap om kruisbesmetting te voorkomen.
    4. Incubeer de plaat gedurende 1 uur zachtjes schommelen bij kamertemperatuur om virusadsorptie mogelijk te maken.
  4. Toevoeging van het overlay celkweekmedium
    1. Verwijder na 1 uur incubatie de virussuspensie van de laagste concentratie naar de hoogste concentratie en gooi deze weg.
    2. Was de geïnfecteerde cellen 2x met dPBS (plaat met 24 putjes: 300 μL/putje; plaat met 96 putjes: 60 μL/putje).
    3. Bedek het putje met DMEM (aangevuld met 2% FBS, 2 mM L-glutamine en 100 E/ml penicilline-streptomycine) en 1,5% carboxymethylcellulose met lage viscositeit (CMC; zie materiaaltabel) (plaat met 24 putjes: 1 ml/putje; plaat met 96 putjes: 0,2 ml/putje).
    4. Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.
      NOTITIE: Verstoor de plaat niet tijdens deze incubatieperiode.
    5. Haal de plaat uit de celkweekincubator om op verschillende tijdstippen te kleuren (plaat met 24 putjes: 48 uur, 60 uur, 72 uur, 84 uur en 96 uur na infectie; plaat met 96 putjes: 24 uur, 36 uur, 48 uur, 60 uur en 72 uur na infectie).

3. Vlekken

  1. Cel fixatie
    1. Verwijder na de specifieke incubatie-uren (plaat met 24 putjes: 48 uur, 60 uur, 72 uur, 84 uur en 96 uur na infectie; plaat met 96 putjes: 24 uur, 36 uur, 48 uur, 60 uur en 72 uur na infectie) het overlaymedium en gooi het weg en was de cellen 3x met 1x PBS. Verwijder voor de plaat met 96 putjes het overlaymedium en gooi het weg en was de cellen 3x met 60 μL/putje of 1x PBS met een meerkanaalspipet.
    2. Voeg 4% paraformaldehyde toe om de cellen te fixeren (plaat met 24 putjes: 300 μl/putje; plaat met 96 putjes: 60 μl/putje). Incubeer de plaat 20 minuten op kamertemperatuur.
      LET OP: Paraformaldehyde is een vast gepolymeriseerd formaldehyde. Het is een ontvlambaar, vast, wit kristallijn poeder dat formaldehydegas afgeeft wanneer het wordt gemengd met water of wordt verwarmd. Alle procedures waarbij paraformaldehyde wordt gebruikt, moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde chemische zuurkast of goedgekeurde uitgeputte omhulsels volgens laboratorium-SOP's die specifiek zijn voor formaldehydehoudende chemicaliën.
    3. Gooi na 20 minuten de paraformaldehyde weg en was de cellen 3x met 1x PBS. Voer permeabilisatie, blokkering en antilichaamincubaties uit volgens de stappen 3.2-3.5.
      OPMERKING: Volg bij het weggooien van 4% paraformaldehyde de afvalverwijderingsprocedure van de universiteit of het instituut.
  2. Cel permeabilisatie
    1. Voeg 1% octylfenoxypoly(ethyleenoxy)ethanol toe (zie materiaaltabel) om de cellen te permeabiliseren (plaat met 24 putjes: 200 μl/putje; plaat met 96 putjes: 40 μl/putje). Incubeer de plaat 15 minuten op kamertemperatuur.
    2. Gooi na 15 min de octylfenoxy poly(ethyleenoxy)ethanol weg en was de cellen 3x met 1x PBS.
  3. Blokkeren
    1. Voeg 3% magere melk toe om de niet-specifieke binding in het monster te verminderen (plaat met 24 putjes: 500 μl/putje; plaat met 96 putjes: 100 μl/putje). Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    2. Gooi na 2 uur de 3% magere melk weg en was de cellen 3x met 1x PBS.
      OPMERKING: Dit is een stoppunt. Na toevoeging van 3% magere melk kunnen de platen tot 2 dagen voor het inbrengen van het primaire antilichaam bij 4 °C worden bewaard.
  4. Primaire incubatie van antilichamen
    1. Voeg anti-flavivirus monoklonaal antilichaam, 4G2 (kloon D1-4G2-4-15; primair antilichaam, zie Materiaaltabel) verdund in 1% magere melk (verhouding 1:1.000) toe (plaat met 24 putjes: 200 μL/putje; plaat met 96 putjes: 40 μL/putje). Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Verwijder na 1 uur de oplossing met het monoklonale antilichaam en was de cellen 3x met 1x PBS.
  5. Secundaire incubatie van antilichamen
    1. Voeg geit anti-muis IgG secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) toe (zie materiaaltabel) verdund in 1% magere melk (verhouding 1:1.000) (plaat met 24 putjes: 200 μL/putje; plaat met 96 putjes: 40 μL/putje). Incubeer de platen gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Verwijder na 1 uur de oplossing met het secundaire antilichaam en was de cellen 3x met 1x PBS.
  6. Substraat incubatie
    1. Voeg 3,3'diaminobenzidine (DAB)-peroxidasesubstraat toe (zie materiaaltabel) en incubeer de plaat gedurende 30 minuten in het donker (plaat met 24 putjes: 200 μl/putje; plaat met 96 putjes: 40 μl/putje). Stop na 30 minuten de reactie door de putten met water te wassen.
    2. Laat de platen een nacht aan de lucht drogen en ga verder met het opsommen van de brandpunten nadat de platen volledig droog zijn.

4. Bepaling van de virustiter

  1. Handmatig telproces voor brandpunten (formaat met 24 putjes)
    1. Brandpunten kunnen worden gevisualiseerd onder een stereomicroscoop. Selecteer de verdunning die 50-200 brandpunten produceert.
    2. Tel de brandpunten voor elke replicatie van de geselecteerde verdunning. Bereken het gemiddelde aantal brandpunten voor elk van de geselecteerde verdunningen.
    3. Bereken de foci-vormende eenheid per ml (FFU/ml) voor elk monster met de onderstaande formule: FFU/ml = gemiddeld aantal getelde foci/(verdunning x volume verdund virus toegevoegd).
  2. Geautomatiseerd foci-telproces (96-wells-formaat)
    1. Scan de plaat met 96 putjes op een commerciële softwareanalysator.
      1. Dubbelklik op de software (zie Materiaaltabel) om deze te openen.
      2. Klik op Switch Suites en zorg ervoor dat de suite is overgeschakeld naar een suite die van toepassing is (aanvullende afbeelding 1A). Klik op OK.
      3. Begin de scan door te klikken op Scannen > Volledige platenscan (aanvullende afbeelding 1B).
      4. Klik op Dashboard om er zeker van te zijn dat het opnameformaat het formaat met 96 putjes is (aanvullende afbeelding 2A).
      5. Selecteer de centreermodus als "Automatische vooruitlijning door gebruiker geverifieerd" (aanvullende afbeelding 2B).
      6. Klik op Uitwerpen om de plaat te laden.
        NOTITIE: Open het deksel van de plaat en plaats deze omhoog met rij A bovenaan (aanvullende afbeelding 3A).
      7. Voer de naam van het kenteken in en klik op OK. Klik op Laden om de plaat te laden.
      8. Klik op Start om de scan te starten. Kalibreer daarna de posities voor A1, A12 en H1 met behulp van de knoppen "Omhoog, Omlaag, Links, Rechts" en klik op Bevestigen (aanvullende afbeelding 3B).
        NOTITIE: De software begint met het scannen van elk putje.
      9. Zodra het scannen is voltooid, verschijnt er een overzichtsafbeelding. Klik op Sluiten.
      10. Verlaat de scan door op Terug naar telefooncentrale te klikken.
    2. Tel de plaat met 96 putjes met behulp van de software.
      1. Klik op 'Aantal' > 'Slim tellen'.
      2. Op de software wordt "Stap 1 van 5: Selecteer platen om te tellen" weergegeven. Klik op Laadplaat(en). Vink de hele map aan en klik op Selecteren om de gescande plaat te importeren (aanvullende afbeelding 4A).
      3. Op de software wordt "Stap 2 van 5: Telparameters definiëren" weergegeven. Klik op Parameters aanpassen en de parameters worden weergegeven (diffuus proces; klein/normaal/groot/grootste/grootste +1; vlekscheiding; geteld gebied; achtergrondbalans; vezelverwijdering; gating).
        OPMERKING: Begin met één put en kijk heen en weer om de beste instellingen voor alle putten te vinden.
      4. Als u klaar bent, klikt u op Volgende (aanvullende afbeelding 4B).
      5. Op de software wordt "Stap 3 van 5: Putten selecteren/deselecteren" weergegeven. Zodra de selectie van het te tellen putje is voltooid, klikt u op Volgende om verder te gaan.
        OPMERKING: De putten die zijn geselecteerd om te worden geteld, worden weergegeven met een "C" in de rechterbovenhoek van elk putje (aanvullende figuur 5A).
      6. In de software wordt "Stap 4 van 5: Uitvoerinstellingen" weergegeven. Klik op Uitvoerinstellingen bekijken/wijzigen om te controleren of de instellingen (zoals afbeeldingsformaat) geschikt zijn. Klik op opslaan en afsluiten > volgende (aanvullende figuur 5B).
      7. Op de software wordt "Stap 5 van 5: Start AutoCount" weergegeven. Klik op Start AutoCount (aanvullende figuur 6A).
      8. Als u klaar bent, klikt u op AutoCount afsluiten.
  3. Voer kwaliteitscontrole (QC) uit in de commerciële softwareanalysator.
    1. Klik op de pagina van de telefooncentrale op Kwaliteitscontrole > Plaat(en) toevoegen. Vink de hele map aan om de getelde plaat te importeren, klik op Selecteren > QC starten (aanvullende afbeelding 6B).
    2. Dubbelklik op elk putje om de plekken te controleren. Klik op Tellen om eventuele vlekken te verwijderen. De software begint te tellen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat "Spots: Remove" is aangevinkt. De voltooiing van de telling kan worden aangegeven door het getelde aantal brandpunten, bijvoorbeeld "30" (aanvullende figuur 7A).
    3. Zodra het tellen is afgelopen (aangegeven door het getelde aantal brandpunten, bijvoorbeeld "30"), klikt u op "Ja" om vlekken te verwijderen (aanvullende figuur 7B). Klik driemaal met de linkermuisknop op de plek die u wilt verwijderen. Klik met de rechtermuisknop om te voltooien en klik vervolgens op Ja.
    4. Klik op Finish Plate en ga naar Projectoverzicht zodra de QC is voltooid.
  4. Voer beeldvorming uit met behulp van de softwareanalysator.
    1. Controleer de gescande, getelde en QC-plaatafbeelding (Afbeelding 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZIKV kan worden gekwantificeerd met behulp van de FFA, zoals schematisch weergegeven in figuur 3. Voor de plaat met 24 putjes werden de geïnfecteerde Vero-cellen 48 uur, 60 uur, 72 uur, 84 uur en 96 uur na infectie gefixeerd. De resultaten toonden aan dat de cellen intact bleven (er werd geen celloslating waargenomen) na 96 uur (4 dagen) na infectie (Figuur 4 en aanvullende Figuur 8A-E). Het verschijnen van virushaarden werd voor het eerst waarg...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende tests om de virustiter te bepalen; de PFA heeft een vergelijkbaar protocol voor het kwantificeren van virussen als de FFA, waarbij het virusinoculum wordt verdund om individuele plaques of foci te kunnen onderscheiden. Na kleuring duidt elke plaque of foci op een enkel infectieus deeltje in het entmateriaal19. De PFA is gekleurd met kristalviolet om plaquevorming veroorzaakt door cellyse of dood te visualiseren. Daarom is de PFA tijdrovender, omdat het virus meer tijd nodig h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek kreeg steun van het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië in het kader van de Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) en financiering voor het Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) programma (MO002-2019). Figuur 3 in deze studie die de workflow van kleuring voor de foci-vormende test laat zien, is aangepast van "DAB Immunohistochemistry" door BioRender.com (2022). Opgehaald van https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filterSartoriusS6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tubeNest615601
10 mL sterile serologische pipetLabserv14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS)Gibco14190-136
2.0 mL Screw cap tube AxygenSCT-200-SS-C-S
24-well plateCorning3526
25 mL Sterile serological pipettesLabserv14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrateThermo Scientific34065
37 °C incubator with 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL sterile serological pipetLabserv14955155
50 mL centrifuge tubeFalconLAB352070
75 cm2 tissue culture flask Corning430725U
96-well plateFalcon353072
Anti-flavivirus monoklonale antilichamen, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)N/AN/A22,8 g van 8 mM Na2HPO4, 4,0 g van 1,5 mM KH2PO4, 160 g van 0,14 M NaCl, 4,0 g van 2,7 mM KCl, 1 L van MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class IIHoltenHB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot AnalyzerImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Commerciële software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS
Geiten anti-muis IgG secundair antilichaam geconjugeerd met paardenradenperoxidase (HRP)MilliporeSigma12-349
HemacytometerLaboroptik LTDNeubauer improved
IGEPAL CA-630 detergentSigma-AldrichI8896Octylfenoxy poly(ethyleenoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscopeZEISSTELAVAL 31
Laboratory rockerFINEPCRCR300
L-GlutamineGibco25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)Sigma-AldrichC5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)Eppendorf3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)Eppendorf3125000052
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL)Eppendorf3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)Eppendorf3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)Eppendorf3123000055
Skim milkSunlac Low FatN/ABereid 3% Skim milk in 1x PBS voor de blokkeringsfase bij het kleuren
Sodium HypochloriteCloroxN/AOm eventueel gevaarlijk afvalwater uit flessen/platen te desinfecteren
StereomicroscopeNikonSMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL met 21 G naaldTerumoSS10L21G
Vero African green monkey kidney cells -ECACC 88020401Ontvangen van medewerker. Vero cellen verkregen van andere leveranciers zouden echter gebruikt kunnen worden met enige optimalisatie.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929(2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720(2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183(2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314(2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960(2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632(2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880(2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544(2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika VirusVirus QuantificationFocus Forming AssayVero CellsColorimetric QuantificationPeroxidase ImmunostainingSerial DilutionCell FixationAntibody DetectionHigh Throughput Assay

Related Articles