Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Evaluatie van de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van zuivelbiofilms met behulp van een aanpak die statische en dynamische methoden combineert

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64619

⸱

9 december 2022

 ,  ,  , 
1Département des Sciences des Aliments, Institut sur la Nutrition et les Aliments Fonctionnels, Université Laval

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een aanpak die statische en dynamische methoden combineert om de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van biofilms in de zuivelindustrie te evalueren. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van nieuwe biologische of chemische formuleringen voor de bestrijding van biofilms te testen.

Samenvatting

De aanwezigheid van biofilms in de zuivelindustrie is van groot belang, omdat ze kunnen leiden tot de productie van onveilige en gewijzigde zuivelproducten vanwege hun hoge weerstand tegen de meeste clean-in-place (CIP) -procedures die vaak worden gebruikt in verwerkingsfabrieken. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe biofilmcontrolestrategieën voor de zuivelindustrie te ontwikkelen. Dit protocol is gericht op het evalueren van de werkzaamheid van organische peroxyzuren (perazijnzuur, perpropionzuur en permelkzuur en een commercieel desinfectiemiddel op basis van perazijnzuur) voor het uitroeien van zuivelbiofilms met behulp van een combinatie van statische en dynamische methoden. Alle ontsmettingsmiddelen werden getest op de sterkste biofilmproducerende bacteriën in een enkele of een gemengde biofilm met behulp van de minimale biofilmuitroeiingsconcentratie (MBEC) -test, een statische screeningsmethode met hoge doorvoer. Een contacttijd van 5 minuten met de ontsmettingsmiddelen in de aanbevolen concentraties heeft zowel de enkelvoudige als de gemengde biofilms met succes uitgeroeid. Studies zijn momenteel aan de gang om deze waarnemingen te bevestigen met behulp van de biofilmreactor van het Center for Disease Control (CDC), een dynamische methode om in situ-omstandigheden na te bootsen. Dit type bioreactor maakt het gebruik van een roestvrijstalen oppervlak mogelijk, dat de meeste industriële apparatuur en oppervlakken vormt. De voorlopige resultaten van de reactor lijken de werkzaamheid van organische peroxyzuren tegen biofilms te bevestigen. De gecombineerde aanpak die in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt voor het ontwikkelen en testen van nieuwe biologische of chemische formuleringen voor het beheersen van biofilms en het uitroeien van micro-organismen.

Inleiding

De zuivelindustrie is wereldwijd een belangrijke industriële sector, ook in Canada, waar meer dan 10.500 melkveebedrijven per jaar bijna 90 miljoen hL melk produceren1. Ondanks de strenge hygiëne-eisen die in de zuivelindustrie worden gesteld, ook in verwerkingsbedrijven, vormt melk een geweldig kweekmedium voor micro-organismen, en dus bevatten zuivelproducten waarschijnlijk micro-organismen, waaronder bederf of pathogene micro-organismen. Deze ziekteverwekkers kunnen verschillende ziekten veroorzaken; Salmonella sp. en Listeria monocytogenes kunnen bijvoorbeeld respectievelijk gastro-enteritis en meningitis veroorzaken2. Bederfmicro-organismen kunnen de kwaliteit en organoleptische eigenschappen van zuivelproducten beïnvloeden door gassen, extracellulaire enzymen of zuren te produceren3. Het uiterlijk en de kleur van de melk kunnen ook worden veranderd, bijvoorbeeld door Pseudomonas spp.4.

Sommige van deze micro-organismen kunnen biofilms vormen op verschillende oppervlakken, waaronder roestvrij staal. Dergelijke biofilms maken de persistentie en vermenigvuldiging van micro-organismen op het oppervlak van de apparatuur mogelijk en dus de verontreiniging van de zuivelproducten5. Biofilms zijn ook problematisch vanwege hun vermogen om de warmteoverdracht te belemmeren en de corrosie van de apparatuur te versnellen, wat leidt tot voortijdige vervanging van de apparatuur en dus tot economische verliezen6.

Clean-in-place (CIP) procedures stellen de voedingsindustrie in staat om de groei van micro-organismen te beheersen. Deze procedures omvatten het opeenvolgende gebruik van natriumhydroxide, salpeterzuur en soms ontsmettingsmiddelen die hypochloorzuur en perazijnzuur 7,8 bevatten. Hoewel hypochloorzuur zeer effectief is tegen micro-organismen, reageert het ook met natuurlijk organisch materiaal, waardoor toxische bijproducten ontstaan9. Perazijnzuur genereert geen schadelijke bijproducten10; De effectiviteit tegen biofilms in de voedingsindustrie is echter zeer variabel10,11. Onlangs zijn andere peroxyzuren, waaronder perpropionzuur en permelkzuur, bestudeerd op hun antimicrobiële activiteit en ze lijken een goed alternatief te zijn voor de controle van microbiële groei in biofilms12,13.

Daarom was deze studie gericht op het evalueren van de werkzaamheid van organische peroxyzuren (perazijnzuur, perpropionzuur en permelkzuur en een desinfectiemiddel op basis van perazijnzuur) voor het uitroeien van zuivelbiofilms met behulp van een aanpak die de minimale biofilmuitroeiingsconcentratie (MBEC) -test, een statische screeningsmethode met hoge doorvoer en de biofilmreactor van het Center for Disease Control (CDC) combineert, een dynamische methode die in situ nabootst Voorwaarden. De MBEC-test wordt in het protocol hierna "biofilm microtiterplaten" genoemd. Het hier gepresenteerde protocol en de representatieve resultaten tonen de werkzaamheid van organische peroxyzuren en hun potentiële toepassing voor het beheersen van microbiële biofilms in de zuivelindustrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het werk in dit artikel vereist een laboratorium van bioveiligheidsniveau 2 en werd eerder goedgekeurd (projectnummer 119689) door het institutionele bioveiligheidscomité van de Université Laval.

OPMERKING: Het stroomdiagram in figuur 1 geeft een samenvatting van de methodologie die statische en dynamische benaderingen combineert en die werd gebruikt om de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van biofilms te evalueren.

1. Voorbereiding van materialen

  1. Microbiële isolaten
    1. Schakel de biologische veiligheidskast (BSC) 15 minuten voor gebruik in en reinig deze met een alcoholoplossing van 70% (v/v).
    2. Zodra de BSC steriel is, plaatst u een injectieflacon met het te testen microbiële isolaat (Pseudomonas azotoformans of Brevundimonas vesicularis in deze studie), een entlus, een buis van 15 ml gevuld met 10 ml steriele tryptische sojabouillon (TSB) en een vortexmixer. Desinfecteer voor plaatsing in het BSC alle materialen met alcohol.
    3. Vortex de injectieflacon met microbieel isolaat om de cultuur te homogeniseren.
    4. Breng aseptisch 20 μL van het microbiële isolaat over in 10 ml steriel TSB in een buis van 15 ml en incubeer het bij 30 °C gedurende 16-24 uur met roeren bij 160 tpm.
      LET OP: B. vesicularis moet worden gebruikt in een laboratorium van inperkingsniveau 2 in overeenstemming met de richtlijnen die vereist zijn voor het hanteren van pathogene organismen. De handler moet goed opgeleid zijn en een veiligheidsbril, handschoenen en een jas dragen.
  2. Ontsmettingsmiddelen
    1. Voeg voor de bereiding van de organische peroxyzuuroplossing (60 ml) 24 ml waterstofperoxide en 36 ml zuur (azijnzuur, propionzuur of melkzuur) toe aan een erlenmeyer van 250 ml. Voeg vervolgens een vooraf gedefinieerd volume van 10 M zwavelzuur toe (655 μL voor perazijnzuur, 635 μL voor perpropionzuur of 715 μL voor permelkzuur). Schud de erlenmeyer voorzichtig om te mengen en doe de kolf in een waterbad van 30 °C in de chemische kap. Incubeer de kolf gedurende 2 dagen, met elke ochtend voorzichtig mengen.
      OPMERKING: Het commerciële desinfectiemiddel op basis van perazijnzuur (zie materiaaltabel) werd rechtstreeks door de fabrikant geleverd.
      LET OP: De ontsmettingsmiddelen moeten onder een chemische kap worden gebruikt. Veiligheidsbrillen en handschoenen moeten worden gedragen voor de duur van het experiment. Voor meer informatie over de desinfectiemiddelen verwijzen wij u naar het betreffende veiligheidsinformatieblad.
    2. Voer titratie van waterstofperoxide uit zoals hieronder beschreven.
      1. Leg een leeg bekerglas van 300 ml op een analytische balans (zie materiaaltabel) en tarra op de weegschaal. Weeg ongeveer 0,23 g ontsmettingsmiddel in het bekerglas en noteer het exacte gewicht dat is toegevoegd. Voeg 100 g koude 1 N zwavelzuuroplossing toe aan het bekerglas, voeg een magnetische roerstaaf toe aan het bekerglas en leg deze op een roerplaat.
      2. Laat de oplossing roeren tot volledige homogenisatie. Voeg vervolgens drie druppels van een ferroïne-indicatoroplossing (0,1 wt% in H2O) toe aan het bekerglas en titreer met 0,1 N ceriumsulfaatoplossing totdat de oplossing verandert van een zalmroze kleur in een lichtblauwe kleur. Let op het volume van de toegevoegde ceriumsulfaatoplossing.
      3. Bereken het percentage waterstofperoxide met behulp van de volgende formule:
        figure-protocol-1 Eq. (1)
        waarbij S het volume van de toegevoegde ceriumsulfaatoplossing is, N de normaliteit van de ceriumsulfaatoplossing (0,1 N), W het gewicht van het monster is (~0,2300 g) en 0,017 = (1 mol H 2 O 2/2 mol Ce) × (34,0147 g H 2 O 2 /1 mol H 2 O)2×(1 L/1.000 ml)
    3. Voer titratie van de organische peroxyzuren uit zoals hieronder beschreven.
      1. Voeg 20 ml 7,5% (m/v) kaliumjodideoplossing toe aan een bekerglas. Titreer langzaam met 0,1 N natriumthiosulfaatoplossing totdat de blauwe kleur van de oplossing lichtbruin/oranje begint te worden.
      2. Voeg 2 ml zetmeeloplossing (1 wt% in H2O) toe aan het bekerglas en titreer met 0,1 N natriumthiosulfaatoplossing totdat de oplossing verandert van zwart in oranje. Let op het volume natriumthiosulfaatoplossing dat wordt gebruikt.
      3. Bereken het percentage organisch peroxyzuur met de volgende formule:
        figure-protocol-2 Eq. (2)
        waarbij T het volume van de gebruikte natriumthiosulfaatoplossing is, N de normaliteit van de natriumthiosulfaatoplossing (0,1 N), W het gewicht van het monster is (~0,2300 g) en 0,038 = (1 mol CH 3 COOOH/1 mol I 2) × (1 mol I 2/2 mol S2 O 3) × (76,06 g/1 mol CH3COOOH) × (1 L/1.000 ml)
        OPMERKING: Herhaal stap 1.2.2 en stap 1.2.3 met nog twee monsters om elke test in drievoud uit te voeren.

2. Vorming van enkelvoudige en gemengde biofilms

  1. Biofilm microtiter platen
    1. Vortex de buis die de bacteriecultuur bevat (20 μL van de stam + 10 ml TSB-medium, bereid in stap 1.1.4). Voer seriële verdunning en plating uit op tryptische soja-agar (TSA) om het aantal bacteriële cellen (kve) van de nachtcultuur te bepalen. Breng vervolgens aseptisch 100 μL van de cultuur over in 10 ml steriel TSB-medium (voor een eindconcentratie van ongeveer 2 x 107 kve/ml).
      OPMERKING: Voor de test met de bioreactor wordt een volume van 100 μL van het microbiële isolaat overgebracht in 100 ml steriel TSB.
    2. Vortex de buis. Breng voor elke bacterie de verdunde bacteriecultuur over op de biofilmmicrotiterplaat (150 μL per put) in drievoud met behulp van een meerkanaalspipet. Laad 150 μL TSB-medium in drie nieuwe putten om als bedieningselementen te dienen. Incubeer de biofilmmicrotiterplaat (zie materiaaltabel) bij 30 °C gedurende 24 uur zonder te roeren.
      OPMERKING: Voeg voor gemengde biofilmtests 75 μL van elke suspensie toe voor een totaal volume van 150 μL. De biofilm microtiterplaat bevat pinnen in de deksels, waarop de biofilms zich vormen.
  2. Bioreactor
    1. Reinig en droog de delen van de bioreactor (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant en bereid de reactor voor zoals hieronder beschreven.
      1. Plaats eerst het platte mes in het glazen bekerglas (bioreactor) van 1 L, dat met een magnetische staaf aan de houder is bevestigd, en houd de opstelling rechtop door middel van de plastic staaf die aan de binnenkant van het deksel van de bioreactor is bevestigd.
      2. Plaats de roestvrijstalen coupons of dia's (zie materiaaltabel) op hun polypropyleen staven met behulp van de schroevendraaier en steek ze in de gaten in het deksel, zonder hun uitlijnpennen in de inkepingen te plaatsen, zodat stoom kan ontsnappen tijdens sterilisatie.
      3. Bedek alle ventilatieopeningen van de bioreactor met aluminiumfolie en wikkel de rest van de apparatuur, namelijk de buizen L / S 18 (ID = 7,9 mm) en L / S 16 (ID = 3,1 mm), de glasstroombreuk, de containerdoppen, de schroevendraaiers, de tang en 0,2 μm-filters, met aluminiumfolie.
        OPMERKING: Plaats de siliconen slang (zie materiaaltabel) in de weerhaak op het binnenoppervlak van de middelgrote containerdop.
      4. Autoclaaf: de bioreactor die gedurende 20 minuten in een droge cyclus bij 121 °C is opgesteld.
    2. Voer biofilmvorming uit in de bioreactor in batchmodus (eerste stap).
      1. Sluit in een BSC het ene uiteinde van de slang L / S 18 aan op de uitlaattuit van de bioreactor en houd het andere uiteinde gewikkeld in aluminiumfolie om de steriliteit te behouden.
      2. Verwijder een coupon of schuifhouder uit het deksel van de bioreactor en plaats deze in een steriele buis van 50 ml. Vul daarna het bekerglas van de bioreactor met 340 ml 300 mg / L TSB-medium door het gat dat door de staaf werd ingenomen met behulp van een serologische pipet van 50 ml.
      3. Ent het kweekmedium in de bioreactor met 1 ml van de bacteriële oplossing (~ 108 kve / ml P. azotoformans) met behulp van een pipet van 5 ml door dezelfde opening die eerder werd gebruikt, en plaats de staaf vervolgens terug in zijn oorspronkelijke positie. Plaats de stangen die al in de dekselgaten zijn geplaatst zo dat de pinnen in hun respectievelijke inkepingen passen.
      4. Plaats een bacterieel luchtzuiveringsfilter van 0,2 μm aan het einde van de buis met de kleinste diameter, die zich op het deksel van de bioreactor bevindt. De andere buis van dezelfde diameter blijft permanent aangesloten met een metalen schroefdop of een siliconen plug die goed sluit.
      5. Plaats de bioreactor gedurende 24 uur boven de op 30 °C ingestelde verwarmingsplaat en roer op 130 tpm.
        OPMERKING: Gebruik voor biofilmvorming met meerdere soorten een gelijk volume van de verschillende bacterieculturen om een totaal volume van 1 ml voor het entmateriaal te verkrijgen.
    3. Voer biofilmvorming uit in de bioreactor in continue stroommodus (tweede stap).
      1. Plaats een carboy met 18 L steriel gedestilleerd water in de BSC en voeg 2 L 1.000 mg/L TSB kweekmedium toe om een eindconcentratie van 100 mg/L te verkrijgen.
      2. Bedek de container met de steriele dop, waarop twee buizen zijn aangesloten. De eerste is een siliconenbuis die aan de binnenkant van de dop is bevestigd en wordt gebruikt om het medium te pompen. De tweede buis (L/S 16) is aangesloten op de externe poort om de vloeistof naar de bioreactor te laten stromen. Plaats een filter van 0,2 μm in de tweede buis op het deksel van de middelgrote container.
      3. Sluit deze tweede buis aan op de peristaltische pomp en verbind het andere uiteinde met de glasstroombreuk, die vervolgens in de grotere buis op het deksel van de bioreactor wordt geplaatst.
      4. Gebruik nog eens 20 L carboy om het effluent van de bioreactor op te vangen. Bevestig het uiteinde van de buis die is aangesloten op de uitlaattuit van de bioreactor aan de dop van de afvalcontainer. Plaats een filter van 0,2 μm in de buis die beschikbaar is op het deksel van deze container.
      5. Start de peristaltische pomp met een debiet van 11,3 ml/min en laat het systeem 24 uur draaien.
        OPMERKING: Het debiet (11,3 ml/min) van het kweekmedium of de melk die tijdens de biofilmvorming in de bioreactor werd gebruikt, werd bepaald door 340 ml (wat overeenkomt met het volume van de vloeistof in de reactor) te delen door de verblijftijd van 30 minuten.
    4. Herstel de bacteriële biofilm.
      1. Schakel de peristaltische pomp uit en stop met het roeren en verwarmen van de bioreactor.
      2. Verwijder voorzichtig elke staaf uit de bioreactor en spoel de coupons of dia's 3x in 40 ml PBS om planktonbacteriën te elimineren. Laat daarna de coupons los of schuif in steriele conische buizen van 50 ml met 40 ml PBS met behulp van een geschikte schroevendraaier. Draai de buizen gedurende 30 s, breng ze over op een rek dat in een ultrasoonapparaatbad is geplaatst en soniceer de buizen op 40 kHz gedurende 30 s (wat 110 W vermogen vereist). Herhaal deze bewerking 3x.
      3. Verzamel de 40 ml biofilmsuspensies in steriele conische buisjes van 50 ml en spoel de coupons of dia's vervolgens af met 2 ml steriele PBS-oplossing. Recupereer deze spoelvloeistof en voeg deze toe aan de reeds verzamelde biofilmsuspensie.
    5. Inventariseer de levensvatbare bacteriën in de biofilm: Voer met de verkregen biofilmsuspensie 10-voudige seriële verdunningen uit en plaat vervolgens 100 μL van de 10−5 en 10−6 verdunningen op TSA in drievoud. Incubeer de platen bij 30 °C gedurende 24 uur. Tel het aantal kolonies dat aanwezig is op de agarplaten en bereken de bacteriële dichtheid op de coupons en dia's (levensvatbare sessiele bacteriën) volgens ASTM E2562-1714 met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-3 Eq. (3)
      waarbij X het aantal kolonievormende eenheden (CFU) is, B het volume (0,1 ml), V het volume is waarin de biofilm is gesuspendeerd (de stamoplossing), A het oppervlak van de coupon of dia is dat door de biofilm wordt bedekt en D de verdunningsfactor is.

3. Kwantitatieve evaluatie van de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van biofilms

  1. Biofilm microtiter platen
    1. Voeg 200 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) toe aan drie putjes van een 96-well microplaat.
    2. Breng het deksel van de biofilmmicroplaat, met biofilms die zich op de haringen hebben gevormd, gedurende 10 s over naar de 96-well microplate met de PBS om de biofilms te wassen en planktonbacteriën te elimineren.
    3. Bereid de ontsmettingsmiddelen voor in de vereiste concentraties (bijv. 25 ppm, 50 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 5.000 ppm, 10.000 ppm en 25.000 ppm werkzame stof).
      OPMERKING: Alle verdunningen worden aseptisch gemaakt met steriel gedestilleerd water.
    4. Voeg 200 μL van elke concentratie desinfectiemiddel toe aan de putjes van een nieuwe 96-well microtiterplaat in drievoud. Breng het deksel van de biofilmmicrotiterplaat over op deze 96-well microtiterplaat met de desinfectiemiddelen en incuber de plaat bij kamertemperatuur voor de gewenste blootstellingstijd.
    5. Voeg 200 μL Dey-Engley neutraliserende bouillon toe aan de putjes van een nieuwe 96-well microtiterplaat. Breng het deksel van de biofilmmicrotiterplaat over op de 96-well microtiterplaat met de neutraliserende bouillon. Sluit de microtiterplaat af met parafilm en plaats deze gedurende 30 minuten in de badsonicator op 40 kHz.
    6. Verwijder na 30 minuten de microtiterplaat van de sonicator en verwijder de parafilm. Breng 100 μL over van de eerste kolom van de 96-putplaat met de biofilms die na ultrasoonapparaat zijn losgekomen, naar de eerste rij van een nieuwe 96-well microtiterplaat.
    7. Voeg 180 μL steriel 1x PBS toe aan de putjes van de nieuwe 96-well microplate (bereid in stap 3.1.6), met uitzondering van de eerste rij. Breng 20 μL van de biofilmoplossing over van de eerste rij naar de putjes in de tweede rij met 180 μL 1x PBS (rij 2, verdunning: 10−1). Breng vervolgens 20 μL van de vloeistof in de tweede rij over naar de putjes in de volgende rij met 180 μL 1x PBS (rij 3, verdunning: 10−2). Herhaal dezelfde procedure om verdunningen tussen 10−5 en 10−7 te verkrijgen.
    8. Ent 100 μL van de verdunningen op TSA en incuber de platen volgens de parameters die nodig zijn voor de groei van elke bacterie.
    9. Tel na incubatie de cfu's en bereken de log 10-dichtheid voor elke pin en de log10-reductie bij elke desinfectiemiddelconcentratie met de volgende vergelijkingen:
      figure-protocol-4 Eq. (4)
      waarbij X de kolonievormende eenheden is die ter plaatse worden geteld, B het volume (0,01 ml), V het putvolume (0,20 ml), A het penoppervlak (46,63 mm2) en D de verdunning.
      figure-protocol-5 Eq. (5)
    10. Herhaal elk experiment 3x op onafhankelijke dagen.
      OPMERKING: De "minimale concentratie van desinfectiemiddel dat de biofilm uitroeit", of MBEC, komt overeen met de laagste desinfectiemiddelconcentratie die geen bacteriegroei vertoont.
  2. Bioreactor
    OPMERKING: De procedure van de ASTM-norm E2871-1915 wordt gevolgd om deze test uit te voeren met P. azotoformans PFlA1.
    1. Begin met het vormen van de biofilms op de coupons in de bioreactor, zoals beschreven in stap 2.2. Verwijder vervolgens de staaf die de coupons bevat en spoel deze af in een conische buis met 30 ml PBS.
    2. Laat elke coupon in een steriele conische buis van 50 ml vallen met behulp van een schroevendraaier en voeg vervolgens 4 ml van de juiste organische peroxyzuuroplossing of PBS toe voor de controle. Incubeer gedurende 5 minuten en voeg vervolgens 36 ml Dey-Engley neutraliserende bouillon toe. Vortex gedurende 30 s en vervolgens soniceren op 40 kHz gedurende 30 s met behulp van een sonicatorbad. Herhaal het proces 3x om de biofilmsuspensie te verkrijgen.
    3. Spoel op dezelfde manier alle andere staven af en herstel de biofilms uit de coupons. Voer seriële verdunningen uit van de biofilmsuspensie en plaat 0,1 ml op TSA-medium. Incubeer de platen bij 30 °C gedurende 24 uur.
    4. Tel na incubatie de cfus en bereken vervolgens de biofilmdichtheid voor elke coupon (Eq. 6), de gemiddelde logdichtheid (LD) voor elke set van drie coupons uit dezelfde staaf, inclusief behandeld en gecontroleerd (Eq. 7), en de logreductie voor het ontsmettingsmiddel (Eq. 8) met behulp van de volgende vergelijkingen:
      figure-protocol-6 Eq. (6)
      waarbij X het gemiddelde is van de getelde kolonievormende eenheden/coupon, B het volume (0,1 ml), V het volume ontsmettingsmiddel of PBS plus neutralisator (40 ml) en D de verdunning.
      figure-protocol-7 Eq. (7)
      figure-protocol-8 Eq. (8)

4. Kwalitatieve evaluatie van de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van biofilms

OPMERKING: Na behandeling met de desinfectiemiddelen (stap 3.1.1 tot stap 3.1.5) werden de P. azotoformans-biofilms die zich vormden op de pinnen van de biofilmmicrotiterplaat in de statische methode voorbereid en geanalyseerd door observatie op scanning elektronen- en confocale microscopen.

  1. Scanning elektronenmicroscopie (SEM)
    1. Voeg 200 μL 1x PBS toe aan drie putjes van een 96-well microplaat. Breng het deksel van de biofilmmicrotiterplaat (stap 3.1.5) over naar de 96-well microplaat met PBS en laat het gedurende 10 s op kamertemperatuur om de Dey-Engley neutraliserende bouillon te verwijderen.
    2. Verwijder de pinnen van de biofilm microtiterplaat met behulp van een gesteriliseerde naaldneustang. Plaats elke pin in een lege injectieflacon onder een kap en voeg primair fixatief (5% glutaaraldehyde in 0,1 M Na cacodylaatbuffer pH 7,5) toe aan elke injectieflacon. Sluit elke injectieflacon af en incubeer ze gedurende 24 uur bij 4 °C.
    3. Decanteer na incubatie het fixeermiddel met een pipet en gooi al het vloeibare afval weg in een geschikte container. Verwijder de doppen van elke injectieflacon en plaats ze in een kap om ze 72 uur aan de lucht te drogen.
    4. Monteer de monsters op aluminium stompen (zie materiaaltabel) door epoxyhars (zie materiaaltabel) aan te brengen op het vlakke bovenoppervlak van elke stomp. Bevestig vervolgens de haringen voorzichtig met een tang op de stompen.
    5. Metaliseer de monsters met een EMS950x + 350s goudsputter (zie materiaaltabel) gedurende 4 minuten bij 2 x 10−1 bar argondruk en 20 mA stroom. Voer de juiste aarding uit door de zijkant van de pen onbelicht op het goud te schilderen met zilververf (zie Materiaaltabel).
    6. Verkrijg beelden op een scanning elektronenmicroscoop met behulp van de SEM control user interface versie 6.28 (zie Tabel van Materialen). De versnellingsspanning die in deze studie werd gebruikt was 15 kV en de vergrotingen waren 300x en 2.000x.
  2. Confocale microscopie
    1. Voeg 200 μL 1x PBS toe aan drie putjes van een 96-well microtiterplaat. Breng het deksel van de biofilmmicroplaat over naar de 96-putplaat met de PBS en laat het 10 s staan om de Dey-Engley-neutraliserende bouillon te verwijderen.
    2. Bereid oplossingen van fluorescerende vlekken door 3 μL groene fluorescerende vlek en 3 μL rode fluorescerende vlek (zie materiaaltabel) toe te voegen aan 1 ml steriel water.
    3. Voeg 200 μL kleuringsoplossing toe aan een put van een 96-well microtiterplaat. Breng het deksel van de biofilmmicrotiterplaat over op de 96-putplaat met de kleuringsoplossing. Bedek de biofilm microtiterplaat met aluminiumfolie en incubeer het monster gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Voeg 200 μL gesteriliseerd water toe aan de putten van een 96-well microplaat. Breng vervolgens het deksel van de biofilmmicroplaat over naar de 96-well microplaat met het water en laat het staan tot observatie.
    5. Visualiseer de biofilms gevormd op de haringen met behulp van een confocale laserscanmicroscoop (zie materiaaltabel) met een 63x/1.40 olie DIC-objectief. Verkrijg de afbeeldingen met behulp van de bijbehorende software (zie Materiaaltabel). De fluorescentie-excitatiegolflengten die werden gebruikt voor de groene en rode fluorescerende vlekken waren respectievelijk 482 nm en 490 nm.
      OPMERKING: Voor het beste resultaat, snijd en plaats de pen in een 60 mm petrischaal en vul de schaal met steriel water.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De SEM-analyse toont de aanwezigheid van biofilms geproduceerd door P. azotoformans PFl1A op de microplaatpennen van de biofilm (figuur 2A). Een driedimensionale biofilmstructuur kan worden waargenomen. De P. azotoformans PFl1A werd eerder geïdentificeerd als een sterke biofilmproducent (A570 > 1,5) met behulp van 96-well microtiterplaten12.

Bovendien bleek de P. azotoformans PFl1A-biofilm die zich met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De MBEC-test (biofilm microplate assay) was de eerste methode die door de ASTM17 werd erkend als een standaard biofilmuitroeiingstest. Onze studie en anderen hebben aangetoond dat er twee kritieke stappen zijn bij het gebruik van deze test: de ultrasoonapparaatstap (tijd en kracht) en de desinfecterende behandelingstijd18. Stewart en Parker suggereerden ook andere parameters die de uitkomst van de test zouden kunnen beïnvloeden, zoals de microbiële soort, biofilmleeftijd, o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ)(2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc en de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). We danken Teresa Paniconi voor de kritische beoordeling van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm filters Corning09-754-28diameter: 50 mm, PTFE- Membrane
316 roestvrijstalen schijf couponBiosurface Technologies CorporationRD128-316
316 roestvrijstalen schuif couponBiosurface Technologies CorporationCBR 2128-316
96-microtiterplaatCorning07-200-89cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate 
AzijnzuurSigma Aldrich27225bewaar bij RT
Aluminium stubsElectron Microscopy Science75830-1032x5mm
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25%Electron Microscopy Sciences16220bewaar bij -20 °C
AB204-S/FACT Analytische weegschaalMettler ToledoAB204-S
Bacterieel Vent Filter (0.45 µm)Biosurface Technologies CorporationBST 02915
BioDestroyGroupe Sani Marc09-10215commercieel perazijnzuur-based desinfectiemiddel, bewaar bij RT
Carboy LDPE 20 LCole Parmer06031-52
CDC biofilm reactorBiosurface Technologies CorporationCRB 90bioreactor
Cer (IV) sulfaatThermo Scientific35650-K2bewaar bij RT
Confocal laser scanning microscoop  LSM 700ZeissLSM 700
Dey-Engley neutraliserende bouillonMilliporeD3435-500Gbewaar bij 4 °C
EMS950x + 350s goud sputter Electron Microscopy Sciences
EpoxyharsElectron Microscopy Sciences14121met BDMA
Ethyl alcohol 95%, USPGreenfield globalP016EA95bewaar bij RT
Ferroin indicator oplossingSigma Aldrich318922-100MLbewaar bij RT
Vullen/ventilatiekapCole ParmerRK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability KitInvitrogenL10316fluorescente celviabiliteitskit (SYTO 9: groene fluorescente vlek, Propidiumjodide: rode fluorescente vlek), bewaar bij - 20 °C
Glas stroomonderbrekerBiosurface Technologies CorporationFB 50
Goud met zilver verf Electron Microscopy Sciences12684-15
Verwarmingsplaat setBiosurface Technologies Corporation110V Stir Plate
Hex schroevendraaierBiosurface Technologies CorporationCBR 5497
WaterstofperoxideSigma216763bewaar bij 4 °C
Inoculantie lussenVWR12000-812steriele, 10 µl
MelkzuurLaboratoire MATLU-0200bewaar bij RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 met EASY-LOAD II peristaltiek pomp en 77200-50 HoofdCole Parmer77200-60
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculatie met een 96-well basisInnovotech19111Biofilm microtiter plaat
Oxford agar basisThermo ScientificOXCM0856Bbewaar bij 4 °C
Kunststof coupon houderBiosurface Technologies CorporationCBR 2203
Kunststof schuif houder staafBiosurface Technologies CorporationCBR 2203-GL
KaliumjodideFisher ChemicalP410-500bewaar bij RT
Precisie gekartelde schroevendraaier (1,5 mm x 40 mm)Wiha26015
PropionzuurLaboratoire MATPF-0221bewaar bij RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading BalanceCole Parmer UZ-11976-3
Scanning elektronenmicroscoop JSM-6360LV modelJEOLJSM-6360LVSEM en gebruikerscontrole interface
Schroefdopbuis, 15 mLSarstedt62.554.205(LxØ): 120 x 17 mm, materiaal: PP, conische bodem, transparant, HD-PE
Schroefdopbuis, 50 mLSarstedt62.547.205(LxØ): 114 x 28 mm, materiaal: PP, conische bodem, transparant, HD-PE
Natriumcacodylaat TrihydraatElectron Microscopy Sciences 12300bewaar bij -20 °C
NatriumthiosulfaatThermo ScientificAC124270010bewaar bij RT
Sonicatie badFisher15-336-1225,7 L
Starch oplossingAnachemiaAC8615bewaar bij RT
ZwavelzuurSigma Aldrich258105-500MLbewaar bij RT
Tryptic soja agarBD BactoDF0369-17-6bewaar bij RT
Tryptic soja bouillonBD BactoDF0370-17-3bewaar bij RT
Tubing Masterflex L/S 16 25'Cole ParmerMFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25'Cole ParmerMFX0642418
Tygon SPT-3350 siliconen slang Saint-GobainABW18NSFIDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.
VortexCole ParmerUZ-04724-00
Waterbad VWR89202-970
Zen softwareZeiss

Referenties

  1. Canada's dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre. , Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017).
  2. Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).
  3. Fondation de technologie laitière du Québec. Science et technologie du lait. 3rd edn. , Les Presses de l'Université Laval. Quebec. (2018).
  4. Evanowski, R., et al. Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk. Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).
  5. Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology. 7 (5), 152-157 (1996).
  6. Gupta, S., Anand, S. Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers. International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).
  7. Marchand, S., et al. Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).
  8. Silva, H. O., et al. Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk. Frontiers in Microbiology. 9, 2934(2018).
  9. Sedlak, D. L., von Gunten, U. Chemistry. The chlorine dilemma. Science. 331 (6013), 42-43 (2011).
  10. vander Veen, S., Abee, T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).
  11. Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes. Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).
  12. Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants. Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921(2022).
  13. Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces. Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).
  14. ASTM International. ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2562-17.html (2017).
  15. ASTM International. ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2871-19.html (2019).
  16. Niboucha, N., et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor. Frontiers in Microbiology. 13, 892181(2022).
  17. ASTM International. ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International. , West Conshohocken, PA. Available from: https://www.astm.org/e2799-17.html (2022).
  18. Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).
  19. Stewart, P. S., Parker, A. E. Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020(2019).
  20. Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context. International Dairy Journal. 126, 105264(2022).
  21. Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).
  22. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).
  23. Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).
  24. Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies. Pathogens. 10 (9), 1212(2021).
  25. Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm. Food Microbiology. 92, 103592(2020).
  26. Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness. Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885(2020).
  27. Goeres, D. M., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. Recent Trends in Biofilm Science and Technology. Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L. , Academic Press. Cambridge, MA. 71-88 (2020).
  28. Fjeld, C. S., Schüller, R. B. Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses. Annual Transactions - The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).
  29. Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).
  30. Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Biofilmeliminatiestatische screeningMBEC assayCDC biofilmreactorroestvrijstalen oppervlakkenPseudomonas azotoformansbiofilmbeheersingsstrategie n
Evaluatie van de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van zuivelbiofilms met behulp van een aanpak die statische en dynamische methoden combineert
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.