Methodenartikel

Pre-RNA-splicing-analyse: van fundamenteel onderzoek tot toegepast onderzoek

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64630

⸱

12 september 2022

1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

In dit artikel

Samenvatting

BESPREKEN ARTIKELEN:

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementatie van splicingactiviteit door een galectin-3-u1 snrnp-complex op kralen. Journal of Visualized Experiments. (166), e61990 (2020).

Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. Een op een reporter gebaseerde cellulaire assay voor het monitoren van de splicingefficiëntie. Journal of Visualized Experiments. (175), e63014 (2021).

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 assays bepalen de substraatspecifieke gevoeligheden van spliceosomale mutanten in knoppende gist. Journal of Visualized Experiments. (184), e63232 (2022).

Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. Gebruik van grafix voor de detectie van tijdelijke interactoren van saccharomyces cerevisiae spliceosoom subcomplexen. Journal of Visualized Experiments. (165), e61994 (2020).

Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. Gebruik van de E1a minigene tool om mrna splicing veranderingen te bestuderen. Journal of Visualized Experiments. (170), e62181 (2021).

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. Een reporter assay om intron-microRNA rijping in zoogdiercellen te analyseren. Journal of Visualized Experiments. (184), e63498 (2022).

Redactioneel

Een van de belangrijkste drijfveren van celfenotypen in eukaryoten is genexpressie. De controle van genexpressie is essentieel en is afhankelijk van meerdere eiwitten en RNA's, van transcriptie tot translatieprocessen1. Veranderingen in deze stappen kunnen verschillende ziekten veroorzaken. RNA-verwerking en splicing vormen een belangrijke groep reacties die verantwoordelijk zijn voor het genereren van rijpe RNA-moleculen2,3,4,5. Splicing verwijdert introns en voegt exons samen om een rijpe RNA-molecuul te genereren die functionele en structurele activiteiten kan uitvoeren. De efficiëntie en snelheid van splicing hebben een grote invloed op de fenotypes die onder verschillende omstandigheden worden waargenomen6.

Splicing wordt uitgevoerd door een complexe macromoleculaire machinerie genaamd het spliceosoom, dat bestaat uit vijf snRNA's en meer dan 100 eiwitten5,7. Naast kerneiwitcomponenten hebben spliceosomen trans-werkende eiwitten, die mogelijk direct van invloed zijn op de regulatie van dit proces8,9. De belangrijkheid van splicing wordt weerspiegeld in het brede spectrum van ziekten veroorzaakt door veranderingen in dit proces, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, neuromusculaire ziekten en verschillende soorten kanker3,10,11. De studie van splicingdynamiek en spliceosoomassemblage kan een grote invloed hebben op het begrip van de biologie van deze aandoeningen.

De assemblage van het spliceosoom begint met de associatie van U1 snRNP met een specifiek gebied van de recent getranscribeerd pre-mRNA, de 5’ splice site5,8. De efficiënte paring en herkenning van 5’ splice sites door U1 snRNA definieert niet alleen de splice sites die moeten worden gebruikt, maar controleert ook welke pre-RNA's eerst of efficiënter worden gesplaist6,12,13. Het gebruik van verschillende splice sites kan meerdere alternatieve isoformen van rijpe RNA's genereren vanuit hetzelfde gen. Alternatief splicing is een belangrijke bron van proteomische diversiteit, waardoor de RNA's en eiwitten kunnen worden gegenereerd die nodig zijn tijdens de ontwikkeling of in verschillende cellen en weefsels14,15. Alternatieve RNA-transcripten kunnen verkortte of niet-functionele eiwit-isoformen genereren, die ziekten kunnen veroorzaken10,16. Daarom hebben de eiwitcomponenten van het U1 snRNP-complex een belangrijke regulerende rol in splicing1. Galectin-1 en Galectin-3 (Gal1 en Gal3) zijn componenten van U1 snRNP17,18. Voss et al.19 stellen een nucleaire extractfractiemethode voor om Gal3-U1 snRNP-verrijkte complexen te verkrijgen die in staat zijn om splicingactiviteit te redden in cellen die gedepleteerd zijn van U1. Deze analyse draagt bij aan het begrip van het mechanisme van Gal3-associatie met de spliceosomen, en vergelijkbare benaderingen kunnen worden gebruikt om andere potentiële splicing-regulerende eiwitten te onderzoeken.

De binding van U1 snRNP aan 5' splice sites is een belangrijke bemiddelaar van splicingtrouw20. Mutaties op de 5’ splice sites zijn kritisch en veroorzaken het verlies van U1 snRNP-paring, resulterend in splicingdefecten2. Cystische fibrose, bijvoorbeeld, wordt veroorzaakt door een gemuteerde 5' splice site in het CFTR-gen21. Wong et al.22 beschrijven een methode om 5' splice site-mutaties te compenseren met complementaire mutaties in U1 snRNA's. De aanpak bevordert met succes exon-inclusie, genereert rijpe RNA's en resulteert in redding van splicingdefecten. Naast het aanbieden van een mogelijke RNA-gebaseerde therapie voor deze ziekten, kan deze aanpak nuttig zijn voor de analyse van individuele regulatorische sequenties in pre-mRNA's23.

De trouw van U1 snRNA-associatie met splice sites wordt ook onderzocht in het gistmodelsysteem door van der Feltz24. De knopsproefkist Saccharomyces cerevisiae is veel gebruikt om splicingkinetica en spliceosoomsamenstelling te onderzoeken25. Splicingkinetica en spliceosoomsamenstelling zijn goed geconserveerd in eukaryoten, en gist is uitgebreid gebruikt om de vorming van intermediaire complexen tijdens de assemblage te monitoren26. De ACT1-CUP1-reporterassay is gebaseerd op de expressie van een paar genen: ACT1, die een intron bevat met optimale splice site-sequenties, en CUP1, dat een koperchelator tot expressie brengt, die de cel beschermt tegen de schade veroorzaakt door dit metaalioon. CUP1 wordt alleen tot expressie gebracht als ACT1 correct is gesplaist, waardoor het reportersysteem wordt gecreëerd27. Celgroei onder omstandigheden met verschillende koperconcentraties kan worden gemonitord om de splicingefficiëntie van verschillende intronsequenties of het gebruik van verschillende regulatorische eiwitten aan te pakken. van der Feltz24 presenteert een methode om de effecten van een splicing-regulerend eiwit te analyseren met behulp van dit reportersysteem en

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteur erkent Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) subsidienummer 2019/21874-5, en Universidade de São Paulo voor voortdurende onderzoekssteun.

Referenties

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Lührmann, R. The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Reviews Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends in Molecular Medicine. 18 (8), 472-482 (2012).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 291(2020).
  6. Fu, X. D., Ares, M. Context-dependent control of alternative splicing by RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 689-701 (2014).
  7. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  8. Will, C. L., Lührmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003703(2011).
  9. Jurica, M. S., Moore, M. J. Pre-mRNA splicing: Awash in a sea of proteins. Molecular Cell. 12 (1), 5-14 (2003).
  10. Coltri, P. P., dos Santos, M. G. P., da Silva, G. H. G. Splicing and cancer: Challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (3), 1527(2019).
  11. Havens, M. A., Duelli, D. M., Hastings, M. L. Targeting RNA splicing for disease therapy. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (3), 247-266 (2013).
  12. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  13. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  14. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: A pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  15. Lee, Y., Rio, D. C. Mechanisms and regulation of alternative pre-mRNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 84, 291(2015).
  16. Dvinge, H., Kim, E., Abdel-Wahab, O., Bradley, R. K. RNA splicing factors as oncoproteins and tumour suppressors. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 413-430 (2016).
  17. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17 (8), 4730-4737 (1997).
  18. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (4), 1213-1217 (1995).
  19. Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of splicing activity by a galectin-3-u1 snrnp complex on beads. Journal of Visualized Experiments. (166), e61990(2020).
  20. Shao, W., Kim, H. -S., Cao, Y., Xu, Y. -Z., Query, C. C. A U1-U2 snRNP interaction network during intron definition. Molecular and Cellular Biology. 32 (2), 470-478 (2012).
  21. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), 2114886119(2022).
  22. Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency. Journal of Visualized Experiments. (175), e63014(2021).
  23. Hamid, F. M., Makeyev, E. v A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  24. vander Feltz, C. ACT1-CUP1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (184), e63232(2022).
  25. Plaschka, C., Newman, A. J., Nagai, K. Structural basis of nuclear pre-mRNA splicing: Lessons from Yeast. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032391(2019).
  26. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: methods, mechanisms, and machinery. Methods in Enzymology. 351, 200-220 (2002).
  27. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  28. Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. Utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes. Journal of Visualized Experiments. (165), e61994(2020).
  29. Effenberger, K. A., Urabe, V. K., Jurica, M. S. Modulating splicing with small molecular inhibitors of the spliceosome. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 8 (2), 1381(2017).
  30. Corrionero, A., Miñana, B., Valcárcel, J. Reduced fidelity of branch point recognition and alternative splicing induced by the anti-tumor drug spliceostatin A. Genes and Development. 25 (5), 445-459 (2011).
  31. Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. Using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes. Journal of Visualized Experiments. (170), e62181(2021).
  32. Volinia, S., et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2257-2261 (2006).
  33. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  34. Bartel, D. P. Metazoan microRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
  35. Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A reporter assay to analyze intronic microRNA maturation in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (184), e63498(2022).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Splicing ActivityGalectin-3U1 SnRNP ComplexSplicing EfficiencySpliceosomal MutantsBudding YeastTransient InteractorsSaccharomyces CerevisiaeE1a Minigene ToolIntronic MicroRNA Maturation
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.