Method Article

Methoden en protocollen voor live beeldvorming bij ontwikkeling

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BESPREKEN ARTIKELEN:

Januschke, J., Loyer, N. Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrine-stolsels voor live beeldvorming. Journal of Visualized Experiments. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. Een explantaatsysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering. Journal of Visualized Experiments. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op monsters gebaseerde lichtbladfluorescentiemicroscopen. Journal of Visualized Experiments. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live celbeeldvorming tijdens neuronale ontwikkeling. Journal of Visualized Experiments. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free beeldvorming van lipidopslagdynamiek in Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie. Journal of Visualized Experiments. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Diepe en ruimtelijk gecontroleerde volume-ablatieën met behulp van een twee-foton microscoop in de zebravis-gastrulae. Journal of Visualized Experiments. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontwikkeling wordt gekenmerkt door de dynamische verandering van structuren op het niveau van organellen, cellen en organen. Het vermogen van time-lapse beeldvorming om vierdimensionale informatie te verzamelen van dezelfde structuur in zijn fysiologische toestand, maakt het een ideale techniek om het dynamische proces van ontwikkeling te bestuderen1,2,3,4,5,6. De enorme hoeveelheid gegevens die door live-beeldvorming wordt verzameld, maakt ook kwantitatieve analyse van ontwikkeling mogelijk. Hoewel time-lapse beeldvorming meer werd gebruikt voor éénlagige celcultuur, is beeldvorming van driedimensionale levende weefsels of dieren veel uitdagender vanwege technische moeilijkheden, zoals lichtverstrooiing van levend weefsel, het ontwikkelen van een geschikte montagestrategie en labelmethode, het handhaven van normale fysiologische omstandigheden tijdens een uitgebreide beeldvormingsperiode, toegang tot een geschikte microscoop, enz. Deze uitdagingen beperken het gebruik van live-beeldvorming in veel laboratoria. In deze methodencollectie rapporteerden zeven artikelen nieuwe methoden voor het bereiden van levende monsters, labelen en laser-gebaseerde manipulatie. Al deze methoden vergemakkelijken de live-beeldvorming van ontwikkelingsprocessen vanuit verschillende invalshoeken.

Direct beeldvorming van diepe regio's is technisch uitdagend vanwege de sterke verstrooiing van levend weefsel. Deze verstrooiing kan worden geminimaliseerd door de interne organen bloot te stellen door middel van dissectie, waarmee de ruimtelijke resolutie van beelden wordt verbeterd. In deze collectie beschreven Januschke en Loyer7 een protocol voor het dissekteren van Drosophila larvale hersenen en een montagemethode met behulp van fibrine-klonten. Deze montagestrategie maakte time-lapse beeldvorming mogelijk met behulp van omgekeerde microscopen van meerdere monsters op hetzelfde schaaltje, omdat het alleen de toevoeging van fibrinogeen en trombine vereiste. Li en Luo8 presenteerden een protocol voor de dissectie van een antenne-hersen-explantaat uit vliegpoppen en een ex vivo kweekconditie die de normale ontwikkeling van het olfactorische circuit gedurende 24 uur handhaafde. Hun systeem maakte het mogelijk om axonaal en dendritisch targeting te visualiseren in de assemblage van een vliegolfactorisch circuit vanuit zijn fysiologische toestand. Dit explantaatsysteem is geschikt voor tweefoton-microscopen en roosterlichtblad-microscopen met adaptief optica-gebaseerde beeldvorming, waardoor zowel langdurige continue beeldvorming als snelle beeldvorming met hoge ruimtelijk-temporele resolutie mogelijk is in een korte tijdsperiode. Schramm et al.9 ontwikkelden een minimaal invasieve chirurgische procedure om de huid en zachte schedelkraakbeen van zebravissen te verwijderen door middel van micro-peeling. Dit stelde hen in staat om enkele belangrijke gebeurtenissen in latere ontwikkelingsstadia waar te nemen, inclusief neuronale differentiatie, maturatie, plasticiteit en Ca2+ transient tot 30 dagen na bevruchting. Het stelde hen ook in staat om live-beeldvorming uit te voeren na pigmentatie van de larvale huid van de zebravis. Naast dissectie is geschikte montage van monsters ook cruciaal voor live-beeldvorming. Ratke et al.10 presenteerden een experimenteel raamwerk voor gelijktijdige live-beeldvorming van meerdere vliegembryo's met behulp van lichtbladmicroscopie. Dit protocol verhoogde de algehele doorvoer en is ideaal voor vergelijkend onderzoek.

Naast monstervoorbereiding, vergemakkelijken nieuwe labelmethoden het visualiseren van specifieke structuren in levend weefsel. Terzi et al.11 rapporteerden een genetisch gecodeerde H2O2-specifieke biosensor, roGFP2-Orp1, voor het beeldvormen van intracellulaire H2O2 niveaus uit gekweekte zebravis neuronen en hele larven tijdens ontwikkeling. Een belangrijk voordeel van deze genetisch gecodeerde H2O2 biosensor was de verbetering van de temporele en ruimtelijke resolutie van H2O2 detectie. Een andere studie van Mutlu et al.12 beschreef gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie, een labelvrije chemische beeldvormingsmethode voor snelle en kwantitatieve detectie van lipiden in levende cellen met subcellulaire resolutie. Zowel H2O2 als lipiden gaan gemakkelijk verloren tijdens monsterfixatie. De ontwikkeling van label- of beeldvormingsmethoden in levend weefsel overwon niet alleen deze uitdaging, maar behield ook ruimtelijke en temporele informatie van deze structuren in biologische processen.

Ten slotte kan licht ook worden gebruikt voor celablatie. Boutillon et al.13 toonden een methode om diepe en ruimtelijk goed gedefinieerde volumes in zebravissen af te blazen met behulp van een tweefoton-microscoop. Vergeleken met ultraviolet laser-gebaseerde celablaties, verbeterde de tweefotonlaser de axiale resolutie en weefselpenetratie. Dit protocol leverde een verstoringsstrategie om cel-cel interactie tijdens ontwikkeling te bestuderen.

De vooruitgang van microscopische technologieën stelde ons in staat om veel ontwikkelingsprocessen in vier dimensies te begrijpen. Protocollen in deze collectie zullen meer wetenschappers helpen om de technische barrière van live-beeldvorming in verschillende biologische systemen te overwinnen. We verwachten dat er in de toekomst

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur heeft niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze JoVE-methodecollectie-uitgave werd gefinancierd door NIH 1K99DC01883001. Ik dank mijn postdoc-mentor Liqun Luo, mijn medewerkers Eric Betzig en Tian-Ming Fu voor de sterke steun bij het ontwikkelen van mijn interesse in time-lapse imaging tijdens mijn postdoc-project. Ik dank ook de School of Brain Science and Brain Medicine van de Zhejiang University voor het werven en ondersteunen van mij om het time-lapse imaging-onderzoek in mijn eigen lab voort te zetten.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
  3. Ezin, M., Fraser, S. Time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  4. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Current Opinion in Cell Biology. 17 (6), 676-681 (2005).
  5. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  6. Christen, P., Muller, R. In vivo visualisation and quantification of bone resorption and bone formation from time-lapse imaging. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 311-317 (2017).
  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Live ImagingDrosophilaImmobilizationTime lapse ImagingOlfactory Circuit AssemblyIn Vivo ImagingBrain TissueZebrafish LarvaeLight Sheet Fluorescence MicroscopyNeuronal DevelopmentROS ImagingLipid Storage DynamicsCaenorhabditis ElegansStimulated Raman Scattering MicroscopyTwo photon MicroscopeVolume Ablations

Related Articles