Bepaling van de paringsefficiëntie van haploïden in Saccharomyces cerevisiae

Summary

In dit werk wordt een robuuste methode beschreven voor de kwantificering van de paringsefficiëntie in de gist Saccharomyces cerevisiae . Deze methode is met name nuttig voor de kwantificering van pre-zygote barrières in soortvormingsstudies.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae is een veelgebruikt modelorganisme in de genetica, evolutie en moleculaire biologie. In de afgelopen jaren is het ook een populair modelorganisme geworden om problemen met betrekking tot soortvorming te bestuderen. De levenscyclus van gist omvat zowel aseksuele als seksuele voortplantingsfasen. Het gemak van het uitvoeren van evolutie-experimenten en de korte generatietijd van het organisme maken de studie van de evolutie van voortplantingsbarrières mogelijk. De efficiëntie waarmee de twee paringstypen (a en α) paren om de a/α diploïde te vormen, wordt de paringsefficiëntie genoemd. Elke afname van de paringsefficiëntie tussen haploïden duidt op een pre-zygote barrière. Om de mate van reproductieve isolatie tussen twee haploïden te kwantificeren, is dus een robuuste methode nodig om de paringsefficiëntie te kwantificeren. Hiertoe wordt hier een eenvoudig en zeer reproduceerbaar protocol gepresenteerd. Het protocol omvat vier hoofdstappen, waaronder het patchen van de haploïden op een YPD-plaat, het mengen van de haploïden in gelijke aantallen, verdunnen en plateren voor afzonderlijke kolonies en ten slotte het berekenen van de efficiëntie op basis van het aantal kolonies op een drop-out plaat. Auxotrofe markers worden gebruikt om duidelijk het onderscheid te maken tussen haploïden en diploïden.

Introduction

Saccharomyces cerevisiae, gewoonlijk ontluikende gist genoemd, is een eencellige eukaryoot. Het heeft twee paringstypen, een en α, en vertoont zowel aseksuele als seksuele voortplantingscycli. De a- en α-paringstypen zijn haploïden en kunnen mitoïde delen in afwezigheid van het andere paringstype in de omgeving, dat de aseksuele cyclus van gist vertegenwoordigt. Wanneer de twee paringstypen dicht bij elkaar zijn, stoppen ze mitotisch met delen en fuseren ze tot een diploïde cel. De diploïde gist kan zich mitotisch delen wanneer voedingsstoffen aanwezig zijn of meiose ondergaan onder de omstan....

Protocol

OPMERKING: Het protocol omvat in grote lijnen de volgende stappen: (1) het patchen van de haploïden in de paringsefficiëntieroosters op een YPD-plaat, (2) het mengen van de haploïden in gelijke aantallen na 24 uur incubatie en het geven van de gemengde haploïden een paar uur om te paren (7 uur in deze studie), (3) het plateren van de gemengde cellen op YPD voor het isoleren van enkele kolonies na 7 uur bij 30 °C, en ten slotte (4) het bepalen van het aantal diploïden gevormd met behulp van de auxotrofe markers. Deze stappen worden hieronder in detail besproken (zie ook figuur 2).

1. Patchen van haploïden....

Results

Kwantificering van de paringsefficiëntie van de twee paringstypen
Het hier beschreven protocol werd gebruikt om de paringsefficiëntie tussen twee giststammen te kwantificeren - tussen SK1AM a en SK1AM α en tussen ScAMa en ScAMα (figuur 3A). In deze experimenten werd de paring tussen de twee haploïden minstens 12 keer herhaald. In elk van de herhalingen van het experiment werden minstens 100 kolonies gest.......

Discussion

De kwantificering van de paringsefficiëntie in S. cerevisiae is essentieel voor het uitvoeren van studies met betrekking tot de genen die betrokken zijn bij paringsroutes of het bestuderen van de invloed van de externe omgeving op paringsgedrag. In de afgelopen twee decennia is S. cerevisiae ook een populair model geworden om vragen met betrekking tot soortvorming 14,36,37,38 te beantwoorden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma Life Science	A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology	SRL	19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR	HiMedia	GRM1273
D-(+)-glucose	Sigma Life Science	G8270
Glass Petri plates	HiMedia	PW008	90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine	Sigma Life Science	A8094
L-Aspartic acid	Sigma Life Science	A7219
L-Histidine monochloride monohydrate	Sigma Life Science	H5659
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Life Science	L8912
L-Lysine	Aldrich	62840
L-Methionine	Sigma Life Science	M5308
L-Phenylalanine	Sigma Life Science	P5482
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tyrosine	Sigma Life Science	T8566
L-Valine	Sigma Life Science	V0513
Mating efficiency grid			1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes	Tarsons	500010
Peptone	HiMedia	RM001
Uracil	Sigma Life Science	U0750
Yeast Extract Powder	HiMedia	RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate	BD Difco	233520