Het gebruik van C. elegans om proteostase-onevenwichtigheden te bewaken

Cindy Voisine; Carmen Nussbaum-Krammer

doi:10.3791/64643

Methodenartikel

Het gebruik van C. elegans om proteostase-onevenwichtigheden te bewaken

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64643

⸱

24 augustus 2022

Cindy Voisine¹ , Carmen Nussbaum-Krammer²

¹Department of Biology, Northeastern Illinois University, ²Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

In dit artikel

Samenvatting

Het proteostase-netwerk is een cellulair eiwitkwaliteitscontrolesysteem dat de functionaliteit van het proteoom garandeert en de gezondheid van cellen en organismen bevordert. Met de leeftijd neemt de betrouwbaarheid ervan af, wat leidt tot een verhoogde kwetsbaarheid van het proteoom voor stress en uiteindelijk tot ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen en kanker. Om onderzoek naar dit evolutionair geconserveerde netwerk te benadrukken, presenteert het Journal of Visualized Experiments (JoVE) een verzameling methoden van onderzoekers die C. elegans gebruiken om proteostase-onevenwichtigheden te monitoren. Deze redactie geeft een kort overzicht van deze verschillende experimentele benaderingen om het proteostase-netwerk op cellulair, weefsel- en organismeniveau te begrijpen.

BESPREKTE ARTIKELEN:

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Gestandaardiseerde methoden voor het meten van inductie van de heat shock-respons in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), doi:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. et al. High-throughput kwantitatieve RT-PCR in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluidische technologie. Journal of Visualized Experiments. (159), doi:10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. et al. Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), doi:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align en Worm_CP, twee open-source pipelines voor het rechttrekken en kwantificeren van fluorescentiebeeldgegevens verkregen van Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), doi:10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Kwantificering van weefselspecifiek proteostatisch verval in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (175), doi:10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Gebruik van Caenorhabditis elegans om te screenen op weefselspecifieke chaperon-interacties. Journal of Visualized Experiments. (160), doi:10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Weefselspecifieke RNAi-tools om componenten voor systemische stresssignalering te identificeren. Journal of Visualized Experiments. (159), doi:10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo kwantificering van eiwitverloop bij verouderende C. elegans met behulp van fotoomkeerbare dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), doi:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Karakterisering van amyloïde structuren bij verouderende C. elegans met behulp van fluorescentielevensduurbeeldvorming. Journal of Visualized Experiments. (157), doi:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Meten van RAN-peptidetoxiciteit in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), doi:10.3791/61024 (2020).

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Kwantitatieve benaderingen voor het scoren van in vivo neuronale aggregaat- en orgaantje-extrusie in grote exofeervesikels in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), doi:10.3791/61368 (2020).

Redactioneel

Eiwitstofwisseling, of proteostase, is fundamenteel voor de gezondheid van cellen en organismen¹^,². Bewaarde cellulaire processen werken samen om een goed gevouwen proteoom te onderhouden door invloed uit te oefenen op eiwitsynthese, -vouwing en -verwijdering³^,⁴. Verstoringen in proteostase zijn in verband gebracht met leeftijdsgerelateerde neurodegeneratieve ziekten en kankers⁵^,⁶. Op basis van het hoge niveau van conservatie zijn modelorganismen zoals de nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) instrumenteel geweest in het begrijpen van de rol van proteostase in de gezondheid en ziekte van de mens⁷^,⁸. C. elegans bezit veel kenmerken die het een ideaal experimenteel model maken, waaronder zijn korte levenscyclus, transparante cuticula en gemak van chemische en genetische manipulaties⁹. Deze verzameling methoden biedt gedetailleerde protocollen om proteostase-onevenwichtigheden op moleculair, cellulair en organismaal niveau in C. elegans te monitoren.

Cellen reageren op verstoringen in proteostase door een verscheidenheid aan stressresponsen te activeren, inclusief de hitteschokrespons (HSR), de ongevouwen eiwitrespons (UPR) en de oxidatieve stressrespons (OxSR) om het cellulaire proteoom opnieuw aan te passen¹⁰. Om de reproduceerbaarheid in het veld te verbeteren, worden gestandaardiseerde praktijken voor de robuuste inductie van HSR beschreven door Golden en collega's¹¹. RT-qPCR is een veel gebruikte, gevoelige methode om genexpressie te analyseren door mRNA te kwantificeren, en deze test kan worden gebruikt om de cellulaire mRNA-niveaus van verschillende hitteschok-inducibele genen te meten¹¹. Om deze benadering uit te breiden naar grootschalige, hoogdoorvoeranalyse, beschrijven Chau et al.¹² een nieuwe aanpassing voor cDNA-voorbereiding, gekoppeld aan een nanofluïdische RT-qPCR-platform dat robuust en zeer gevoelig is. Nauwkeurige metingen van genexpressie kunnen worden uitgevoerd op enkele wormen of bulk-samples¹². Aanbevolen stressrespons-gendoelen samen met de primerparen voor het meten van de transcriptionele opregulatie van stressresponsgenen worden vermeld in de bijbehorende protocollen¹²^,¹³.

Een beperking van het gebruik van RT-qPCR om de activering van stressresponsen te beoordelen is dat het duur, technisch moeilijk kan zijn en het gebruik van gespecialiseerde apparatuur vereist. Daarom worden padweg-specifieke transcriptionele reporterstammen die een fluorescent eiwit tot expressie brengen onder een stress-induceerbare promotor (bijv. hsp-16.2p::gfp voor het monitoren van HSR) vaak gebruikt om cellulaire stressresponsen te beoordelen¹¹. Met behulp van een eenvoudige open source Fiji-gebaseerde workflow genaamd Worm-align gekoppeld aan de CellProfiler-pijplijn Worm_CP, schetsen Okkenhaug en collega's¹⁴ stappen om snel fluorescentie van individuele wormen te kwantificeren. Bovendien beschrijven Bar-Ziv et al.¹³ een hoogdoorvoermethode met behulp van een flowcytometer met grote deeltjes die het vastleggen van fluorescentie-intensiteit, grootte en ruimtelijke (2D) verdeling voor duizenden dieren mogelijk maakt. Informatie over transcriptionele reporters voor het evalueren van de activering van cellulaire stressresponsen samen met de aanbevolen instellingen voor fluorescentiemicroscopie en kwantificering met behulp van een worm biosorter worden gegeven¹³. Belangrijk is dat deze reporters gekoppeld kunnen worden aan specifieke fysiologische stress-overlevingsassays die de gezondheid van een dier volgen na een specifiek stressregime¹¹^,¹³. Hoewel fluorescente reporters het voordeel hebben dat ze weefselspecifieke verschillen onthullen, kunnen ze alleen inductie boven een bepaalde drempel detecteren en de stabiliteit van bepaalde fluoroforen, zoals GFP, sluit de detectie van dynamische variaties in genexpressie uit. Bovendien zijn de meeste fysiologische assays tijdrovend en hebben dus een beperkte schaalbaarheid. Ondanks deze beperkingen, laten deze methoden een uitgebreide karakterisering toe van de cellulaire en fysiologische effecten van interne en externe stressoren.

Chronische proteotoxische verstoringen worden geassocieerd met het instorten van het proteostasenetwerk (PN), de kwaliteitscontrolemachinerie die verantwoordelijk is voor het onderhouden van een functioneel proteoom⁵^,⁶. Progressieve achteruitgang in proteostase is betrokken bij veel leeftijdsgerelateerde ziekten. C. elegans is een geweldig modelsysteem om de kwetsbaarheid van specifieke weefsels voor proteostase-uitval te onderzoeken. Lazaro-Pena et al.¹⁵ beschrijven een benadering om spierspier of neuronale functionaliteit te monitoren terwijl de worm veroudert. Deze benadering kan worden aangepast voor hogerdoorvoer genetische analyse of geneesmiddelenscreening¹⁵. De grootste uitdaging is om te begrijpen hoe de interacties werken tussen de verschillende componenten van de PN in vivo. Om dit tekort te verhelpen, hebben Dror en collega's¹⁶ een systeem ontwikkeld om specifieke informatie te verzamelen over de interacties van moleculaire chaperones, belangrijke componenten van de PN, in specifieke weefsels tijdens de loop van ontwikkeling en veroudering. Door weefselspecifieke verstoringen van vouwelijkevenwicht te koppelen met beschikbare mutanten of transgene stammen die weefselspecifieke silencing van doelgenen door RNAi mogelijk maken, kan het chaperonenetwerk in een bepaald weefsel worden onderzocht. Het aanvullen van deze strategie met eenvoudige gedragsassays die de functionaliteit van specifieke

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken onze collega's voor hun zeer waardevolle bijdragen aan deze verzameling methoden.

Referenties

Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475 (7356), 324-332 (2011).
Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (11), 777-788 (2010).
Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), 004440(2011).
Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Model Mechanism. 13 (10), (2020).
Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
Girard, L. R., et al. WormBook: the online review of Caenorhabditis elegans biology. Nucleic Acids Research. 35, 472-475 (2007).
Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cellular stress response pathways and ageing: intricate molecular relationships. The EMBO Journal. 30 (13), 2520-2531 (2011).
Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), e61030(2020).
Chauve, L. High-throughput quantitative RT-PCR in single and bulk C. elegans samples using nanofluidic technology. Journal of Visualized Experiments. (159), e61132(2020).
Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61001(2020).
Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61136(2020).
Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (175), e61100(2021).
Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions. Journal of Visualized Experiments. (160), e61140(2020).
Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Tissue-specific RNAi tools to identify components for systemic stress signaling. Journal of Visualized Experiments. (159), e61357(2020).
Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods Enzymology. 412, 256-282 (2006).
Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of amyloid structures in aging C. elegans using fluorescence lifetime imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), e61004(2020).
Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Proteostasis Network Protein Quality Control Neurodegenerative Disorders Cellular Health Heat Shock Response Physiological Stress Responses Tissue-specific Proteostasis RNAi Tools Protein Turnover Photoconvertible Dendra2 Experimental Approaches