Methodenartikel

Procesevaluatie en kinetiek van recombinante chitinedeacetylase-expressie in E. coli Rosetta pLysS-cellen met behulp van een statistische techniek

DOI:

10.3791/64590

⸱

10 maart 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het huidige protocol werd een statistische techniek, central composite design (CCD), toegepast om de procescondities voor de expressie van recombinant bacterieel chitinedeacetylase (BaCDA) in E. coli Rosetta pLysS-cellen te optimaliseren. De inzet van CCD resulteerde in een ~2,39-voudige toename van de expressie en activiteit van BaCDA.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren is de groenere route van de deacetylering van chitine naar chitosan met behulp van het enzym chitinedeacetylase aan belang gewonnen. Enzymatisch geconverteerde chitosan met emulerende eigenschappen heeft een breed scala aan toepassingen, met name op biomedisch gebied. Er zijn verschillende recombinante chitinedeacetylasen uit verschillende milieubronnen gerapporteerd, maar er zijn geen studies over procesoptimalisatie voor de productie van deze recombinante chitinedeacetylasen. De huidige studie maakte gebruik van de methodologie voor het centrale samengestelde ontwerp van het responsoppervlak om de productie van recombinant bacterieel chitinedeacetylase (BaCDA) in E. coli Rosetta pLysS te maximaliseren. De geoptimaliseerde procesomstandigheden waren 0,061% glucoseconcentratie, 1% lactoseconcentratie, een incubatietemperatuur van 22 °C, een roersnelheid bij 128 tpm en 30 uur fermentatie. Bij geoptimaliseerde omstandigheden werd de expressie als gevolg van lactose-inductie geïnitieerd na 16 uur fermentatie. De maximale expressie, biomassa en BaCDA-activiteit werden 14 uur na de inductie geregistreerd. Bij de geoptimaliseerde toestand was de BaCDA-activiteit van tot expressie gebrachte BaCDA ~2,39 keer verhoogd. De procesoptimalisatie verminderde de totale fermentatiecyclus met 22 uur en de afkolftijd met 10 uur na de inductie. Dit is de eerste studie die de procesoptimalisatie van recombinante chitinedeacetylase-expressie rapporteert met behulp van een centraal composietontwerp en de kinetische profilering ervan. Het aanpassen van deze optimale groeiomstandigheden zou kunnen resulteren in kosteneffectieve, grootschalige productie van het minder onderzochte monerandeacetylase, waarmee een groenere route wordt ingeslagen voor de productie van chitosan van biomedische kwaliteit.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chitine, een structureel β, 1-4 glycosidisch gekoppeld natuurlijk polymeer, is na cellulose het meest voorkomende polysacharide in de natuur. Ondanks dit feit heeft chitine beperkte industriële toepassingen vanwege zijn onoplosbaarheid1. Dit knelpunt wordt aangepakt door chitine te onderwerpen aan N-deacetylering, wat een positieve lading geeft en de oplosbaarheid van het resulterende polymeer, chitosan1, verhoogt. Chitine kan via twee verschillende routes worden gemodificeerd tot chitosan: chemisch en enzymatisch. De biomedische toepassing van chitosan vereist gecontroleerde en gedefinieerde deacetylering, die beperkt is in chemische routes 2,3. Deze beperking kan worden aangepakt met behulp van chitinedeacetylasen (CDA's), een groene enzymatische benadering voor het deacetyleringsproces 4,5.

Chitinedeacetylase behoort tot de koolhydraatesterase 4 (CE-4)-familie, gedefinieerd in de database met koolhydraatactieve enzymen (CAZY). De enzymen van de CE-4-familie delen de NodB-homologie of het domein van polysacharideacetylase als het geconserveerde gebied. Het centrale composietontwerp (CCD), een statistisch hulpmiddel, wordt gebruikt voor de optimalisatie van verschillende wild-type chitine-modificerende enzymen 6,7,8,9. De stroomafwaartse stappen in het gebruik van wildtype organismen worden echter vervelend, vandaar de verschuiving naar recombinante enzymen 10,11,12,13,14,15,16,17. In de afgelopen jaren heeft halofiel recombinant CDA uit mariene bronnen aan belang gewonnen vanwege hun gemak bij de industriële toepassing en productie van chitosan van biomedische kwaliteit 18,19.

De productie van recombinante enzymen in E. coli heeft een beperking van het proces en media-optimalisatie is nodig omdat de expressie ervan in E. coli varieert afhankelijk van het gebruikte gen en plasmide20. Zo wordt het screenen van een geschikt proces en voedingsparameters belangrijk. One factor at a time (OFAT), de veelgebruikte optimalisatiemethode, vereist enorme middelen en tijd om stapsgewijze experimenten uit te voeren. Deze methode lijdt aan een gebrek aan statistische informatie over de interactie tussen de parameters 20,21,22,23. Daarom werd de CCD of response surface methodology (RSM) aangenomen om de halofiele bacteriële chitinedeacetylase (BaCDA) expressieopbrengst en BaCDA-activiteit in E. coli Rosetta pLysS te bestuderen. De parameters die in aanmerking werden genomen voor de optimalisatie van de expressie in de E. coli-gastheer waren lactoseconcentratie, glucoseconcentratie, incubatietemperatuur, agitatiesnelheid en incubatietijd. In de meeste E. coli-expressiestudies werd Luria Bertani (LB) media met isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) gebruikt als inductor. Deze toevoeging van IPTG vereiste regelmatige groeimonitoring24. Deze terugkerende bemiddelingen tijdens het fermentatieve proces openen ook wegen voor besmetting. Vandaar dat onderzoeksgroepen zijn overgestapt op geweldige bouillon (TB) met lactose als inducer. De opname van lactose in de media in plaats van IPTG komt tegemoet aan deze zorg; E. coli verbruikt deze lactose en produceert allo-lactose als bijproduct, wat resulteert in een zelfinductietoestand. Deze auto-inducerende media bevatten glycerol, dat verbeterde opbrengsten van recombinant eiwit25 heeft laten zien.  Deze overexpressie van recombinante eiwitten in TB-media werd verder verbeterd door de procesparameters te optimaliseren. In de huidige studie werd een centraal samengesteld ontwerp toegepast om de heterologe expressie van halofiel BaCDA in E. coli Rosetta pLysS-cellen te optimaliseren. De gekozen procesparameters waren de incubatietemperatuur, de roersnelheid en de incubatietijd, en de geëvalueerde voedingsparameters waren de glucose- en lactoseconcentratie. De halofiele BaCDA-expressie werd geëvalueerd met de voorspelde geoptimaliseerde toestand en gekruist gevalideerd met behulp van SDS-PAGE.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Expressie, media en cultuur conditie

  1. Transformeer de pET-22b-vector die het BaCDA-gen bevat in E. coli Rosetta pLysS-competente cellen met behulp van de heat-shock-methode, zoals beschreven in15.
    OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het werken met micro-organismen. Al het microbiologische werk moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidsafzuigkap om besmetting te voorkomen.
  2. Voer het voorlopige expressieonderzoek uit in tbc-media die 0,05% (g/v) glucose en 0,2% (g/v) lactose bevatten bij 16 °C en 180 tpm. Kweek 6.792 x 107 E. coli Rosetta pLysS-cellen in 100 ml media die BaCDA-gekloond plasmide bevatten totdat het de stationaire fase bereikt. Bij de genoemde groeiomstandigheden bereiken de E. coli Rosetta pLysS-cellen een optische dichtheid 600 (OD600) van 10,85 ± 0,21.
    OPMERKING: Samenstelling van de TB-media (% m/v): trypton, 1,2; gistextract, 2.4; glycerol, 0,6; en 1x TB zout (17 mM KH2PO4 en 74 mM K2HPO4)17.

2. Optimalisatie en experimenteel ontwerp

  1. Ontwerp de experimenten en pas het tweede-orde polynoommodel aan in centraal composietontwerp met behulp van de statistische toolsoftware. De statistische software die in dit onderzoek werd gebruikt, was MINITAB 17.0 (proefversie).
    1. Open hiervoor de software en klik op de volgende knoppen: Stat > DoE > Response-oppervlak > Responsoppervlak maken > Response-ontwerp > Central-composiet. De uitvoer wordt weergegeven als een dialoogvenster.
  2. Voer de vijf parameters, incubatietemperatuur, roersnelheid, incubatietijd, glucoseconcentratie en lactoseconcentratie, in op vijf niveaus (-2, -1, 0, +1, +2) in het dialoogvenster.
    1. Voer hiervoor de parameters met de niveaus in het dialoogvenster in, voer de details van alle parameters in en druk op OK. Dit genereert de experimentele ontwerpmatrix met zes replicaten in het middelpunt, waarvoor 32 experimentele runs nodig zijn. De software genereert een tabel met de parameters en hun niveaus in gecodeerde en ongecodeerde termen, gebruikt bij de procesoptimalisatie met behulp van CCD (Tabel 1).
  3. Voer de 32 experimenten uit met de door de software gegenereerde condities. Voer de experimentele resultaten in de experimentele ontwerpmatrix (gegenereerd door de software) met niveaus en parameters in termen van gecodeerde en niet-gecodeerde eenheden (Tabel 2).
  4. Analyseer de experimentele ontwerpmatrix (Tabel 2) met behulp van de software. Om dit te doen, opent u de software en voert u het antwoord in het gegevensblad in. Selecteer de kolom Antwoord > Statistiek > DoE > Reactieoppervlak > Ontwerp van reactieoppervlak analyseren > OK. De output wordt geanalyseerd op statistische significantie en een model wordt voorspeld door de software.

Tabel 1: De parameters en hun niveaus in gecodeerde en niet-gecodeerde termen die in de experimentele opzet zijn gebruikt om de expressie van recombinant chitinedeacetylase in E. coli Rosetta pLysS-cellen te schatten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Experimentele ontwerpmatrix met experimentele en voorspelde BaCDA-activiteit (expressie) van recombinant chitinedeacetylase in E. coli Rosetta pLysS-cellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Validatie van het model

  1. Valideer het ontworpen model met behulp van de responsoptimalisatietool die beschikbaar is in de software.
  2. Herhaal de fermentatie bij softwarematig voorspelde optimale omstandigheden en vergelijk de experimentele waarde met de softwarematige voorspelde waarde.
    1. Open hiervoor de software en selecteer de kolom Antwoord > Statistiek > DoE > Reactieoppervlak > Reactieoptimalisatie > Maximaliseer > OK. De output is optimale procesomstandigheden en waarden die door de software worden voorspeld. Herhaal de fermentatie bij voorspelde optimale omstandigheden en vergelijk de waarden.

4. Analysemethoden

  1. Kwantificering van expressie, biomassa en eiwit
    1. Voer de fermentatie uit in 32 omstandigheden die door de software worden gegeven in de experimentele ontwerpmatrix (Tabel 2). Verkrijg de pellet na elke run door de cultuur gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 5.405 x g te centrifugeren. Weeg de celpellet om de biomassaopbrengst te bepalen.
      OPMERKING: Alle microbiële hantering moet plaatsvinden in aseptische omstandigheden (d.w.z. in bioveiligheidskasten).
    2. Lyseer de celpellet om periplasmatisch eiwit te verkrijgen door middel van sonicatie. Voeg 5 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool) toe aan elke gram celpellet en verstoor door gedurende 10 cycli te soniseren met een puls van 10 s aan en 10 s uit bij 60% amplitude. Vang het lysaat op door 10 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 5.405 x g . Kwantificeer de eiwitconcentratie met de test van Bradford26.
      OPMERKING: Om eiwitdenaturatie te voorkomen, moet sonicatie onder koude omstandigheden worden uitgevoerd. Plaats de monsters op ijs tijdens het uitvoeren van sonicatie.
    3. Analyseer de BaCDA-expressie met behulp van SDS-PAGE gevolgd door ImageJ-software. Laad 10 μL oplosbaar cellysaat (periplasmatisch eiwit) op 12% bis-acrylamidegel en laat gedurende 2 uur onder 1x tris-glycine-SDS (TGS) buffer lopen bij een stroom van 100 V. Nadat de run is voltooid, kleurt u de gel met Coomassie blue en kleurt u deze om de achtergrond te verwijderen27.
    4. Leg een afbeelding vast met behulp van een geldocumentatie-eenheid. Bepaal de BaCDA-expressie door de bandintensiteit in de vorm van de pixelwaarden te vergelijken met behulp van ImageJ-software. Beschouw de experimentele run met de laagste BaCDA-activiteit en biomassa als referentiepixel 28.
      1. Om dit te doen, opent u de software en opent u het afbeeldingsbestand en selecteert u vervolgens elke rijstrook met behulp van het rechthoekige vak. Ga naar Analyseren en stel elke baan in op 100% en selecteer vervolgens de overexpressie van de band in elke baan met behulp van het rechthoekige vak. Ga naar Analyseren en bepaal de intensiteit van de band, herhaal het proces in elke baan en exporteer het resultaat als .xls bestand. Beschouw de bandintensiteit van de experimentele run met de laagste BaCDA-activiteit als de referentie-intensiteit en analyseer de expressie van elke baan.
  2. Test van enzymactiviteit
    1. Bepaal de BaCDA-activiteit met behulp van een acetaattestkit15, met behulp van ethyleenglycolchitine (1 mg/ml; EGC) als het substraat29.
    2. Laat 20 μL BaCDA reageren met 40 μL van het substraat in aanwezigheid van 40 μL 50 mM Tris-HCl (pH 7) buffer gedurende 1 uur bij 30 °C door te roeren bij 800 rpm.
    3. Centrifugeer na 1 uur de 100 μL reactant door een kolom van 3 kDa bij 2.111 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het retentaat bestaande uit BaCDA weg en vang het acetaatfiltraat op dat tijdens de reactie vrijkomt. Gebruik het filtraat voor de acetaattest om de BaCDA-activiteit te bepalen.
      OPMERKING: Eén eenheid van het enzym wordt gedefinieerd als de activiteit waarbij 1 μM acetaat per microliter enzym per minuut uit het substraat vrijkomt. De enzymactiviteitstest werd uitgevoerd in drievouden en de respectieve enzymactiviteit werd dienovereenkomstig berekend.
  3. Fermentatiekinetiek van lactose-inductie
    1. Onderzoek het activiteitenprofiel om het punt van lactose-inductie en het startpunt van expressie te bepalen. De activiteitsprofilering wordt gemaakt door biomassa en BaCDA-activiteit te schatten met de geoptimaliseerde fermentatieomstandigheden.
    2. Bepaal de glucoseconcentratie in de media met behulp van een glucoseschattingskit. Zet het activiteitsprofiel uit met behulp van biomassa, glucoseconcentratie en BaCDA-activiteit tegen de fermentatietijd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesoptimalisatie van de expressie van periplasmatisch recombinant enzym chitinedeacetylase in E. coli met behulp van centraal composietontwerp (CCD)
Het pET22b-Ba CDA-construct gaf, wanneer gekweekt in niet-geoptimaliseerde omstandigheden, een maximale biomassaopbrengst en BaCDA-activiteit van respectievelijk 22,26 ± 0,98 g/L en 84,67 ± 0,56 U/L15. In de huidige studie werd een statistische benadering CCD toegepast...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gedeacetyleerd chitine, chitosan, heeft vele toepassingen, vooral op biomedisch gebied30. De reproduceerbaarheid van chitosan met betrekking tot de mate van acetylering (DA) en het acetyleringspatroon (PA) is echter een belangrijk punt van zorg, naast andere milieubezwaren. De groenere route, met behulp van enzymen, is dus benut. De reeks CDA's kan worden gebruikt om chitosan te creëren met een uniek patroon van deacetylering, wat hun biomedische toepassingen zou ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag de Manipal Academy for Higher Education (MAHE) bedanken voor het MAHE UNSW-fonds, en de auteurs willen de Council of Scientific & Industrial Research - Human Resource Development Group (CSIR-MHRD), Govt. of India bedanken voor een senior research fellowship, award letter-nummer 09/1165(0007)2K19 EMR-I d.d. 31.3.2019.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kits
Acetaat assay kitMegazyme, IerlandK-ACETAKHet protocol is licht aangepast en geoptimaliseerd om de test uit te voeren in een 96-wellsplaat
Glucose schatting kitAgappe diagnosis Ltd., India12018013Het protocol is licht aangepast en geoptimaliseerd om de test uit te voeren in een 96-wellsplaat
Chemicaliën
AzijnzuurHi-media, IndiaAS001Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE kleuring en ontkleurende oplossing
AcrylamidHi-media, IndiaMB068Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE gel
Ammonium pursulphatHi-media, IndiaMB003Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE gel
Bis-acrylamideHi-media, IndiaMB005Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE gel
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, IndiaMB092Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE kleuring en ontkleurende oplossing
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, IndiaMB153Gebruikt voor het bereiden van Bardford's assay
Ethyleenglycol chitosanSigma-aldrich, VSE1502Gebruikt om Ethyleenglycol chitin te bereiden en Ethyleenglycol chitin werd gebruikt als substraat voor enzymatische reactie
D-glucoseHi-media, IndiaMB037Gebruikt als mediacomponent.
ImidazolHi-media, IndiaGRM1864Gebruikt in lysisbuffer
LactoseHi-media, IndiaGRM017Gebruikt als mediacomponent.
MethanolFinar, India30930LC250Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE kleuring en ontkleurende oplossing
Natriumchloride (NaCl)Hi-media, IndiaMB023Gebruikt in lysisbuffer
FosforzuurHi-media, IndiaMB157Gebruikt voor het bereiden van Bardford's assay
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Hi-media, IndiaGRM6218Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE gel
Natriumfosfaat dibasisch anhydrousHi-media, IndiaMB024Gebruikt om TB sald voor media en buffer voor enzymatische reactie te bereiden.
Natriumfosfaat monobasisch anhydrousHi-media, IndiaGRM3964Gebruikt om TB sald voor media en buffer voor enzymatische reactie te bereiden.
Tetramethylethyleendiamine (TEMED)Hi-media, IndiaMB026Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE gel
Tris baseHi-media, IndiaMB029Gebruikt voor het bereiden van SDS-PAGE gel
TryptoneHi-media, IndiaRM7707Gebruikt als mediacomponent.
GistextractHi-media, IndiaRM027Gebruikt als mediacomponent.
Apparatuur
AlphaImager HP geldocumentatie-eenheidProteinSimple, VS92-13823-00Gebruikt om SDS-PAGE foto's vast te leggen
BenchtopmixerEppendorf, Duitsland 9.776 660Gebruikt om voor enzymatische reactie met 2 mL-adapter te houden
Bioincubator shakerTrishul instruments, India13410622Gebruikt om bacteriecultuur bij verschillende temperatuur en RPM te incuberen
BiospectrofotometerEppendorf, Duitsland 6135000009Gebruikt om alle spectroscopische metingen te doen
KoelcentrifugeEppendorf, Duitsland 5805000017Gebruikt om cultuur, lysaal en alle andere centrifugeringsprotocollen te centrifugeren
DroogbadLabnet International, VSS81522039Gebruikt om eiwitmonster te denatureren voor SDS-PAGE
MicropipettenEppendorf, Duitsland 3123000900Gebruikt door het protocol voor volumemetingen
SchudderTrishul instruments, India11770719Gebruikt om SDS-PAGE gel te schudden voor kleuring en ontkleur
SDS-PAGE-eenheidBio-Rad, VS1658001FCGebruikt om SDS-PAGE gel te gieten en uit te voeren
UltrasonificatorSonics & Materials, Inc., VSVCX 130Gebruikt om de bacteriële cel te lyseren door ultrasonificatie
WeegschaalSartorius, DuitslandBSA124 SGebruikt om gewicht te meten door het protocol
Apparaten
Nanosep Centrifugal Devices met Omega-membraan (3 kDa)PALL life sciences, VSOD003C33Gebruikt om enzym te scheiden na substraatbehandeling
SoftwaresVersieOntwikkeld bij
MINITAB17.0  (Proefversie) The Pennsylvania State UniversityGebruikt om het experimentele model te ontwerpen en de gegevens te analyseren
ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)Gebruikt om het expressieniveau te analyseren met behulp van SDS-PAGE-afbeelding
Plasmid
pET22b (+) DNA—NovagenMerck- Millipore, VS69744Opgeslagen bij − 20 °C
Cellen
E. coli Rosetta pLysS—NovagenMerck- Millipore, VS70956Bewaard in Luria–Bertani (LB) bouillon bevattend 25% glycerol bij − 80 °C

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadav, M., et al. Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing. 6 (1), 1-20 (2019).
  2. Anil, S. Potential medical applications of chitooligosaccharides. Polymers. 14 (17), 3558(2022).
  3. Amiri, H., et al. Chitin and chitosan derived from crustacean waste valorization streams can support food systems and the UN Sustainable Development Goals. Nature Food. 3 (10), 822-828 (2022).
  4. Wattjes, J., et al. Patterns matter part 1: Chitosan polymers with non-random patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104583(2020).
  5. Cord-Landwehr, S., et al. Patterns matter part 2: Chitosan oligomers with defined patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104577(2020).
  6. He, Y., Xu, J., Wang, S., Zhou, G., Liu, J. Optimization of medium components for production of chitin deacetylase by Bacillus amyloliquefaciens Z7, using response surface methodology. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 28 (2), 242-247 (2014).
  7. Pareek, N., Vivekanand, V., Saroj, S., Sharma, A. K., Singh, R. P. Purification and characterization of chitin deacetylase from Penicillium oxalicum SAE M-51. Carbohydrate Polymers. 87 (2), 1091-1097 (2012).
  8. Yonis, R. W., Luti, K. J. K., Aziz, G. M. Statistical optimization of chitin bioconversion to produce an effective chitosan in solid state fermentation by Asperigellus flavus. Iraqi Journal of Agricultural Sciences. 50 (3), 916-927 (2019).
  9. Deeba, F., Shakir, H. A., Irfan, M., Khan, M., Qazi, J. I. Utilization of agro-industrial waste for chitinase production by locally isolated bacillus subtilis using response surface methodology. Pakistan Journal of Zoology. 54 (2), 551-560 (2022).
  10. Pandey, A., Tripathi, A. H., Tripathi, P. H. Production, purification, and application of the microbial enzymes. Industrial Applications of Microbial Enzymes. , CRC Press. 19-39 (2022).
  11. Bhat, P., et al. Expression of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli pLysS: Sustainable production, purification and characterisation. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 1008-1013 (2019).
  12. Hamer, S. N., et al. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases. Scientific Reports. 5, 8716(2015).
  13. Kadokura, K., et al. Production of a recombinant chitin oligosaccharide deacetylase from Vibrio parahaemolyticus in the culture medium of Escherichia coli cells. Biotechnology Letters. 29 (8), 1209-1215 (2007).
  14. Liu, J., et al. Identification and characterization of a chitin deacetylase from a metagenomic library of deep-sea sediments of the Arctic Ocean. Gene. 590 (1), 79-84 (2016).
  15. Pawaskar, G. M., Raval, K., Rohit, P., Shenoy, R. P., Raval, R. Cloning, expression, purification and characterization of chitin deacetylase extremozyme from halophilic Bacillus aryabhattai B8W22. Biotech. 11 (12), 515(2021).
  16. Raval, R., Simsa, R., Raval, K. Expression studies of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli Rosetta cells. International Journal of Biological Macromolecules. 104, 1692-1696 (2017).
  17. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).
  18. Yang, G., et al. Enzymatic modification of native chitin and chitin oligosaccharides by an alkaline chitin deacetylase from Microbacterium esteraromaticum MCDA02. International Journal of Biological Macromolecules. 203, 671-678 (2022).
  19. Amer, O. A., et al. Exploring new marine bacterial species, Alcaligenes faecalis Alca F2018 valued for bioconversion of shrimp chitin to chitosan for concomitant biotechnological applications. International Journal of Biological Macromolecules. 196, 35-45 (2022).
  20. Packiam, K. A. R., Ramanan, R. N., Ooi, C. W., Krishnaswamy, L., Tey, B. T. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (8), 3253-3266 (2020).
  21. Jayakumar, D., Sachith, S. K., Nathan, V. K., Rishad, K. S. M. Statistical optimization of thermostable alkaline protease from Bacillus cereus KM 05 using response surface methodology. Biotechnology Letters. 43 (10), 2053-2065 (2021).
  22. Balakrishnan, R., Mohan, N., Sivaprakasam, S. Application of design of experiments in bioprocessing: process analysis, optimization, and reliability. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 289-319 (2022).
  23. Papaneophytou, C. P., Kontopidis, G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review. Protein Expression and Purification. 94, 22-32 (2014).
  24. Tang, S. R., Somasundaram, B., Lua, L. H. L. Protein expression optimization strategies in E. coli: a tailored approach in strain selection and parallelizing expression conditions. Methods in Molecular Biology. 2406, 93-111 (2022).
  25. Nag, N., Khan, H., Tripathi, T. Strategies to improve the expression and solubility of recombinant proteins in E. coli. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , Academic Press. 1-12 (2022).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  27. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of staining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  28. Etemadzadeh, M. H., Arashkia, A., Roohvand, F., Norouzian, D., Azadmanesh, K. Isolation, cloning, and expression of E. coli BirA gene for biotinylation applications. Advanced Biomedical Research. 4, 149(2015).
  29. Yin, L., Wang, Q., Sun, J., Mao, X. Expression and molecular modification of chitin deacetylase from Streptomyces bacillaris. Molecules. 28 (1), 113(2023).
  30. Hamedi, H., Moradi, S., Hudson, S. M., Tonelli, A. E., King, M. W. Chitosan based bioadhesives for biomedical applications: A review. Carbohydrate Polymers. 282, 119100(2022).
  31. Falak, S., Sajed, M., Rashid, N. Strategies to enhance soluble production of heterologous proteins in Escherichia coli. Biologia. 77 (3), 893-905 (2022).
  32. Shahzadi, I., et al. Scale-up fermentation of Escherichia coli for the production of recombinant endoglucanase from Clostridium thermocellum. Scientific Reports. 11 (1), 7145(2021).
  33. Ganjave, S. D., Dodia, H., Sunder, A. V., Madhu, S., Wangikar, P. P. High cell density cultivation of E. coli in shake flasks for the production of recombinant proteins. Biotechnology Reports. 33, 00694(2022).
  34. Wurm, D. J., et al. The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (20), 8721-8729 (2016).
  35. Gennari, A., et al. Recombinant production in Escherichia coli of a β-galactosidase fused to a cellulose-binding domain using low-cost inducers in fed-batch cultivation. Process Biochemistry. 124, 290-298 (2023).
  36. Mostovenko, E., Deelder, A. M., Palmblad, M. Protein expression dynamics during Escherichia coli glucose-lactose diauxie. BMC Microbiology. 11, 126(2011).
  37. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-32 (2014).
  38. Studier, F. W. Stable cultures and auto-induction for inducible protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-22 (2014).
  39. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  40. Selvaraj, S., Natarajan, K., Nowak, A., Murty, V. R. Mathematical modeling and simulation of newly isolated bacillus cereus M1GT for tannase production through semi-solid state fermentation with agriculture residue triphala. South African Journal of Chemical Engineering. 35 (1), 89-97 (2021).
  41. Ghahremanifard, P., Rezaeinezhad, N., Rigi, G., Ramezani, F., Ahmadian, G. Designing a novel signal sequence for efficient secretion of Candida antarctica lipase B in E. coli: The molecular dynamic simulation, codon optimization and statistical analysis approach. International Journal of Biological Macromolecules. 119, 291-305 (2018).
  42. Vuillemin, M., Malbert, Y., Laguerre, S., Remaud-Siméon, M., Moulis, C. Optimizing the production of an α-(1→2) branching sucrase in Escherichia coli using statistical design. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (12), 5173-5184 (2014).
  43. Sattari, F., Rigi, G., Ghaedmohammadi, S. The first report on molecular cloning, functional expression, purification, and statistical optimization of Escherichia coli-derived recombinant Ficin from Iranian fig tree (Ficus carica cv.Sabz). International Journal of Biological Macromolecules. 165, 2126-2135 (2020).
  44. Hajihassan, Z., Biroonro, N. Enhanced expression of recombinant activin A in Escherichia coli by optimization of induction parameters. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran. 29 (2), 105-111 (2018).
  45. Rigi, G., Mohammadi, S. G., Arjomand, M. R., Ahmadian, G., Noghabi, K. A. Optimization of extracellular truncated staphylococcal protein A expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 217-225 (2014).
  46. Faust, G., Stand, A., Weuster-Botz, D. IPTG can replace lactose in auto-induction media to enhance protein expression in batch-cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences. 15 (8), 824-829 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chitin DeacetylaseRecombinant ExpressionE Coli RosettaChitosan ProductionProcess OptimizationCentral Composite DesignResponse Surface MethodologyEnzyme KineticsLactose InductionFermentation Process
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen