Klinisch microfluïdisch chipplatform voor de isolatie van veelzijdige circulerende tumorcellen

Summary

De klinische microfluïdische chip is een belangrijke biomedische analysetechniek die de voorbewerking van bloedmonsters van klinische patiënten vereenvoudigt en immunofluorescentiekleurig circulerende tumorcellen (CTC's) in situ op de chip kleurt, waardoor een snelle detectie en identificatie van een enkele CTC mogelijk is.

Abstract

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang bij het bepalen van de ziekte van de patiënt, omdat CTC's zeldzaam en heterogeen zijn. CTC's worden losgemaakt van de primaire tumor, komen in het bloedcirculatiesysteem en groeien mogelijk op verre plaatsen, waardoor de tumor wordt uitgezaaid. Aangezien CTC's vergelijkbare informatie bevatten als de primaire tumor, kunnen CTC-isolatie en daaropvolgende karakterisering van cruciaal belang zijn bij het monitoren en diagnosticeren van kanker. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC's zijn krachtige methoden voor CTC-isolatie omdat ze de noodzakelijke elementen met een hoge gevoeligheid bieden. Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsiemethode die vrij is van pijn voor de patiënten. In dit werk presenteren we een lijst met protocollen voor klinische microfluïdische chips, een veelzijdig CTC-isolatieplatform, dat een reeks functionaliteiten en diensten bevat die nodig zijn voor CTC-scheiding, analyse en vroege diagnose, waardoor biomoleculaire analyse en kankerbehandeling worden vergemakkelijkt. Het programma omvat het tellen van zeldzame tumorcellen, klinische bloedvoorbewerking van patiënten, waaronder rode bloedcellyse, en de isolatie en herkenning van CTC's in situ op microfluïdische chips. Het programma maakt de precieze inventarisatie van tumorcellen of CTC's mogelijk. Daarnaast bevat het programma een tool die CTC-isolatie bevat met veelzijdige microfluïdische chips en immunofluorescentie-identificatie in situ op de chips, gevolgd door biomoleculaire analyse.

Introduction

Circulerende tumorcellen (CTC's) zijn belangrijk in de prognose, diagnose en antikankertherapie. CTC-inventarisatie is van vitaal belang omdat CTC's zeldzaam en heterogeen zijn. De opsomming, affiniteitsmodificatie en klinische immunofluorescentiekleuring van zeldzame CTC's zijn krachtige technieken voor CTC-isolatie omdat ze de nodige elementen met een hoge gevoeligheid bieden¹. Zeldzaam aantal tumorcellen gemengd met normaal bloed bootst echt patiëntenbloed nauw na, omdat 2-3 ml echt patiëntenbloed slechts 1-10 CTC's bevat. Om een kritisch experimenteel probleem op te lossen, in plaats van een groot aantal tumorcellen te gebruiken die in PBS zijn geïntroduceerd of gemengd met normaal bloed, biedt het gebruik van een zeldzaam aantal tumorcellen ons een laag aantal bloedcellen, wat dichter bij de realiteit ligt bij het uitvoeren van een experiment.

Kanker is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld². CTC's zijn tumorcellen die worden afgestoten van de oorspronkelijke tumor en die circuleren in het bloed en lymfecirculatiesystemen³. Wanneer CTC's naar een nieuwe overlevingsomgeving verhuizen, groeien ze als een tweede tumor. Dit wordt metastase genoemd en is verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen bij kankerpatiënten⁴. CTC's zijn van vitaal belang voor de prognose, vroege diagnose en voor het begrijpen van de mechanismen van kanker. CTC's zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed van de patiënt ^5,6.

Microfluïdische chips bieden een vloeibare biopsie die de tumor niet binnendringt. Ze hebben het voordeel dat ze draagbaar zijn, goedkoop zijn en een op cellen afgestemde schaal hebben. De isolatie van CTC's met microfluïdische chips wordt voornamelijk ingedeeld in twee soorten: affiniteitsgebaseerd, dat afhankelijk is van antigeen-antilichaambinding ^7,8,9 en de oorspronkelijke en meest gebruikte methode van CTC-isolatie is; en fysieke chips, die gebruik maken van grootte- en vervormbaarheidsverschillen tussen tumorcellen en bloedcellen 10,11,12,13,14,15^, zijn labelvrij en eenvoudig te bedienen. Het voordeel van microfluïdische chips ten opzichte van alternatieve technieken is dat de fysische benadering van big-ellips microfilters CTC's stevig vangt met een hoge opname-efficiëntie. De reden hiervoor is dat ellipsmicroposten zijn georganiseerd in slanke tunnels van lijnspleten. De lijnspleten verschillen van de traditionele puntpuntspleten gevormd door microposten zoals ruitmicroposten. Wave-chip-gebaseerde opname van CTC's combineert zowel fysieke eigenschapsgebaseerde als affiniteitsgebaseerde isolatie. Golfchip-gebaseerde opname omvat 30 golfvormige arrays met het antilichaam van anti-EpCAM gecoat op cirkelvormige microposts. De CTC's worden opgevangen door de kleine openingen en de grote openingen worden gebruikt om het debiet te versnellen. De gemiste CTC's moeten de kleine openingen in de volgende array passeren en worden opgevangen door de op affiniteit gebaseerde isolatie die in de chip¹⁶ is geïntegreerd.

Het doel van het protocol is om het tellen van zeldzame aantallen tumorcellen en de klinische analyse van CTC's met microfluïdische chips aan te tonen. Het protocol beschrijft de CTC-isolatiestappen, hoe een laag aantal tumorcellen te verkrijgen, de klinische fysieke scheiding van kleine ellipsfilters, grote-ellipsfilters en trapeziumfilters, affiniteitsmodificatie en verrijking¹⁷.

Protocol

Bloedmonsters van patiënten werden geleverd door Longhua Hospital Affiliated to Shanghai Medical University.The protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het Peking University Third Hospital. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten voor het gebruik van de monsters voor onderzoeksdoeleinden.

1. Pre-experiment om de vangstefficiëntie met gekweekte tumorcellen te controleren

1. Kweek de tumorcellen MCF-7, MDA-MB-231 en HeLa voor het bepalen van de vangstefficiëntie. Verdun de tumorcelsuspensie, tel het aantal tumorcellen en herhaal dit totdat het gewenste aantal cellen in 1 ml PBS is verkregen.
   1. Kweek de cellen in een celkweekkolf met een startcelnummer van ~ 1 x 10⁵ cellen in 1 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer in een bevochtigde atmosfeer bij 37 °C met een 5% CO 2-atmosfeer.
   2. Wanneer de cellijnen groeien als hechtende monolagen tot 95% samenvloeiing, maak ze dan los van de kweekschalen met 0,25% trypsine-oplossing gedurende 2 minuten zoals beschreven in Chen et ^al.16.
   3. Kleuring de tumorcellen met calceïne AM. Doe 3 μL calceïne AM in de kweekschaal en bewaar de schaal 30 minuten in de couveuse. Verwerk vervolgens alle cellen met trypsine.
   4. Tel de gekweekte tumorcellen in PBS met een celtelkamer en verdun tot 100 tumorcellen per 1 ml PBS zijn verkregen.
      OPMERKING: Om het celnummer nauwkeurig op te sommen, neemt u 50 μL van de verkregen celsuspensie om te zien of het aantal tumorcellen daarin vijf is of niet met een microscoop. Bepaal het volume van de celsuspensie dat moet worden genomen om 100 tumorcellen te verkrijgen op basis van het werkelijke aantal tumorcellen in 50 μL celsuspensie.
2. Breng de celsuspensie met 100 tumorcellen per 1 ml PBS in de microfluïdische chip met behulp van een spuit met een spuitpomp met verschillende stroomsnelheden van 0,5 ml / h, 1 ml / h, 2 ml / h, 3 ml / h, 4 ml / h en 5 ml / h. Verkrijg de opvangefficiëntie voor de verschillende stroomsnelheden en bepaal het optimale debiet.
   1. Tel het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen en uit de uitlaat stroomt. Bereken de opname-efficiëntie zoals hieronder:
      Capture efficiency = Aantal gevangen cellen/(Aantal gevangen cellen + aantal cellen dat uitstroomt) × 100%
   2. Herhaal dit om de vangstefficiëntie te verkrijgen voor verschillende aantallen tumorcellen van 10 tot 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
3. Test en valideer de microfluïdische chip op zeldzame aantallen tumorcellen. Injecteer deze 10 monstersuspensies in de microfluïdische chips met behulp van een holle naald gemaakt met een micropipettrekker om 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10 tumorcellen verdund in 1 ml PBS te zuigen. Detecteer en inventariseer het aantal tumorcellen voor elk monster na hun vangst op de chip.
   OPMERKING: De holle naald is ongeveer 3 cm lang met een uitwendige diameter van 1 mm.
4. Voer klinische pre-experimentele tests uit voor tumorcellen die in normale bloedmonsters zijn geprikt.
   1. Kleurt de tumorcellen met calceïne AM en inventariseer vervolgens 100 tumorcellen in 5 μL PBS. Spike deze cellen in 1 ml van hele normale bloedmonsters. Introduceer deze cellen in de chip en noteer het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen met groene immunofluorescentie. Voer in vivo opsomming uit op de chip zoals hierboven beschreven en bereken de opname-efficiëntie na het vastleggen.
   2. Herhaal stap 1.4.1 voor negen extra concentraties van tumorcelnummers van 10 tot 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. Som 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 en 10 tumorcellen op zoals beschreven in stap 1.3 zonder kleuring, piek in 1 ml volledig normaal bloed, breng deze monsters in de microfluïdische chip en vang de tumorcellen op de chip.
   4. Beits op de chip met Hoechst, CK-FITC en CD45-PE. Doe 3-5 μL fluorescerende kleurstof in 20-30 μL PBS en breng deze oplossing vervolgens met een spuit op de microfluïdische chip in. Inventariseer het aantal tumorcellen dat op de chip is gevangen met zowel blauwe als groene immunofluorescentie om de vangstefficiëntie te bepalen.
5. Voer modificatie van de microfluïdische chip uit voor de op affiniteit gebaseerde opname van anti-EpCAM.
   OPMERKING: Aangezien de golfchip zowel op affiniteit gebaseerde als op fysieke eigenschappen gebaseerde isolatie combineert, moet u de chip aanpassen met agents.
   1. Wijzig het oppervlak van de chip met 100 μL van 4% (v/v) 3-mercaptopropyltrimethoxysilaan in ethanol bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten. Breng deze oplossing voorzichtig en langzaam in de chip in voor het geval het de interne structuur van de chip vernietigt, met name de verlijming van het bovenoppervlak en het substraatglas.
      OPMERKING: Het chipoppervlak wordt aangepast met mercaptosilaan. De interacties die op de chip plaatsvinden, worden bepaald door chemische bindingen. Chemische bindingen worden vastgesteld om de binding van het antilichaam gemodificeerd met het antigeen te realiseren. Verschillende reagentia worden in de chip gemodificeerd om chemische bindingen tot stand te brengen die met elkaar verbinden. Het laatste reagens dat moet worden gemodificeerd is een anti-epitheliaal adhesiemolecuul (anti-EpCAM). Het antigeen van het tumorceloppervlak van EpCAM combineert met anti-EpCAM in de chip om de vangst van de CTC's te realiseren.
   2. Wassen met ethanol 3x. Voeg 100 μL van het koppelmiddel N-y-maleimidobutyryloxysuccinimide-ester (GMBS, 1 μM) toe aan de chip en laat het gedurende 30 minuten interageren.
   3. Wassen met PBS 3x. Gebruik een spuit om 1 ml PBS op de chip te brengen om te wassen.
   4. Behandel de chip met 30-40 μL van 10 μg / ml neutravidine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, wat leidt tot immobilisatie van de cellen op de GMBS, en spoel vervolgens met PBS om overtollig avidine te verwijderen.
   5. Wijzig de chip met 3 μL anti-gebiotinyleerd EpCAM-antilichaam in een concentratie van 10 μg/ml in 100 μL PBS met 1% (w/v) BSA. Bewaar dit een nacht.

2. Klinisch experiment op de chip om de circulerende tumorcellen (CTC's) op te sommen

1. Voorverwerk klinische bloedmonsters van kankerpatiënten met behulp van red blood cells lysis (RBCL) -oplossing, of breng 2-3 ml van het bloedmonster rechtstreeks op de microfluïdische chip met behulp van een spuit.
   1. Voer voorbewerking uit, die ongeveer 30 minuten duurt. Verzamel volbloedmonsters in antistollingsbuizen. Voeg 6-9 ml RBS-lysisoplossing toe aan 2-3 ml bloed. Centrifugeer op 111 x g gedurende 5-8 minuten bij kamertemperatuur en gooi de bovenste laag rode heldere vloeistof weg.
2. Vang, beits, herken en inventariseer de cellen op de chip zoals hieronder beschreven.
   1. Leg de cellen op de chip vast zoals beschreven in stap 1.Beits de chip voor de CTC's die zijn vastgelegd met Hoechst, CK-FITC en CD45-PE. CK-FITC is een specifieke kleuring voor tumorcellen en CD45-PE is voor witte bloedcellen.
   2. Voeg 3 μL CK-FITC toe aan 20 μL PBS. Breng dit in de spuit en pomp de verdunde CK-FITC op de chip. Laat 30 minuten inkoken. Breng 300 μL PBS op de chip om de chip te wassen.
   3. Voeg 3 μL CD45-PE toe aan 20 μL PBS. Breng dit in de spuit en pomp de verdunde CD45-PE op de chip. Laat 30 min staan. Breng 300 μL PBS op de chip om de chip te wassen.
   4. Identificeer de CTC's met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 20x of 40x. CTC's zenden zowel blauwe als groene fluorescentie uit en witte bloedcellen (WBC's) zenden zowel blauwe als rode fluorescentie uit. Identificeer de CTC's met zowel blauwe als groene fluorescentie en de WBC's met zowel blauwe als rode fluorescentie.
   5. Van de immunofluorescentiebeelden wordt het aantal CTC's opgesomd dat op de chip is vastgelegd. Somt de CTC's op als Hoechst+/CK-FITC+/CD45− en de WBC's als Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
3. Verrijk de opgevangen CTC's door met PBS door de spuit in omgekeerde richting op de microfluïdische chip te spoelen om de CTC's die op de chip zijn gevangen uit de inlaat te verzamelen. Gebruik een spuit met 1 ml PBS, breng deze uit de uitlaat om de CTC's die op de chip zijn vastgelegd binnen 2-3 minuten te verrijken en verzamel ze uit de inlaat. Gebruik 1 ml PBS voor elke wasstap en herhaal dit 3x.
4. Kleuring de tumorcellen of CTC's gevangen op de microfluïdische chip zoals hieronder beschreven.
   1. Beits met calceïne AM. Voeg 5 μL calceïne AM toe aan 20 μL PBS, kleurt de cellen gedurende 30 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 2 minuten bij 111 x g bij kamertemperatuur om tumorcellen te verkrijgen en suspensie in 1 ml PBS.
   2. Om de cellulaire kernen te identificeren, voegt u 20 μL DAPI-oplossing (10 μL DAPI-reagens in 20 μL PBS) toe aan de chip met een optimale stroomsnelheid van 1 ml / h voor microfilters met grote ellips en 1,5 ml / h voor trapezoïde microfilters. Passeer 20 μL anti-cytokeratine stockoplossing (3 μL anti-cytokeratine antilichaam in 20 μL PBS) om gedurende 30 minuten met de chip te reageren.
   3. Bevlek de WBC's die op de chip zijn vastgelegd. Nadat de CTC's op de chip zijn vastgelegd, voegt u 25 μL anti-CD45-antilichaamoplossing (5 μL anti-CD45-oplossing in 20 μL PBS) toe aan de chip en laat u deze gedurende 30 minuten kleuren. Was met PBS en identificeer de epitheelcellen met zowel blauwe als groene fluorescentie.
5. Voer immunofluorescentie-identificatie uit met fluorescentiemicroscopie zoals hieronder beschreven.
   1. Gebruik een fluorescentiemicroscoop en prikkel het monster met de blauwe laser. Zoek de cellen die blauwe fluorescentie uitzenden, die nucleaatcellen zijn. Gebruik een van de volgende vergrotingen: 10x, 20x of 40x. Zoek een duidelijk veld voor de tumorcel. Gebruik voor de blauwe laserbron een excitatieplaatgolflengte van 420-485 nm en een emissieplaatgolflengte van 515 nm.
   2. Gebruik zonder de monsters te verplaatsen een andere laserbron. Draai de fluorescentiemicroscoop en prikkel het monster met de groene laser. Zoek de cellen die groene fluorescentie uitzenden, wat wijst op tumorcellen. Maak foto's van hetzelfde veld met dezelfde vergroting met deze groene laserbron. De cellen die zowel blauwe als groene fluorescentie uitzenden, worden herkend als tumorcellen. Gebruik voor de groene laserbron een excitatieplaatgolflengte van 460-550 nm en een emissieplaatgolflengte van 590 nm
   3. Gebruik zonder de monsters te verplaatsen een andere laserbron. Draai de fluorescentiemicroscoop en prikkel het monster met de rode laser. Zoek de cellen die rode fluorescentie uitzenden. Maak foto's van hetzelfde veld met dezelfde vergroting met deze rode laserbron. De cellen die zowel blauwe als rode fluorescentie uitzenden, worden herkend als witte bloedcellen.
   4. Sla de afbeelding op voor verkregen met behulp van elk van de bovenstaande laserbronnen. Maak verschillende foto's van hetzelfde veld met verschillende gekleurde lichten.
   5. Gebruik ultraviolet licht met een excitatieplaatgolflengte van 330-400 nm en een emissieplaatgolflengte van 425 nm. Gebruik paars licht met een excitatieplaatgolflengte van 395-415 nm en een emissieplaatgolflengte van 455 nm.
6. Bereken de opname-efficiëntie zoals in stap 1.2.1.

Results

De hele installatie omvat een spuitpomp, een spuit en een microfluïdische chip. De celsuspensie in de spuit is verbonden met de spuitpomp en de celsuspensie wordt in de microfluïdische chip gebracht om de cellen op te vangen. De opname-efficiëntie voor alle gebruikte microfluïdische chips was ongeveer 90% of hoger. Voor de golfchip ontwierpen we microstructuren met gevarieerde openingen. De kleine openingen worden gebruikt om de CTC's op te vangen en de grote openingen worden gebruikt om de stroomsnelheid te versnellen. ...

Discussion

De prognose en vroege diagnose van kanker hebben een significant effect op de behandeling van kanker¹. CTC-isolatie met microfluïdische chips biedt een vloeibare biopsie zonder invasie. CTC's zijn echter uiterst zeldzaam en heterogeen in het bloed¹, wat het een uitdaging maakt om CTC's te isoleren. CTC's hebben vergelijkbare eigenschappen als de oorspronkelijke tumorbronnen waaruit ze afkomstig zijn. CTC's spelen dus een vitale rol bij kankermetastase¹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
gekalibreerde microcapillaire pipetten	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoklonaal antilichaam
DMEM	HyClone	SH30081.05
foetaal bovien serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicilline-streptomycine	Ying Reliable biotechnology, China
Rode bloedcellen lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010