Het huidige protocol beschrijft de verspreiding van het Zika-virus (ZIKV) in niercellen van Vero Afrikaanse groene apen en de kwantificering van ZIKV met behulp van celgebaseerde colorimetrische immunodetectiemethoden in formaten met 24 wells en 96 wells (hoge doorvoer).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zikavirus (ZIKV) is een door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus. ZIKV-infectie is in verband gebracht met aangeboren hersenafwijkingen en mogelijk syndroom van Guillain-Barré bij volwassenen. Onderzoek naar ZIKV om de ziektemechanismen te begrijpen is belangrijk om de ontwikkeling van vaccins en behandelingen te vergemakkelijken. De methode om virussen te kwantificeren is cruciaal en fundamenteel op het gebied van virologie. De focusvormende test (FFA) is een viruskwantificeringstest die het virale antigeen met antilichamen detecteert en de infectiehaarden van cellen identificeert met behulp van de peroxidase-immunokleuringstechniek. De huidige studie beschrijft het protocol voor virusvoortplanting en -kwantificering met behulp van zowel 24-wells als 96-wells (high throughput) formaten. In vergelijking met andere vergelijkbare onderzoeken heeft dit protocol de optimalisatie van de foci-grootte verder beschreven, wat als leidraad kan dienen om het gebruik van deze test voor andere virussen uit te breiden. Eerst wordt de ZIKV-vermeerdering gedurende 3 dagen uitgevoerd in Vero-cellen. Het kweeksupernatans dat ZIKV bevat, wordt geoogst en gekwantificeerd met behulp van de FFA. In het kort wordt de viruskweek geïnoculeerd op Vero-cellen en gedurende 2-3 dagen geïncubeerd. De vorming van foci wordt vervolgens bepaald na geoptimaliseerde kleuringsprocessen, waaronder celfixatie, permeabilisatie, blokkering, antilichaambinding en incubatie met peroxidasesubstraat. De gekleurde virushaarden worden gevisualiseerd met behulp van een stereomicroscoop (handmatig tellen in 24-wells-formaat) of software-analysator (geautomatiseerd tellen in 96-wells-formaat). De FFA geeft reproduceerbare, relatief snelle resultaten (3-4 dagen) en is geschikt om te worden gebruikt voor verschillende virussen, waaronder niet-plaquevormende virussen. Vervolgens is dit protocol nuttig voor de studie van ZIKV-infectie en kan het worden gebruikt om andere klinisch belangrijke virussen te detecteren.
Inleiding
Zika-virus (ZIKV)-infectie is een opkomende door muggen overgedragen virale ziekte. De eerste isolatie van ZIKV was in Oeganda in 1947 1,2; Het bleef verwaarloosd van 1947 tot 2007, omdat de klinische symptomen meestal asymptomatisch zijn en worden gekenmerkt door zelfbeperkende koortsziekte. In 2007 begon de Zika-epidemie op de Yap-eilanden 3,4, gevolgd door grotere epidemieën in de Stille Oceaan (Frans-Polynesië, Paaseiland, Cookeilanden en Nieuw-Caledonië) van 2013 tot 2014 5,6,7,8
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Verspreiding van virussen
- Cel voorbereiding
- Kweek Vero-cellen in een 75 cm2-cellige kweekkolf met 12 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 2 mM L-glutamine (zie materiaaltabel). Incubeer de cellen in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Bewaak de cellen onder een microscoop; zodra de cellen 70%-90% confluentie hebben bereikt, zijn ze klaar voor gebruik (Figuur 1A).
OPMERKING: De Vero-cellen verdubbelen ongeveer elke 24 uur17. Verdunningen van 1:10 moeten 3 tot ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
ZIKV kan worden gekwantificeerd met behulp van de FFA, zoals schematisch weergegeven in figuur 3. Voor de plaat met 24 putjes werden de geïnfecteerde Vero-cellen 48 uur, 60 uur, 72 uur, 84 uur en 96 uur na infectie gefixeerd. De resultaten toonden aan dat de cellen intact bleven (er werd geen celloslating waargenomen) na 96 uur (4 dagen) na infectie (Figuur 4 en aanvullende Figuur 8A-E). Het verschijnen van virushaarden werd voor het eerst waarg.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende tests om de virustiter te bepalen; de PFA heeft een vergelijkbaar protocol voor het kwantificeren van virussen als de FFA, waarbij het virusinoculum wordt verdund om individuele plaques of foci te kunnen onderscheiden. Na kleuring duidt elke plaque of foci op een enkel infectieus deeltje in het entmateriaal19. De PFA is gekleurd met kristalviolet om plaquevorming veroorzaakt door cellyse of dood te visualiseren. Daarom is de PFA tijdrovender, omdat het virus meer tijd nodig h.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek kreeg steun van het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië in het kader van de Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) en financiering voor het Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) programma (MO002-2019). Figuur 3 in deze studie die de workflow van kleuring voor de foci-vormende test laat zien, is aangepast van "DAB Immunohistochemistry" door BioRender.com (2022). Opgehaald van https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serologische pipet | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipet | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoklonale antilichamen, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22,8 g van 8 mM Na2HPO4, 4,0 g van 1,5 mM KH2PO4, 160 g van 0,14 M NaCl, 4,0 g van 2,7 mM KCl, 1 L van MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commerciële software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Geiten anti-muis IgG secundair antilichaam geconjugeerd met paardenradenperoxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylfenoxy poly(ethyleenoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Bereid 3% Skim milk in 1x PBS voor de blokkeringsfase bij het kleuren |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | Om eventueel gevaarlijk afvalwater uit flessen/platen te desinfecteren |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL met 21 G naald | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | - | ECACC 88020401 | Ontvangen van medewerker. Vero cellen verkregen van andere leveranciers zouden echter gebruikt kunnen worden met enige optimalisatie. |
Referenties
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
