We presenteren een protocol voor een gemodificeerde sandwich enzym-gebonden immunosorbent assay techniek om kwantitatief twee componenten van neutrofiele extracellulaire val restanten, myeloperoxidase geconjugeerd-DNA en neutrofiele elastase geconjugeerd-DNA complexen, afgeleid van geactiveerde neutrofielen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bepaalde stimuli, zoals micro-organismen, zorgen ervoor dat neutrofielen neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) vrijgeven, die in feite webachtige structuren zijn die zijn samengesteld uit DNA met korreleiwitten, zoals myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE), en cytoplasmatische en cytoskeletale eiwitten. Hoewel de belangstelling voor NET's de laatste tijd is toegenomen, is er geen gevoelige, betrouwbare testmethode beschikbaar voor het meten van NET's in klinische omgevingen. Dit artikel beschrijft een gemodificeerde sandwichenzym-gebonden immunosorbenttest om twee componenten van circulerende NET's, MPO-DNA en NE-DNA-complexen, kwantitatief te meten, die specifieke componenten van NET's zijn en in de extracellulaire ruimte worden vrijgegeven als afbraakproducten van NET's. De test gebruikt specifieke monoklonale antilichamen voor MPO of NE als de vangstantistoffen en een DNA-specifiek detectieantilichaam. MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA of NE-DNA-complexen bevatten. Deze assay toont een goede lineariteit en een hoge inter-assay en intra-assay precisie. We gebruikten het bij 16 patiënten met COVID-19 met bijbehorend acuut respiratoir distress-syndroom en vonden dat de plasmaconcentraties van MPO-DNA en NE-DNA significant hoger waren dan in het plasma verkregen uit gezonde controles. Deze detectietest is een betrouwbare, zeer gevoelige en nuttige methode voor het onderzoeken van de kenmerken van NET's in menselijk plasma en kweeksupernatanten.
Inleiding
Dit artikel schetst een methode om de vorming van neutrofiele extracellulaire val (NET) in biologische vloeistoffen te kwantificeren met behulp van sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) om complexen van myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE) te detecteren met DNA 1,2. NET's bestaan uit een DNA-ruggengraat versierd met antimicrobiële proteasen afkomstig van neutrofiele korrels 3,4. Zowel MPO-DNA- als NE-DNA-complexen zijn belangrijke en specifieke componenten van NET's en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte als afbra....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingsraden van de Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Van elke deelnemer werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.
1. Reagensbereiding
OPMERKING: Om de sandwich ELISA-test uit te voeren, worden de reagentia bereid zoals hieronder beschreven.
- Coating buffer:
- Om een 0,1 mol/l carbonaat-bicarbonaatbuffer te maken, weegt u 10,6 g watervrij natriumcarbonaat (molecuulgewicht, 106 g/mol) en 8,4 g natriumbicarbonaat (molecuulgewicht, 8....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze methode gebruikte een sandwich ELISA met anti-MPO, anti-NE en anti-DNA monoklonale antilichamen om MPO-geassocieerd en NE-geassocieerd DNA te meten (figuur 1). Bij deze methode werden de putjes van een microtiterplaat gecoat met een MPO-specifiek of NE-specifiek monoklonaal antilichaam om DNA-geassocieerd MPO en DNA-geassocieerd NE te vangen, evenals niet-DNA-geassocieerde MPO en NE. Om de intra-assay coëfficiënt van variabiliteit (CV) te berekenen, werden dubbele metingen uitgevoerd bi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben een sandwich ELISA-methode beschreven waarbij MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA- of NE-DNA-complexen bevatten. Na het wassen wordt de "sandwich" voltooid door de monsters te incuberen met een peroxidase-geassocieerd anti-DNA monoklonaal antilichaam. Na de verwijdering van ongebonden secundair antilichaam wordt het gebonden peroxidaseconjugaat gedetecteerd door de toevoeging van een chromogeen ABTS-peroxidasesubstraat, dat een oplosbaar ei.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel. De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Dr. Huq Muhammad Aminul voor het verlenen van hulp bij het beoordelen van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation van PMN's uit menselijk bloed. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | platte bodem |
| ABTS buffer oplossing | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Bevat natriumperboraat, citroenzuur en dinatriumwaterstoffosfaat. |
| ABTS tabletten | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Elke tablet bevat 5 mg ABTS substraat en 60 mg voermiddelen. |
| Zelfklevende plastic afdekking, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antilichaam | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Bewaar bij 2-8 °C. stabiel gedurende 1 jaar. Gastheersoort is konijn. |
| Anti-NE antilichaam, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Bewaar bij 2-8 °C. stabiel gedurende 1 jaar. Gastheersoort is muis. |
| Rundserum albumine | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumine uit bovine fractie V. Bewaar bij 2–8 °C. stabiel gedurende 2 jaar. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Bewaar bij -20 °C |
| IgG, konijn, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Bewaar als geconcentreerde oplossing bij 2–8 °C. |
| IgG1, muis Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Bewaar als geconcentreerde oplossing bij 2–8 °C. |
| Lithium heparine bloedafnamebuisje | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Elke microplate plate reader die golflengten van 405–490 nm kan lezen kan gebruiken. |
| Microplate reader toepassing | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-geconjugeerd anti-DNA antilichaam, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | fles 2. Bewaar bij 2–8 °C. stabiel gedurende 1 jaar. |
| Phorbol 12-myristaat 13-acetaat | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activering van PMN's uit menselijk bloed. |
| Fosfaat gebufferde oplossing | Takara Bio | T9181 | Bewaar bij kamertemperatuur. Stabiel gedurende 6 maanden. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Natriumaziet | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Bewaar bij kamertemperatuur. |
| t-Octylfenoxypolyethoxyethanol, Polyethyleenglycol tert-octylfenylether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Bewaar bij kamertemperatuur. |
Referenties
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
