Methodenartikel

Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging

DOI:

10.3791/64626

⸱

11 november 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 5Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 6Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden zijn een betrouwbare methode voor het modelleren van orgaanweefsel vanwege hun zelforganiserende eigenschappen en behoud van functie en architectuur na voortplanting uit primair weefsel of stamcellen. Deze methode van organoïde generatie ziet af van eencellige differentiatie door meerdere passages en gebruikt in plaats daarvan differentiële centrifugatie om borstepitheelorganoïden te isoleren van mechanisch en enzymatisch gedissocieerde weefsels. Dit protocol biedt een gestroomlijnde techniek voor het snel produceren van kleine en grote epitheliale organoïden uit zowel muis- als menselijk borstweefsel, naast technieken voor organoïde inbedding in collageen en kelder extracellulaire matrix. Bovendien worden instructies voor in-gel fixatie en immunofluorescente kleuring gegeven met als doel de organoïde morfologie en dichtheid te visualiseren. Deze methodologieën zijn geschikt voor talloze downstream-analyses, zoals co-kweek met immuuncellen en ex vivo metastasemodellering via collageeninvasietest. Deze analyses dienen om het gedrag van celcellen beter op te helderen en een vollediger begrip te creëren van interacties binnen de micro-omgeving van de tumor.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om epitheelcellen in vitro te modelleren is de basis geweest van modern biomedisch onderzoek omdat het cellulaire kenmerken vastlegt die in vivo niet toegankelijk zijn. Het kweken van epitheelcellijnen in een tweedimensionaal vlak kan bijvoorbeeld een beoordeling geven van de moleculaire veranderingen die optreden in een epitheelcel tijdens proliferatie1. Bovendien is het meten van de dynamische regulatie tussen signalering en genexpressie beperkt in in vivo systemen2. In kankeronderzoek heeft kankerepitheelcellijnmodellering de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire aanjagers van ziekteprogressie en potentiële medicijndoelen3. Het kweken van kankerepitheelcellijnen op een tweedimensionaal vlak heeft echter beperkingen, omdat de meeste genetisch vereeuwigd en gemodificeerd zijn, vaak klonaal van aard, geselecteerd op hun vermogen om te groeien in niet-fysiologische omstandigheden, beperkt in hun beoordeling van driedimensionale (3D) tumorweefselarchitectuur, en micro-omgevingsinteracties niet adequaat modelleren binnen een realistische weefselomgeving4. Deze beperkingen zijn vooral duidelijk bij het modelleren van metastase, die in vivo verschillende verschillende biologische stadia omvat, waaronder invasie, verspreiding, circulatie en kolonisatie op de verre orgaanlocatie5.

Kankerepitheelorganoïden zijn ontwikkeld om de 3D-omgeving en het gedrag van tumoren beter samen te vatten 6,7,8. Organoïden werden voor het eerst ontwikkeld uit enkele LRG5+ intestinale cryptecellen en gedifferentieerd om de 3D-structuur van crypt-villuseenheden weer te geven die de hiërarchische structuur van de dunne darm in vitrohandhaafden 9. Deze aanpak maakte real-time visualisatie en karakterisering van zelforganiserende weefselarchitectuur onder homeostatische en stressomstandigheden mogelijk. Als een natuurlijke uitbreiding werden kankerepitheelorganoïden ontwikkeld om veel verschillende soorten kanker te modelleren, waaronder colorectale 10, pancreas 11, borst12, lever13, long14, hersenen15 en maagkanker16. Kankerepitheliale organoïden zijn gebruikt om kankerevolutie17,18 en gemetastaseerd spatiotemporale gedrag 19,20 te karakteriseren en tumorheterogeniteit 21 te ondervragen en chemotherapieënte testen 22. Kankerepitheelorganoïden zijn ook geïsoleerd en verzameld tijdens lopende klinische onderzoeken om de respons van patiënten op antikankermiddelen en bestralingstherapie ex vivo 8,23,24,25 te voorspellen. Bovendien kunnen systemen met kankerepitheelorganoïden worden gecombineerd met andere niet-kankercellen, zoals immuuncellen, om een uitgebreider model van de tumormicro-omgeving te vormen om interacties in realtime te visualiseren, te ontdekken hoe kankerepitheelcellen de fundamentele aard van cytotoxische effector-immuuncellen zoals natuurlijke killercellen veranderen en potentiële immunotherapieën en antilichaamafhankelijke cytotoxische activiteit te testen26, 27,28. Dit artikel demonstreert een methode voor het genereren van epitheliale organoïden zonder passaging en inbedding in collageen en kelder extracellulaire matrix (ECM). Daarnaast worden ook technieken voor downstream beeldvorming van geïsoleerde organoïden gedeeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al het muizenweefsel dat in dit manuscript wordt gebruikt, is ethisch verzameld in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas. Evenzo stemden alle patiënten in voorafgaand aan weefseldonatie onder toezicht van een Institutional Review Board (IRB) en werden de monsters gedeïdentificeerd.

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de generatie van organoïden uit primair weefsel.

1. Nachtelijke bereiding van materialen

  1. Voor inbedding in de extracellulaire matrix van de kelder (BECM), ontdooi het BECM-aliquot door het bij 4 °C te laten.

2. Bereiding van collagenase en runderserumalbumine (BSA) coatingoplossing

  1. Bereid 2,64% BSA/PBS-coatingoplossing (BSA-oplossing): steriel filter 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 4,10 ml 30% BSA-oplossing met behulp van een 50 ml/0,2 μm filterkolf. Deze BSA-oplossing kan worden gefilterd en opnieuw worden gebruikt.
  2. Bereid collagenase-oplossing voor borstweefsel van muizen: steriel filter 27 ml basaalcelmedium, 1,5 ml foetaal runderserum (FBS), 30 μl 50 mg/ml gentamicine, 15 μl insuline van 10 mg/ml, 600 μl van 0,1 g/ml collagenase A en 600 μl van 0,1 g/ml trypsine met behulp van een filterkolf van 50 ml/0,2 μm. Wijs tussen 10 ml en 30 ml collagenase-oplossing per muis toe, afhankelijk van de weefselmassa.
  3. Bereid collagenase-oplossing voor menselijk borstweefsel: steriel filter 18 ml RPMI-1640, 200 μl 100x penicilline-streptomycine-oplossing (pen/strepto), 200 μl 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) buffer, 1 ml FBS en 400 μl 0,1 g/ml collagenase A met behulp van een filterkolf van 50 ml/0,2 μm. Wijs tussen 10 ml en 20 ml per weefselmonster toe, afhankelijk van de weefselmassa.

3. Media voorbereiden

  1. Bereid organoïde media: Steriel filter basaalcelmedium met 1% pen/streptokokken en 1% insuline-transferrine-selenium (ITS) met behulp van een 50 ml/0,2 μm filterkolf. Om organoïde groeifactormedia te maken, voegt u de basisfibroblastgroeifactor (bFGF) toe aan een eindconcentratie van 2,5 nM.
  2. Bereid borstepitheelmedia voor: Om 100 ml borstepitheelmedia te maken, filtert u een hoog glucosegehalte gewoon basaal medium met 1 ml 100x glutaminesupplement, 1 ml pen / streptokokken, 1 ml 10 mM HEPES-buffer (7,3 pH), 250 μl 30% BSA-stam, 1 μl 1 mg / ml choleratoxinevoorraad, 1 ml 50 μg / ml hydrocortisonvoorraad in PBS, 50 μL van 10 mg/ml humane insuline-oplossing, 10 μL van 50 μg/ml epidermale groeifactor (EGF) en 1% FBS met behulp van een 150 ml/0,2 μm filterkolf. Bewaar de media bij 4 °C en gebruik ze maximaal 2 weken.
  3. Amfotericine wassen: Steriele filter PBS met 2% pen/streptokokken en 2% amfotericine B. Bewaren bij 4 °C.

4. Verzamelen en verteren van weefsel

  1. Borstweefsel van muizen
    1. Euthanaseer de muis door deze gedurende 2-5 minuten in een CO2-kamer te plaatsen en volg dan met cervicale dislocatie. Met de ventrale kant naar boven gericht, splay muisledematen en gebruik vier naalden van 19 G om de muis bij de poten vast te pinnen op een bord bedekt met een absorberende pad. Spray met 70% ethanol om de vacht glad te maken en de huid te ontsmetten. Veeg uitwerpselen weg met een gaasje of tissue.
    2. Begin net boven het anogenitale gebied, knip omhoog vanaf de middellijn met een chirurgische schaar en zorg ervoor dat u niet door het peritoneum prikt. Bij het bereiken van de kin, maak laterale sneden door beide sleutelbeenderen en achterpoten naar beneden en speld de huid van de muis strak op het bord om borstvetkussens bloot te leggen.
    3. Lokaliseer de inguinale borstvetkussentjes op wild-type muizen door de inguinale lymfeklier in de buurt van de achterpoten te identificeren. Lokaliseer de thoracale borstvetkussens op wild-type muizen als het dikkere, gevasculariseerde weefsel onder de voorste ledematen.
    4. Gebruik een tang om het borstvetkussen te verhogen. Vermijd het verzamelen van onderliggende spieren. Gebruik het stompe uiteinde van een scherp-stompe schaar en maak een zak onder het borstvetkussen, weg van de huid. Snijd het borstvetkussentje in één compleet stuk weg.
    5. Zodra borstvetkussentjes zijn verwijderd, spoelt u ze in PBS voordat u ze in een steriele weefselkweekschaal plaatst. Snel overbrengen naar een weefselkweekkap.
      OPMERKING: Gebruik voor borsttumoren een wattenstaafje bevochtigd met PBS om de tumor voorzichtig van de huid weg te rollen. Zorg ervoor dat u donkere of zachte gebieden vermijdt, omdat donkere verkleuring wijst op necrose, die geen gezonde organoïden zal opleveren.
    6. Hak de borsttumoren fijn met een # 10 of # 11 scalpel om weefsel los te maken totdat het een pasta-achtige consistentie bereikt. Breng het gehakte weefsel over in een conische buis met 10-30 ml collagenase-oplossing met behulp van een scalpel. Om ervoor te zorgen dat al het weefsel wordt verzameld, pipetteer 1 ml collagenase-oplossing op de weefselkweekplaat en terug in de conische buis.
      OPMERKING: Om grotere organoïden te produceren, moet de mechanische spijsvertering worden geminimaliseerd, waardoor enkele kleine zichtbare stukjes weefsel intact blijven. Als alternatief kan weefsel bevroren worden opgeslagen voor latere organoïdepreparatie met minimaal verlies van levensvatbaarheid. Om dit te doen, wast u weefsel in een oplossing van PBS of basale celmedia + 1% FBS en hakt u vervolgens grof fijn om het oppervlak te vergroten (het weefsel in een of twee vaste stukken houden). Verplaats het weefsel naar een cryo-injectieflacon, bedekt met vriesmedia (90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO)). Vries de injectieflacons een nacht in een vriescontainer met gecontroleerde snelheid in voordat u ze in vloeibare stikstof opslaat.
    7. Plaats de conische buis in een benchtop-incubator van 37 °C bij 180 RPM totdat het weefsel draadachtig wordt en de collagenase-oplossing troebel wordt. Een grote weefselmassa (ongeveer 500-800 mg) van een tumor duurt bijvoorbeeld 30-60 minuten. Een kleinere weefselmassa (ongeveer 100-300 mg) van wild-type borstvet pads duurt ongeveer 20-30 minuten. Als u het niet zeker weet, controleer dan met tussenpozen van 5 minuten.
    8. Na incubatie, centrifugeer de conische buis gedurende 10 minuten bij 550 x g bij kamertemperatuur (RT).
    9. Zuig het supernatant voorzichtig uit de conische buis.
      OPMERKING: Ga vooruit, bedek alle pipetpunten, serologische pipetten en conische buizen met BSA-oplossing om verlies van organoïden als gevolg van hechting aan plastic te voorkomen.
    10. Voeg 8 ml basaalcelmedia en 80 μl DNase-oplossing [2 E/μL] toe aan de buis. Keer zachtjes om gedurende 1-3 minuten.
    11. Voeg 12 ml basaalcelmedia toe aan de buis en meng voorzichtig door te pipetteren of draai de buis 15 keer voorzichtig om te mengen.
    12. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 550 x g bij RT.
    13. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet vervolgens in 12 ml basaalcelmedia.
    14. Laat de zwaarste weefselfragmenten tot op de bodem bezinken. Verzamel het supernatant met een serologische pipet en breng over in een conische buis van 15 ml. Deze suspensie bevat epitheliale organoïden en stromale/immuuncellen.
  2. Menselijk borstweefsel
    1. Verwerk de menselijke borstweefselmonsters voor organoïden of bewaar ze binnen 24 uur na verzameling. Bewaar de monsters bij 4 °C in CO2-onafhankelijke media met 1% 100x antibioticum-antimycoticum.
    2. Breng het weefsel over in een weefselkweekplaat. Kantel de plaat en zuig de overtollige opslagmedia op en spoel het weefsel vervolgens af met 5 ml van de amfotericine B-was. Verwijder de amfotericine B-was onmiddellijk.
    3. Hak het weefselmonster fijn met een # 10 of # 11 scalpel om het weefsel los te maken totdat het een pasta-achtige consistentie bereikt. Breng het gehakte weefsel over in een conische buis met 10-30 ml collagenase-oplossing met behulp van een scalpel. Om ervoor te zorgen dat al het weefsel wordt verzameld, pipetteer 1 ml collagenase-oplossing op de weefselkweekplaat en keer terug naar de conische buis.
      OPMERKING: Om grotere organoïden te produceren, moet de mechanische spijsvertering worden geminimaliseerd, waardoor enkele kleine zichtbare stukjes weefsel intact blijven. De startweefselmassa voor dit protocol varieerde tussen 100-250 mg. Als alternatief kan weefsel bevroren worden opgeslagen voor latere organoïdepreparatie met minimaal verlies van levensvatbaarheid na stap 4.2.2 in 90% FBS + 10% DMSO zoals hierboven.
    4. Plaats de conische buis in een 37 °C benchtop schudincubator bij 180 RPM totdat het weefsel kleiner wordt en collagenase troebel wordt. Controleer het weefsel met tussenpozen van 5 minuten. Collagenase dissociatie van menselijke monsters duurt ongeveer 5-20 minuten.
    5. Draai na incubatie de conische buis gedurende 10 minuten bij 550 x g bij RT naar beneden.
    6. Zuig het supernatant voorzichtig uit de conische buis.
      OPMERKING: Ga vooruit, bedek alle pipetpunten, serologische pipetten en conische buizen met BSA-oplossing om verlies van organoïden als gevolg van hechting aan plastic te voorkomen.
    7. Voeg 4 ml basaalcelmedia en 40 μl DNase-oplossing [2 E/μL] toe aan de conische buis. Keer zachtjes om gedurende 3 minuten.
    8. Voeg 6 ml basaalcelmedia toe aan de buis en meng voorzichtig door te pipetteren of draai de conische buis 15 keer voorzichtig om te mengen.
    9. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 550 x g bij RT.
    10. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet vervolgens in 10 ml basaalcelmedia.
    11. Laat de zwaarste weefselfragmenten tot op de bodem bezinken. Verzamel het supernatant en breng het over in een conische buis van 15 ml. Deze suspensie bevat epitheliale organoïden en stromale/immuuncellen.

5. Differentiële centrifugatie

  1. Puls tot 550 x g gedurende 3-4 s bij RT, zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 10 ml basale celmedia. Herhaal deze stap nog drie keer (in totaal vier spins).
  2. Zorg er na elke centrifugatie voor dat de pellet steeds ondoorzichtiger wordt. Deze resterende pellet zal epitheliale organoïden zijn.

6. Kleine organoïden verzamelen

  1. Puls tot 80-100 x g gedurende 3 s bij RT. Verzamel het supernatant in een verse BSA-gecoate buis en pulseer vervolgens tot 550 x g gedurende 3 s bij RT om de kleine organoïden te pelleteren.

7. Inbedding van organoïden in BECM

  1. Aliquot geschikte suspensie van organoïden in microcentrifugebuizen volgens de organoïdendichtheid ten opzichte van de hoeveelheid BECM per put (tabel 1). Gebruik bijvoorbeeld 50-100 organoïden voor 20 μL BECM in één put van een plaat met 96 putten.
    OPMERKING: De organoïdendichtheid kan worden geteld met behulp van de volgende formule: ((Gemiddeld aantal organoïden)/50 μL) x verdunningsfactor.
  2. Voer alle stappen uit op ijs. Leg de ontdooide BECM op ijs in een weefselkweekkap. Plaats tijdens het voorbereiden van de kap alle pipetpunten op ijs om af te koelen.
  3. Centrifugeer de microcentrifugebuizen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij RT. Gooi het supernatant uit de buizen. Verplaats de buizen met organoïde pellets naar ijs en voeg het juiste volume BECM toe aan elke microcentrifugebuis (tabel 1).
    OPMERKING: Aangezien BECM stroperig is, voegt u extra volumes (ongeveer 10% -20% extra van het koepelvolume) van BECM toe om rekening te houden met het verlies in de pipetpunt.
  4. Pipet voorzichtig op en neer om de organoïden in BECM te resuspenderen en zorg ervoor dat er geen bubbels worden geproduceerd.
  5. Pipet de BECM-hangende organoïden langzaam en voorzichtig op het platingoppervlak. Breng tijdens het pipetteren langzaam de pipet omhoog om een koepel te creëren. Vul alle lege putten met PBS om de luchtvochtigheid te behouden.
  6. Plaats de plaat gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C om de BECM te laten stollen en dek vervolgens af met het juiste volume media (tabel 1).

8. Inbedding van organoïden in collageen

  1. Voer alle stappen uit op ijs. Bereid de collageenoplossing door in opeenvolgende volgorde 375 μL 10x DMEM, 100 μL 1 N natriumhydroxide (NaOH) en 3 ml rattenstaartcollageen I-oplossing te combineren in een conische buis van 15 ml. Pipetmix, waarbij je ervoor zorgt dat er geen bubbels worden gemaakt. Titreer de oplossing tot een pH van 7,2-7,4 met kleine hoeveelheden (stappen van 1-3 μL) NaOH of 10x DMEM indien nodig.
  2. Bedek de bodem van de putjes met de minimale hoeveelheid collageen die nodig is om de bodem van de put volledig te bedekken. Een benadering is om een kleine hoeveelheid collageen te plaatsen en de plaat van links naar rechts te wiegen om te coaten. Laat de collageenondervloeren gedurende 30 min-2 uur op 37 °C instellen.
  3. Aliquoteer de juiste suspensie van organoïden in microcentrifugebuizen volgens de organoïdendichtheid ten opzichte van de hoeveelheid collageen per put (tabel 1). Plaats in een incubator van 37 °C.
  4. Bewaar de collageenoplossing bij 4 °C en controleer de polymerisatie door elke 10 minuten onder een microscoop te controleren op vezelvorming. Collageen bereikt de juiste polymerisatie tussen 30 min-2 uur.
    OPMERKING: Een goede polymerisatie kan worden bepaald door de aanwezigheid van vezels die zich door de matrix vertakken. Ga onmiddellijk verder met stap 8.5 zodra een paar vezels in het gezichtsveld zijn waargenomen.
  5. Centrifugeer de microcentrifugebuizen op 300 x g gedurende 10 minuten bij RT. Gooi het supernatant uit de buizen. Verplaats de organoïde pellets naar ijs en voeg het juiste volume collageen toe aan elke microcentrifugebuis (tabel 1).
    OPMERKING: Aangezien collageen stroperig is, voegt u extra volumes toe (ongeveer 10% -20% extra van het koepelvolume) collageen om rekening te houden met het verlies in de pipetpunt.
  6. Pipet voorzichtig op en neer om organoïden in collageen te resuspenderen en zorg ervoor dat er geen bubbels worden geproduceerd.
  7. Pipetteer de collageen-gesuspendeerde organoïden langzaam en voorzichtig op het platingoppervlak. Breng tijdens het pipetteren langzaam de pipet omhoog om een koepel te creëren. Vul alle lege putten met PBS om de luchtvochtigheid te behouden.
  8. Plaats de plaat gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C om collageen te laten stollen en dek vervolgens af met het juiste volume media (tabel 1).
  9. OPMERKING: Organoïden behouden de levensvatbaarheid in 3D-matrix gedurende maximaal 7 dagen. Als beeldvorming wordt gebruikt voor analyse, gaat u verder met stap 9 en 10.

9. Bevestiging van ingebedde organoïden

  1. Gebruik een pipet om alle media uit de putten te verwijderen zonder contact te maken met ECM-koepels.
  2. Fixeren met 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS-oplossing gedurende 5 minuten.
  3. Was twee tot drie keer door PBS op putjes aan te brengen nadat je ze op een langzaam bewegende shaker hebt geplaatst. Breng na het wassen verse PBS aan op de koepels en bewaar de plaat bij 4 °C.

10. Immunofluorescente kleuring van ingebedde organoïden

  1. Oplossingen voorbereiden voor immunofluorescente kleuring
    1. Permeabilisatiebuffer: Bereid een PBS-oplossing voor met 10% Triton X-100.
    2. Blokkeringsbuffer: Bereid een PBS-oplossing voor met 10% FBS en 0,2% Triton X-100.
    3. Antilichaamverdunningsbuffer: Bereid een PBS-oplossing met 2% FBS en 0,2% Triton X-100.
  2. Permeabilisatie en blokkering
    1. Pipetteer voldoende permeabilisatiebuffer om de ECM-koepels te bedekken. Incubeer gedurende 1 uur bij RT op een langzaam bewegende shaker.
    2. Verwijder de permeabilisatiebuffer met een pipet en breng gedurende 3 uur hetzelfde volume blokkeerbuffer aan.
  3. Incubatie van primaire antilichamen
    1. Verwijder de blokkeringsbuffer met een pipet en breng de antilichaamverdunningsbuffer aan die het primaire antilichaam bevat in door de fabrikant gespecificeerde concentraties. Incubeer het monster bij 4 °C gedurende 12-16 uur op een langzaam bewegende schudder.
    2. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de monsters drie keer gedurende 10 minuten met PBS bij RT op een langzaam bewegende schudder.
  4. Secundaire antilichaamincubatie en nucleaire kleuring
    1. Zuig de resterende PBS-was op en breng de antilichaamverdunningsbuffer met secundaire antilichamen aan in door de fabrikant gespecificeerde concentraties. Voeg bovendien DAPI of Hoechst (om kernen te labelen) of falloidine (om actine te labelen) toe aan de buffer in een verhouding van 1:250. Incubeer gedurende 2-4 uur bij RT op een langzaam bewegende shaker.
    2. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en was monsters drie keer gedurende 10 minuten in PBS bij RT op een shaker. Bewaar de monsters in PBS bij 4 °C tot beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afbeeldingen in figuur 1 geven een voorbeeld van wild-type en tumoreuze borst epitheliale organoïden uit menselijke en muis weefsels. Een illustratie in één oogopslag van de methode voor het isoleren van epitheliale organoïden door middel van differentiële centrifugatie wordt gegeven in de cartoonworkflow in figuur 1A, waaruit blijkt dat primaire weefsels van verschillende soorten op bijna identieke manieren kunnen worden verwerkt terwijl epitheelweefsel word...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de literatuur zijn verschillende methoden beschreven om tumororganoïden te genereren. Dit protocol belicht een methode voor het genereren van tumororganoïden rechtstreeks uit de tumor zonder te passeren. Met behulp van deze methode zijn tumororganoïden binnen enkele uren na het starten van de procedure produceerbaar en genereren ze bijna 100% levensvatbare organoïden in vergelijking met 70% gerapporteerd in de literatuur31. Ter vergelijking: andere methoden vereisen seriële passaging van cellen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door financiering van METAvivor, de Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation en het NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. We erkennen de hulp van de University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, een gedeelde bron in het Simmons Comprehensive Cancer Center, die gedeeltelijk wordt ondersteund door het National Cancer Institute onder toekenningsnummer P30 CA142543. Speciale dank aan alle leden van het Chan Lab.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mM HEPES BufferGibco 15630080
100x Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-096
100x GlutamaxLife Technologies 35050-061Glutamine supplement
100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) Life Technologies 51500-056
100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)Sigma P4333
10x DMEMSigma D2429
50 mL/0.2 µm filter flaskFisher #564-0020
Amphotericin BLife Technologies 15290-018
bFGFSigmaF0291
BSA Solution (32%)Sigma #A9576
Cholera Toxin Sigma C8052
CO2-Independent Medium Gibco18045-088
Collagenase A Sigma C2139
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)SigmaD4263
DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD6546Common basal medium
D-MEM/F12 Life Technologies #10565-018Basal cell medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma#D8662PBS
Fetal bovine serum (FBS)Sigma #F0926
Gentamicin Life Technologies #15750-060
Human epidermal growth factor (EGF)Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0396
Insulin Sigma #I9278
Matrigel Corning #354230Basement Extracellular Matrix (BECM)
NaOH (1 N)Sigma S2770
Rat Tail Collagen ICorning 354236
RPMI-1640 mediaFisher SH3002701
Trypsin Life Technologies 27250-018

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  2. Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Frontiers in Oncology. 11, 645698(2021).
  3. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: New dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
  4. Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. The clinical relevance of cancer cell lines. Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).
  5. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging biological principles of metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  6. Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  7. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  8. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  9. Fujii, M., et al. A colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
  10. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  11. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  12. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  13. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  14. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nature Communications. 10 (1), 3991(2019).
  15. Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  16. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  17. Njoroge, R. N., et al. Organoids model distinct vitamin E effects at different stages of prostate cancer evolution. Scientific Reports. 7 (1), 16285(2017).
  18. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  19. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  20. Wrenn, E. D., et al. Regulation of collective metastasis by nanolumenal signaling. Cell. 183 (2), 395-410 (2020).
  21. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  23. Yao, Y., et al. Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
  24. Yao, J., et al. A pancreas tumor derived organoid study: from drug screen to precision medicine. Cancer Cell International. 21 (1), 398(2021).
  25. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  26. Chan, I. S., et al. Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. Journal of Cell Biology. 219 (9), 202001134(2020).
  27. Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid co-culture methods to capture cancer cell-natural killer cell interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
  28. Chan, I. S., Ewald, A. J. The changing role of natural killer cells in cancer metastasis. The Journal of Clinical Investigation. 132 (6), 143762(2022).
  29. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  30. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  31. LeSavage, B. L., Suhar, R. A., Broguiere, N., Lutolf, M. P., Heilshorn, S. C. Next-generation cancer organoids. Nature Materials. 21 (2), 143-159 (2022).
  32. Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
  33. Padmanaban, V., et al. Organotypic culture assays for murine and human primary and metastatic-site tumors. Nature Protocols. 15 (8), 2413-2442 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Differenti le centrifugatieOrgano de inbeddingCollageenmatrixImmunofluorescenti le kleuringTumormicro omgevingOrgano de invasie assayOrgano de cocultuurOrgano de imaging

Gerelateerde artikelen