Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64686

⸱

10 februari 2023

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2Department of Nutritional Sciences, The University of Texas at Austin

In dit artikel

Samenvatting

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Samenvatting

De komst van gerichte CRISPR-Cas-nucleasetechnologieën heeft een revolutie teweeggebracht in het vermogen om nauwkeurige genoombewerking uit te voeren in zowel gevestigde als opkomende modelsystemen. CRISPR-Cas genoombewerkingssystemen gebruiken een synthetisch gids-RNA (sgRNA) om een CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease te richten op specifieke genomische DNA-loci, waar de Cas-endonuclease een dubbelstrengsbreuk genereert. Het herstel van dubbelstrengsbreuken door intrinsieke foutgevoelige mechanismen leidt tot inserties en/of deleties, waardoor de locus wordt verstoord. Als alternatief kan de opname van dubbelstrengs DNA-donoren of enkelstrengs DNA-oligonucleotiden in dit proces de opname van precieze genoombewerkingen uitlokken, variërend van enkelwandige nucleotidepolymorfismen tot kleine immunologische tags of zelfs grote fluorescerende eiwitconstructen. Een groot knelpunt in deze procedure kan echter het vinden en isoleren van de gewenste bewerking in de kiembaan zijn. Dit protocol schetst een robuuste methode voor het screenen en isoleren van kiembaanmutaties op specifieke loci in Danio rerio (zebravis); Deze principes kunnen echter worden aangepast in elk model waar in vivo spermaverzameling mogelijk is.

Inleiding

Het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas-systeem is een krachtig hulpmiddel om loci-specifieke mutagenese en nauwkeurige genoombewerking uit te voeren in het Danio rerio (zebravis) modelsysteem 1,2,3,4. Het Cas-ribonucleoproteïne (RNP) bestaat uit twee hoofdcomponenten: een Cas-endonuclease (gewoonlijk Cas9 of Cas12a) en een locusspecifiek synthetisch gids-RNA (sgRNA)5. Samen genereert de Cas-RNP een dubbelstrengsbreuk (DSB) in de gewenste locus die kan worden gerepareerd door een van de twee intrinsieke reparatiemechanismen. Het niet-homologe end joining (NHEJ) reparatiemechanisme is foutgevoelig en resulteert vaak in een verscheidenheid aan inserties of deleties (indels) rond de DSB. Deze indels kunnen schadelijk zijn als ze een frameshiftmutatie of voortijdige stop in de resulterende eiwitsequentie introduceren. Als alternatief gebruikt het homologie-gerichte reparatiemechanisme (HDR) een donorsjabloon met homologiegebieden rond de DSB-site om de schade te herstellen. Onderzoekers kunnen profiteren van het HDR-systeem om nauwkeurige genomische bewerkingen te genereren. In het bijzonder kunnen ze een dubbelstrengs DNA-donorconstruct co-injecteren dat de gewenste bewerkingen bevat, evenals homologiegebieden die de DSB-site in het genoom flankeren. De toegenomen schaalvoordelen voor deze commercieel geproduceerde CRISPR-componenten hebben de barrières voor het screenen van meerdere loci en voor het opzetten van grootschalige inspanningen voor nauwkeurige genoombewerking aanzienlijk verminderd. In seksueel reproducerende diermodellen is een belangrijk knelpunt echter de identificatie en isolatie van kiembaanstabiele mutante dieren.

Het zebravismodelsysteem vertoont verschillende sleutelkwaliteiten die het gebruik ervan in omgekeerde genetische studies verbeteren. Ze zijn gemakkelijk in grote aantallen groot te brengen met elementaire aquatische huisvestingsapparatuur en vrouwtjes vertonen het hele jaar door een hoge vruchtbaarheid6. Bovendien maken hun externe eileg en bevruchting ze vatbaar voor de micro-injectie van CRISPR / Cas-componenten. De Cas-RNP wordt gewoonlijk geïnjecteerd in eencellige zebravisembryo's om DSB's / reparatie te genereren die in theorie door alle dochtercellen worden geërfd. Dipeloïde genomen vereisen echter twee DSB/reparatiegebeurtenissen om beide homologe chromosomen te mutageneren. Bovendien, hoewel Cas-RNP wordt geïnjecteerd in het eencellige stadium, kan de DSB / reparatie pas op latere punten in de ontwikkeling plaatsvinden. Samen dragen deze factoren bij aan het mozaïekkarakter van F0-geïnjecteerde vissen. Een veel voorkomende praktijk is om F0-geïnjecteerde vissen te oversteken en het F1-nageslacht te screenen op indels / specifieke bewerkingen. Omdat echter niet alle F0-geïnjecteerde vissen kiembaanmutaties bezitten, resulteert deze praktijk in veel onproductieve kruisingen die niet de gewenste bewerking genereren. Het screenen van de F0-kiembaan in plaats van F1-somatisch weefsel verhoogt de kans op het isoleren van de gewenste kiembaanbewerking en vermindert het aantal dieren dat nodig is in dit proces.

Sperma kan gemakkelijk worden verzameld van F0-geïnjecteerde zebravissen zonder dat euthanasie nodig is. Deze functie maakt cryopreservatie en rederivatie van ingevroren spermavoorraden7 mogelijk, maar kan ook worden gebruikt om de kiembaandragers van gewenste genomische mutaties 8,9 snel te screenen, identificeren en isoleren. Brocal et al. (2016) beschreven eerder een op sequencing gebaseerde methode voor het screenen van kiembaanbewerkingen in F0-geïnjecteerde mannelijke zebravissen10. Hoewel nuttig voor het identificeren van de gemuteerde allelen in de kiembaan, kan deze aanpak kostbaar worden bij hoge doorvoer en is deze mogelijk niet voor alle laboratoria toegankelijk. Het huidige protocol biedt daarentegen een laagdrempelige en kosteneffectieve op elektroforese gebaseerde strategie voor het identificeren van kiembaanbewerkingen. Concreet schetst dit protocol een robuuste methode voor het screenen en isoleren van kiembaanmutaties bij specifieke loci met behulp van agarosegel-elektroforese met hoge resolutie. Daarnaast beschrijft dit protocol een vergelijkbare strategie voor het identificeren van de succesvolle integratie van een donorconstruct met specifieke bewerkingen. Zoals altijd, als specifieke bewerkingen gewenst zijn, kunnen op sequencing gebaseerde strategieën worden uitgevoerd in combinatie met het hieronder beschreven protocol. Hoewel dit protocol specifiek is voor het zebravismodelsysteem, moeten deze principes kunnen worden aangepast aan elk model waarin het verzamelen van sperma een routineprocedure is. Samen zullen deze strategieën de identificatie mogelijk maken van F0-geïnjecteerde mannetjes met kiembaan-indels / bewerkingen die kunnen worden opgelost op een gel na standaard polymerasekettingreactie (PCR) en / of restrictievertering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health. Het protocol is goedgekeurd door de University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee (AUP-2021-00254).

1. Het sgRNA ontwerpen voor CRISPR-mutagenese

  1. Verkrijg de exonsequentie met de beoogde loci.
  2. Ontwerp een synthetisch gids-RNA (sgRNA) met een protospacer adjacent motif (PAM) site die specifiek is voor de Cas endonuclease.
    1. Als u een donorconstruct co-injecteert, ontwerpt u het sgRNA om een voorspelde snijplaats te hebben die zo dicht mogelijk bij de gewenste bewerkingen ligt.
      OPMERKING: APE is een gratis software met een tool om Cas9 sgRNA-sites11 te vinden. Als alternatief kunnen tools zoals CHOPCHOP worden gebruikt, die een online interface biedt voor het ontwerpen van sgRNA's die rekening houdt met de verschillende PAM-sites van Cas9 en andere Cas-endonucleasen12.
  3. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers om het gebied rond de ontworpen CRISPR / Cas-snijlocatie te versterken. Het PCR-product moet ongeveer 200-400 baseparen (bp) lang zijn om kleine indels op een gel later in het protocol te kunnen oplossen.
    OPMERKING: CHOPCHOP11 ontwerpt automatisch primers voor elke sgRNA die het produceert.
  4. Optioneel: Ontwerp een DNA-donorconstruct met de gewenste bewerking(en).
    1. Verkrijg de genomische sequentie van het exon dat de loci van de gewenste mutatie bevat.
      OPMERKING: Intronische sequenties kunnen variëren tussen individuen, dus het is het beste om de opname van intronische sequenties in het donorconstruct te vermijden, omdat dit de homologie-afhankelijke reparatieroute zou kunnen verstoren.
    2. Als een specifieke aminozuurverandering gewenst is, wijzig dan het specifieke codon dienovereenkomstig.
      OPMERKING: Houd bij het aanbrengen van deze wijzigingen rekening met de codonfrequentie. Kies indien mogelijk een codon met een hoog gebruik.
    3. Om CRISPR/Cas-vertering van het donorconstruct te voorkomen, moet u extra synonieme mutaties maken die (i) de PAM verstoren en/of (ii) de sgRNA-sequentie verstoren, waarbij een hogere voorkeur wordt gegeven aan het maken van niet-synonieme veranderingen dichter bij de PAM-site.
    4. Gebruik een beperkingssitezoeker (APE11 heeft deze functie ook) om unieke beperkingssites te vinden (sites die slechts één keer voorkomen) in het voorspelde PCR-product van de wild-type reeks.
      1. Herhaal dit proces voor het voorspelde PCR-product dat de succesvolle integratie van de donorconstructie weerspiegelt.
      2. Vergelijk de lijst met beperkingslocaties tussen de wild-type en donor-geïntegreerde sequenties om een beperkingssite te vinden die alleen aanwezig is in de bewerkte volgorde.
      3. Als er geen unieke beperkingslocatie wordt gevonden, ga dan door met het aanbrengen van synonieme wijzigingen binnen de donorconstructie totdat dit is bereikt.
        OPMERKING: Ga indien mogelijk door met het maken van synonieme mutaties die de sgRNA-binding aan het donorconstruct zouden verstoren.
    5. Trim de donorsequentie tot een beheersbare grootte (50-100 bp) met ten minste 20 bp homologie rond de voorspelde CRISPR / Cas-snijplaats en bewerkingen, indien mogelijk.
  5. Verkrijg de ontworpen sgRNA en/of DNA-donor oligonucleotiden, evenals eventuele primers die nodig zijn voor genotypering.
    OPMERKING: Om de vertering van de DNA-donor oligonucleotiden door nucleasen te voorkomen, wordt aanbevolen om de eerste drie fosfaatbindingen aan de 5' en 3' uiteinden van de DNA-oligonucleotiden te wijzigen met fosforothioaat.
  6. Injecteer 1 ml van het injectiemengsel in embryo's in één celstadium. Doorgaans bevat een standaard injectiemix het volgende:
    1 μL van 25 μM locus-specifiek sgRNA
    1 μL van 25 μM Cas9 endonuclease
    Optioneel: 1 μL van 3 μM DNA-donorconstruct
    1. Breng het totale volume op 5 μL met 0,1 M RNase-vrije KCl.
  7. Laat de F0-geïnjecteerde individuen zich ontwikkelen tot geslachtsrijpe volwassenen. Het resterende protocol richt zich op het screenen van de F0-geïnjecteerde mannetjes op kiembaanbewerkingen.

2. Opzetten van de kweektanks

  1. Prime F0-mannetjes voor paring door foktanks op te zetten met scheidingswanden tussen de F0-mannetjes en -vrouwtjes.
    1. Om het aantal benodigde foktanks te minimaliseren, zet u drie mannetjes tegenover twee vrouwtjes in elke tank.
      1. Stel zoveel mogelijk F0-mannetjes in als effectief kan worden gescreend en gehuisvest als individuen na het verzamelen van sperma. Het genotype van de vrouwtjes is niet belangrijk omdat hun gameten tijdens deze procedure niet worden verzameld.
    2. Zet één broedbak op met wild-type mannetjes tegenover vrouwtjes. Wild-type sperma zal dienen als een controle voor de interpretatie van de resultaten later in de procedure.
  2. Incubeer de voorbereide kweektanks een nacht.

3. Voorbereiding van de materialen voor de spermaverzamelingsprocedure

  1. Bereid voldoende verdovingsoplossing (0,016% tricaïne-HCl in viswater) om een kleine glazen kom te vullen.
  2. Doseer 40 μL 50 mM NaOH in 0,2 ml PCR-buizen. Bereid één buis voor voor elk spermamonster dat zal worden verzameld. Bewaren op ijs.
  3. Bereid individuele tanks van 0,8 l voor elke vis voor die tijdens de procedure zal worden bemonsterd. Deze tanks zullen de bemonsterde vissen huisvesten totdat de genotypering is voltooid.
    OPMERKING: Dit is de belangrijkste factor die het aantal vissen beperkt dat effectief kan worden gescreend in dit protocol. Zorg voor voldoende ruimte voor het huisvesten van de bemonsterde personen totdat de genotypering is voltooid.
  4. Bevochtig een spons van 1 inch x 1 inch (gesneden met een ondiepe, ovaalvormige divot om een mannelijke zebravis tijdens de procedure met de zijkant omhoog te houden) in viswater en knijp overtollige vloeistof uit.
    1. Plaats de spons in het gezichtsveld van een stereomicroscoop bij lage vergroting (figuur 1A).
    2. Plaats schuine bovenverlichting voor optimaal zicht.

4. De mannelijke vis verdoven en het sperma verzamelen

  1. Maak een schone capillaire buis.
    1. Schud de buiscontainer voorzichtig om een enkele capillaire buis vrij te maken.
    2. Plaats de capillaire buis in de meegeleverde bol en zet deze opzij.
  2. Breng een mannelijke vis over in de bereide verdovingsoplossing (0,016% tricaïne-HCl in viswater).
    1. Roer de oplossing voorzichtig met een lepel om het proces van anesthesie te versnellen.
    2. Zodra de beweging van het operculum (kieuw) vertraagt (ongeveer 1-2 minuten), gaat u verder met het verzamelen van sperma.
  3. Gebruik de lepel om de vis over te brengen op een schone stapel keukenpapier.
    1. Gebruik de lepel om de vis voorzichtig te rollen om overtollig water te verwijderen.
    2. Dep de vis voorzichtig met schoon, gevouwen tissuepapier om eventueel achtergebleven water te verwijderen.
  4. Gebruik de lepel om de vis over te brengen naar de voorbereide spons (figuur 1B).
    1. Plaats de ventrale kant van de vis naar boven met zijn kop het dichtst bij de dominante hand van de persoon die de procedure uitvoert.
    2. Dep het gebied rond de anale vinnen voorzichtig af met schoon, gevouwen vloeipapier.
  5. Verzamel het sperma.
    1. Gebruik het uiteinde van de capillaire buis en beweeg de bekkenvinnen voorzichtig zijdelings weg van de middellijn om de cloaca bloot te leggen (figuur 1C).
    2. Plaats het uiteinde van de capillaire buis in de buurt van de cloaca.
    3. Knijp met de tang zachtjes in de zijkanten van de vis, beginnend net onder de kieuwen en eindigend bij de cloaca (figuur 1C').
    4. Verzamel sperma in de capillaire buis door capillaire werking. Ongeveer 1 μL is voldoende voor deze procedure (figuur 1D).
      OPMERKING: Sommige laboratoria melden dat ze p10-pipetpunten gebruiken in plaats van capillaire buizen voor het verzamelen van sperma.
    5. Als sperma niet met zachte druk wordt vrijgegeven, breng de vis dan terug naar het systeemwater.
      1. Monitor voor herstel van de anesthesie.
      2. Knijp niet hard in de vis om sperma te verdrijven, omdat dit de vis kan verwonden.
      3. Laat de vis 2 weken rusten voordat je opnieuw sperma probeert te verzamelen.
    6. Plaats de vis na het verzamelen in een schone isolatietank met systeemwater voor individuele huisvesting.
      1. Controleer de vis op herstel van de anesthesie.
      2. Laat de vis 2 weken rusten voordat je opnieuw sperma probeert te verzamelen.
    7. Plaats de capillaire buis met het verzamelde sperma in de voorbereide PCR-buis (met 40 μL van 50 mM NaOH).
    8. Knijp in de rubberen bol om het verzamelde monster te verwijderen.
    9. Gooi de gebruikte capillaire buis weg in een goedgekeurde glasafvalcontainer.
    10. Incubeer de monsters op ijs totdat alle mannetjes zijn geperst.
  6. Herhaal stap 4.1-4.5 voor elke individuele man.
  7. Label de isolatietanks en spermamonsters zodanig dat de uiteindelijke spermagenotyperingsresultaten kunnen worden herleid tot het overeenkomstige individu met vermeende mutaties.
  8. Bewaak alle personen en zorg ervoor dat ze rechtop staan en hun tanks verkennen voordat u de tanks weer op het systeem plaatst.
  9. Plaats de vrouwtjes die worden gebruikt voor het primen terug in hun respectieve tanks op het systeem.
  10. Als een vis na 10 minuten niet herstelt van de anesthesie, volg dan de euthanasieprocedure die is goedgekeurd door de instelling die bij het laboratorium is aangesloten.
    1. Voorbeeld: Koel het individu snel af in een ijsbad met viswater van 2-4 °C.
    2. Gooi de geëuthanaseerde vis weg in een geschikte container voor kadaversafval volgens de procedure die is goedgekeurd door de instelling die bij het laboratorium is aangesloten.

5. DNA uit de spermamonsters halen

  1. Draai kort alle spermamonsters in een minicentrifuge en plaats PCR-buizen in een thermische cycler.
  2. Sluit het deksel van de thermische cycler.
  3. Voer de volgende instellingen uit in de thermische cycler:
    1. Verwarm de monsters gedurende 40 minuten bij 95 °C.
    2. Koel de monsters af tot 25 °C.
  4. Verwijder de monsters uit de thermische cycler.
  5. Met een schone pipetpunt voor elk monster neutraliseert u de pH door 10 μL 1 M Tris-HCl (gebufferd tot pH 8) toe te voegen.
  6. Meng goed door op en neer te pipetteren.
  7. Draai de monsters kort af in een minicentrifuge.
  8. Genomische DNA-monsters kunnen enkele dagen worden bewaard bij 4 °C of worden geplaatst bij −20 °C gedurende maximaal 6 maanden.

6. PCR-versterking (en/of restrictie-digest) van de gewenste locus

  1. Versterk de gewenste locus met behulp van een standaard PCR-protocol.
    1. Verwarm de thermische cycler voor op de initiële denaturatietemperatuur in de onderstaande PCR-reactie.
    2. Bereid een reactiemengsel van 25 μL voor elk spermamonster in PCR-buizen:
      12,5 μL 2x Taq Polymerase Master Mix
      1,5 μL van 10 μM voorwaartse primer
      1,5 μL van 10 μM omgekeerde primer
      4,5 μL nucleasevrij water
      5 μL geneutraliseerd sperma-DNA-monster
    3. Meng goed door op en neer te pipetteren.
    4. Draai de monsters kort af in een minicentrifuge.
    5. Plaats de monsters in de voorverwarmde thermische cycler met de volgende instellingen:
      Initiële denaturatie: 95 °C gedurende 3 min
      35 cycli van denaturatie (95 °C gedurende 30 s), gloeien (55 °C gedurende 30 s) en extensie (72 °C gedurende 30 s)
      Laatste verlenging: 72 °C gedurende 5 min
      OPMERKING: Het kan nodig zijn om de extensietemperatuur en/of -tijd aan te passen, afhankelijk van het specifieke Taq-polymerase en de verwachte lengte van het PCR-versterkingsproduct.
    6. Verwijder de PCR-monsters uit de thermische cycler.
  2. Optioneel: Voer de donorspecifieke restrictie-digest uit op een klein volume van het PCR-product, waarbij ten minste 5-10 μL onverteerd PCR-product overblijft voor gel-elektroforese.
    1. Bereid een reactie van 30 μl voor in PCR-buisjes van 0,2 ml:
      10 μL ongezuiverd PCR-product
      15 μL nucleasevrij water
      3 μL 10x restrictie-enzymbuffer
      2 μL restrictie-enzym (BstNI wordt gebruikt in de representatieve resultaten voor het analyseren van het dnah10 knock-in allel)
      OPMERKING: Veel restrictie-enzymen zijn nog steeds actief in een typische PCR-reactiebuffer; De toevoeging van een restrictiebuffer kan echter helpen de resultaten te verbeteren. Raadpleeg de instructies van de specifieke fabrikant voor het oplossen van problemen als er problemen optreden.
    2. Meng goed door op en neer te pipetteren.
    3. Draai de monsters kort af in een minicentrifuge.
    4. Plaats de monsters in een thermische cycler met de volgende instellingen:
      1. Snijd het PCR-amplicon gedurende 1 uur op 60 °C.
        OPMERKING: De snijtemperatuur en incubatietijd moeten mogelijk worden aangepast voor het specifieke restrictie-enzym dat wordt gebruikt.
      2. Inactiveer het restrictie-enzym met de vereiste temperatuur en incubatietijd, indien aangegeven door de fabrikant.
        OPMERKING: Het BstNI-enzym vereist geen warmte-inactivatie.

7. Het uitvoeren van gel-elektroforese om PCR-amplicons van verschillende groottes te scheiden

  1. Bereid 500 ml 0,5x TBE-loopbuffer voor: voeg 50 ml 10x TBE-bufferconcentraat toe aan 450 ml gedeïoniseerd water.
  2. Bereid 100 ml 4% agarosegel in 0,5x TBE-loopbuffer: voeg 4 g agarose met 10 μL 10.000x gelvlek toe aan 100 ml 0,5x TBE-loopbuffer. Magnetron tot het agarosepoeder volledig is opgelost.
    1. Giet de geloplossing in een gelgietframe van de juiste grootte en plaats de kam aan één kant van de gel.
      OPMERKING: Een grotere gelmaat (aanbevolen: 15 cm x 15 cm) is voordelig voor deze procedure, omdat het de amplicons meer ruimte biedt om op de gel op te lossen.
      1. Als een restrictieverteringsproduct moet worden geanalyseerd, is het het beste om het op dezelfde gel als het PCR-product te laten lopen, zodat de resultaten kunnen worden vergeleken. Pas de grootte van de kam zo nodig goed aan om alle monsters op de gel te passen.
    2. Laat de gel op kamertemperatuur staan tot hij gestold is. Verwijder voorzichtig de kam. Verwijder de gel voorzichtig van het gietframe.
  3. Stel de gel-elektroforese-rig in.
    1. Plaats de gel in de elektroforese-rig zodanig dat de putjes zich het dichtst bij de negatieve elektrode bevinden. Giet 0,5x TBE lopende buffer in de elektroforese-installatie totdat de putten volledig zijn ondergedompeld.
  4. Laad de gel.
    1. Laad 5 μL DNA-ladder in de eerste put (kies een DNA-ladder die DNA-fragmenten bevat die qua grootte vergelijkbaar zijn met het PCR-amplicon).
    2. Gebruik een nieuwe pipetpunt voor elk monster (inclusief het wild-type controlemonster) en laad 5-10 μL van het PCR-product in de resterende putjes.
    3. Optioneel: Als een restrictieverteringsproduct moet worden geanalyseerd, laadt u deze monsters ook op de gel.
      OPMERKING: Het is het beste om gelijke hoeveelheden DNA te laden tussen de PCR en het restrictieverteringsproduct. In het restrictieverteringsreactiemengsel van 30 μL werd bijvoorbeeld 10 μL PCR-product toegevoegd. Daarom was de DNA-concentratie van de 15 μL verteringsproduct vergelijkbaar met de 5 μL van het ongezuiverde PCR-product.
  5. Laat de gel lopen.
    1. Sluit de elektroden aan op de gel-elektroforese-installatie en breng 150 V aan gedurende ten minste 1 uur om een adequate scheiding van de amplicons te garanderen.
    2. Maak een afbeelding van de gel om de DNA-banden te bekijken.
      OPMERKING: Sterk gemutagiseerde CRISPR-gerichte loci worden uitgevoerd als meerdere bandgroottes die een combinatie van insertie- / deletie-allelen vertegenwoordigen met de wild-type amplicons.
      1. Als de gelbanden na 1 uur niet zijn verdwenen, breng dan 150 V aan op de gel gedurende intervallen van 15 minuten totdat de banden voldoende gescheiden zijn op de gel.
      2. Optioneel: Als u screent op het invoegen van een nauwkeurige bewerking zoals een SNP, epitooptag of fluorescerende tag, screent u het sperma-DNA met PCR-methoden die specifiek zijn voor de gewenste bewerking. Bij het identificeren van een donorspecifieke beperkingslocatie zal bijvoorbeeld een extra band aanwezig zijn in het restrictieverteringsproduct in vergelijking met het PCR-product van het spermamonster.

8. Isoleren van kiembaan stabiele allelen

  1. Na 2 weken rust van de spermaknijpprocedure, oversteek je de F0-individuen van wie het genomische DNA van het sperma de gewenste bewerkingen bevatte.
    OPMERKING: Het genereren van sperma van individuele spermatogonia-klonen kan cyclisch zijn bij zebravissen; Het is dus mogelijk dat het gewenste allel geen sperma produceert op het moment van de outcross. Om deze reden moet mogelijk meer dan eens extra kruising worden uitgevoerd om het allel te isoleren dat bij de eerste screening is betrokken.
  2. Zodra de F1-gekruiste vissen geslachtsrijp zijn, gaat u verder met standaard genotyperingsmethoden (bijvoorbeeld vin-clip DNA) met behulp van hetzelfde PCR- en gel-elektroforeseprotocol dat wordt uitgevoerd tijdens de screening van het genomische DNA van het sperma.
    1. Sanger sequentieert de PCR-producten om de F1-individuen te identificeren met dezelfde gewenste bewerking.
    2. Optioneel: Als de gewenste bewerking een beperkingssite introduceert of verstoort, wordt een scherm weergegeven met een geschikt protocol voor de beperkingssamenvatting.
  3. In-cross F1 heterozygoten met dezelfde gewenste edit.
  4. Screen het F2-nageslacht op het verwachte fenotype en/of genomische bewerkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De experimentele benaderingen die in dit protocol worden beschreven, maken de snellere identificatie van genoombewerkingen of vermeende schadelijke allelen mogelijk door zich te concentreren op de analyse van duizenden genomen die zijn afgeleid van de verzameling F0-geïnjecteerd mannelijk sperma. Figuur 2 laat zien hoe de resultaten die met dit protocol zijn verkregen, moeten worden geïnterpreteerd.

Om mutaties in de p2ry12-locus te genereren, werden eencellige ze...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode voor het snel karakteriseren van vermeende genoombewerkingen of gerichte mutaties met behulp van CRISPR-Cas-technologie door gerichte analyse op F0 mannelijke spermagenomen. Dit protocol moet vatbaar zijn voor andere diermodellen waarbij sperma gemakkelijk beschikbaar is voor bemonstering zonder euthanasie. Deze methode verhoogt de doorvoer van screening voor gewenste bewerkingen en is vooral handig voor het identificeren van zeldzame HDR-gemedieerde knock-in-gebeurtenissen. Deze aanpa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

We willen Anna Hindes van de Washington University School of Medicine bedanken voor haar eerste inspanningen om sperma-genomisch DNA van goede kwaliteit te verkrijgen met behulp van de hot shot-methode. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose poeder Fisher BioReagentsBP1356-100
KweektanksCarolina Biological 161937
BstNI restrictie-enzymNEBR0168S
Cas9 endonucleaseIDT1081060
DNA Ladder, 100 bp Thermo Scientific FERSM0241
dnah10 donor construct  Sigma-AldrichDNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry.
Phosphorothioate binding op de donor op de eerste drie fosfaatbindingen aan zowel de 5’ als 3’ uiteinden (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGA AGCTCTTC
TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT
GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC
AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 voorwaartse primer Sigma-AldrichDNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standaard desalt-zuivering, droog (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT
TTGGC-3')
dnah10 omgekeerde primer Sigma-AldrichDNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standaard desalt-zuivering, droog ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAG A
ATACAGC-3') 
dnah10 synthetisch sgRNA Synthego Synthetisch sgRNA, doelsequentie: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'
Elektroforese voedingThermo Scientific 105ECA-115
Filter pincetMilliporeXX6200006P
Vis (systeem) waterGenericn/a
Gelelektroforese systeem (inclusief gietframe, kam en elektroforesekamer) Thermo Scientific B2
Gel beeldvorming lichtbox Azure BiosystemsAZI200-01
Gel vlek, 10000X InvitrogenS33102
Glaskom, 250 mL Genericn/a
Isolatievakken, 0,8 L AquaneeringZT080
Microcap capillaire buis met knop, 20 µL Drummond1-000-0020/CA
MinicentrifugeBio-Rad12011919EDU
Micropipetten, verschillende met geschikte tipsGeneric n/a
Microgolfoven Generic n/a
Nuclease vrij waterPromegaP119-C
PapierdoekjesGenericn/a
PCR buizen, 0,2 mLBioexpressT-3196-1
Kunststof lepel, met geboord gaten/slots Genericn/a
KCl oplossing, 0,2 M RNAse VrijSigma-AldrichP9333
p2ry12 voorwaartse primer Sigma-AldrichDNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standaard desalt-zuivering, droog (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT
-3')
p2ry12 omgekeerde primerSigma-AldrichDNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standaard desalt-zuivering, droog (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT
-3') 
p2ry12 synthetisch sgRNA Synthego Synthetisch sgRNA, doelsequentie: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
Restrictie-enzym 10X BufferNEBB6003SVIAL
NaOH oplossing, 50 mM Thermo Scientific S318; 424330010
Spons, 1-inch x 1-inch gesneden met kleine ovale uitsparingGeneric n/a
StereomicroscoopZeissStemi 508
Taq polymerase master mix, 2XPromegaM7122
TBE Buffer Concentraat, 10XVWRE442
Thermische cyclerBio-Rad1861096
WeefselpapierFisher Scientific06-666
Tricaine-methaansulfonaat oplossing (Syncaine, MS-222), 0,016% in vis water (pH 7,0±0,2) Syndel200-266
Tris Base, 1M (Gebufferd met HCl naar ph 8,0) PromegaH5131

Referenties

  1. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  2. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  3. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  4. Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
  5. Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
  6. Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
  7. Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
  8. Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
  9. Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
  10. Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259(2016).
  11. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619(2022).
  12. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  13. Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  14. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  15. Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
  16. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  17. Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  18. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

CRISPR-genoomredigeringkiembaanmodificaties bij zebravisspermascreeningPCR-restrictie-enzymengelelektroforesein vitro fertilisatieF0-mannelijke dragersindel-detectiethermische cyclerDNA-sequencing
Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.