Het huidige protocol beschrijft hoogfrequente echografie voor het visualiseren van de gehele schildklier van de muis en het monitoren van de groei van anaplastisch schildkliercarcinoom.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hoge-resolutie echografie voor de analyse van orthotopische ATC-tumoren in een genetisch gemanipuleerd muismodel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) wordt geassocieerd met een slechte prognose en korte mediane overlevingstijd, maar geen enkele effectieve behandeling verbetert de resultaten aanzienlijk. Genetisch gemanipuleerde muizenmodellen die de progressie van ATC nabootsen, kunnen onderzoekers helpen om behandelingen voor deze ziekte te bestuderen. Het kruisen van drie verschillende genotypen van muizen, een TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgeen ATC-model werd ontwikkeld. Het ATC-muizenmodel werd geïnduceerd door een intraperitoneale injectie van tamoxifen met overexpressie van BrafV600E en deletie van Trp53, en de tumoren werden binnen ongeveer 1 maand gegenereerd. Echografie met hoge resolutie werd toegepast om de tumorinitiatie en -progressie te onderzoeken en de dynamische groeicurve werd verkregen door de tumorgroottes te meten. In vergelijking met magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en computertomografie scanning, heeft echografie voordelen bij het observeren van het ATC-muizenmodel, zoals niet-invasief, draagbaar, in realtime en zonder blootstelling aan straling. Echografie met hoge resolutie is geschikt voor dynamische en meervoudige metingen. Echechografisch onderzoek van de schildklier bij muizen vereist echter relevante anatomische kennis en ervaring. Dit artikel biedt een gedetailleerde procedure voor het gebruik van echografie met hoge resolutie om tumoren in het transgene ATC-model te scannen. Ondertussen worden ultrasone parameteraanpassing, echografie, anesthesie en herstel van de dieren en andere elementen die aandacht nodig hebben tijdens het proces vermeld.
Inleiding
Hoewel anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) verantwoordelijk is voor minder dan 2% van de schildklierkankers, veroorzaakt het jaarlijks meer dan 50% van de schildklierkankergerelateerde sterfgevallen. De mediane overlevingstijd na diagnose met ATC is slechts ongeveer 6 maanden en er zijn geen behandelingen beschikbaar die de overleving aanzienlijk verbeteren 1,2.
De zeldzaamheid van ATC heeft het onderzoek belemmerd dat bestudeert hoe de ziekte begint en agressief vordert. Onlangs zijn genetisch gemanipuleerde muismodellen beschikbaar gekomen die de ziekte nabootsen, die inzicht geven in de ziekte en de reacties op mogelijke behandelingen 3,4,5. Dergelijke studies vereisen nauwkeurige tumorbeeldvorming voor metingen en monitoring, die meestal wordt uitgevoerd met behulp van magnetische resonantiebeeldvorming, computertomografie of echografie met hoge resolutie 6,7. Echografie is op grote schaal gebruikt in muizenorganen. Het heeft voordelen ten opzichte van magnetische resonantie beeldvorming en computertomografie omdat het in realtime kan worden uitgevoerd en het onderwerp niet blootstelt aan straling, en de benodigde apparatuur is klein genoeg om draagbaar te zijn 8,9. Studies over het continu monitoren van ATC-groei met behulp van echografie zijn echter zeldzaam; Daarom onderzoekt dit werk het nut van echografie in deze context.
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het gebruik van echografie met hoge resolutie om tumoren nauwkeurig te scannen, te monitoren en te meten in een muismodel van ATC.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De huidige studie werd uitgevoerd met goedkeuring van de Animal Care and Use Committee van de Sichuan University. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgene muizen10 werden gebruikt in deze studie (zie tabel met materialen). De protocolstappen kunnen indien nodig worden aangepast voor verschillende diersoorten. Twaalf muizen, waaronder zes vrouwtjes en zes mannetjes, met een gemiddelde leeftijd van 93 dagen, werden hier gebruikt.
1. Experimentele voorbereiding
- Schakel het echografiesysteem in (zie Materiaaltabel) en maak een nieuwe map voor het vastleggen van de afbeeldingen en het verzamelen van de gegevens. Selecteer de 40 MHz lijnsonde en klik op het oppervlakkige weefselpatroon om de oppervlakkige weefseltransducer te activeren. Gebruik de "B-modus" voor schildklierbeeldvorming (figuur 1A).
OPMERKING: B-modus is de basis ultrasone beeldvormingsmodus. Het uiterlijk van echografiebeelden is afhankelijk van de fysieke interacties van geluid met de weefsels in het lichaam. B-mode beelden worden geproduceerd als grijze beelden11,12. - Houd de muizen in specifieke kooien met vrije toegang tot voedsel en water. Plaats de kooi op een aanvullend verwarmingsapparaat (zie materiaaltabel) om thermoregulatie te garanderen.
- Zorg voor voldoende isofluraan in de vaporizer en O2 in de tank. Als de voorraden ontoereikend zijn, ruil dan de tanks in voor nieuwe.
- Reinig het dierbeeldvormingsplatform met steriele zoutoplossing en schakel de verwarmingsknop in. Controleer of de temperatuur 38-40 °C is voordat u het dier op het platform plaatst (figuur 1C).
2. Voorbereiding van dieren voor beeldvorming
- Schakel de isofluraan vaporizer in. Breng de muis over van de kooi naar de verdovingsdoos.
- Verdoof het dier met een mengsel van 1%-2% isofluraan uit de verdamper en zuurstof die met 0,8 l/min stroomt.
- Breng ontharingscrème aan van de borst naar de nek, wacht 30 seconden en veeg vervolgens de crème en vacht volledig weg. Spoel het gebied en de omliggende vacht grondig af met warme steriele zoutoplossing.
- Plaats het verdoofde dier op het verwarmde platform. Bedek de snuit met een neuskegel die is aangesloten op de anesthesie-uitlaat (figuur 2A, B).
OPMERKING: De muis moet binnen 1-2 minuten volledig worden verdoofd. Als het dier nog steeds actief is, voer dan langdurige isofluraaninductie uit totdat het dier niet langer een pedaalterugtrekkingsreflex vertoont. Zorg ervoor dat het dier stabiel ademt. - Controleer tijdens het maken van de beeldvorming de hartslag van de muis via het verwarmde platform.
OPMERKING: Het echografiebeeldvormingssysteem is uitgerust met een hartslagmeter. - Gebruik plakband om de ledematen van de muis aan het verwarmde platform te bevestigen, met het dier in rugligging. Zorg ervoor dat de neuskegel stabiel is geplaatst met een constante verdovingsgasstroom (1,5 l/min).
- Bescherm de ogen door oogzalf aan te brengen.
3. Beeldvorming van tumoren
- Pas het beeldvormingssysteem aan om de resolutie te optimaliseren. Stel de volgende parameters in: tweedimensionale versterking, 25-30 dB; beelddiepte, 10 mm; aantal aandachtszones, 3; en midden, 3-6 mm.
OPMERKING: Voor deze studie werd een 40 MHz-sonde gebruikt. De B-modus is gespecificeerd voor data-acquisitie. - Breng royaal ultrasone gel (zie tabel met materialen) aan op het gebied van de blote huid.
- Houd de sonde vast en plaats deze in contact met de ultrasone gel op de borst en scan vervolgens van de borst naar de nek om de schildklier te lokaliseren (figuur 2C).
OPMERKING: Oefen voorzichtig druk uit tijdens het scannen; Overmatige druk op de nek van het dier kan hijgen of apneu veroorzaken. Dit protocol is ontwikkeld op basis van handheld scanning, maar gemechaniseerd scannen kan ook worden uitgevoerd met behulp van een machine om de sonde te begeleiden, zoals een dierbeeldvormingsplatform dat langs de x- en y-as beweegt. - Scan omhoog en omlaag om de grenzen van de tumor te identificeren en de grootte en vorm ervan te beoordelen.
OPMERKING: Een gezonde schildklier verschijnt meestal als een hypoechogene, homogene structuur voor de luchtpijp. Anaplastische tumoren zorgen ervoor dat de schildklier veel groter lijkt, wat gemakkelijk kan worden geïdentificeerd door nekscans (figuur 3). - Identificeer de ATC-tumoren van de luchtpijp en riemspieren, afhankelijk van de anatomische locatie en echografie-echo.
OPMERKING: De riemspieren bevinden zich voor de schildklier en luchtpijp, evenals achter de schildklier. De echo van de riemspieren lijkt hoger dan die van de ATC, terwijl verzwakking bestaat achter de luchtpijp13.- Bevestig op basis van de indruk van de totale tumor het beeldgedeelte met de grootste tumordiameter van links naar rechts. Druk op de vriesknop en meet de anteroposterieure en van links naar rechts tumordiameters met behulp van de ultrasone remklauw.
OPMERKING: De anteroposterieure diameter moet loodrecht op de linker-naar-rechts tumordiameter worden gemeten (figuur 4). De tumorgrootte van de ATC werd berekend door de anteroposterieure diameter te vermenigvuldigen met de links-naar-rechts tumordiameter14. Omdat de grootte van de tumoren aan de linker- en rechterkant inconsistent was, werd elke kant van de tumoren afzonderlijk berekend. De totale grootte van de tumoren werd verkregen door de bilaterale tumoren toe te voegen. De maten werden geregistreerd om de groeicurve van de ATC te observeren.
- Bevestig op basis van de indruk van de totale tumor het beeldgedeelte met de grootste tumordiameter van links naar rechts. Druk op de vriesknop en meet de anteroposterieure en van links naar rechts tumordiameters met behulp van de ultrasone remklauw.
- Sla de opname op als een cine-loop, wat de beoordeling van de geselecteerde afbeeldingen vergemakkelijkt.
4. Terugwinning van dieren
- Veeg na het scannen de ultrasone gel af en verwijder de fixatietape van de ledematen van het dier.
- Plaats de muis op het aanvullende verwarmingsapparaat (stap 1.2). Leg het dier op zijn zij (figuur 2D).
- Nadat de muis is hersteld (~ 5 min), breng u deze terug naar de kooi.
- Reinig het echografiesysteem, de sonde en het platform met een zachte doek en isopropylalcohol of glutaaraldehydedoekjes.
- Schakel het beeldvormingssysteem uit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gemiddelde rechter ATC-grootte aan het begin van het onderzoek was 4,867 mm 2 en de gemiddelde linker ATC-grootte was 5,189 mm2. Bij de vierde meting was de gemiddelde rechter ATC-grootte gegroeid tot 11,844 mm 2, terwijl de tumorgrootte van de linkerkwab was gegroeid tot 9,280 mm2. De totale ATC-grootte steeg van 10,057 mm 2 naar 15,843 mm2. In de latere fase van het onderzoek groeide de ATC snel. In termen van de muis met het label "P92" (tabe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol maakt gebruik van echografie met hoge resolutie om orthotopische ATC-tumoren te analyseren in een genetisch gemanipuleerd muismodel. Het transgene model, met een genotype van TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, is ontwikkeld in ons laboratorium. De dieren overexpresseren BrafV600E en missen Trp53; Het intraperitoneaal injecteren van de dieren met tamoxifen leidt tot tumorgroei na ongeveer 1 maand10. De tumoren groeien snel...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek ontving geen specifieke subsidie van publieke, commerciële of non-profit financieringsagentschappen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Zelfklevende tape | Winner | ||
| Anesthesie systeem | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt muizen | Samenwerking met Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Kamer voor anesthesie-inductie | RWDlifescience | ||
| Wattenstaafjes | Winner | ||
| Ontharingscrème | Veet | ||
| Elektrische verwarmingsdeken | Petbee | ||
| Isofluraannevelizer | RWDlifescience | ||
| Medische handschoenen | Winner | ||
| Papieren handdoeken | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 muizen | Samenwerking met Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt muizen | Samenwerking met Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasoundgel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound apparaat | VisualSonics | Vevo 3100 |
Referenties
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527(2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731(2017).
- Renault, G., et al. High-resolution ultrasound imaging of the mouse. Journal of Radiologie. 87, 1937-1945 (2006).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M. Basic principles of ultrasonic diagnosis. GEN. 39 (4), 283-289 (1985).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35, 131-137 (2007).
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
