Methodenartikel

Constructie, karakterisering en regeneratieve toepassing van zelfgeassembleerde menselijke mesenchymale stamcelaggregaten

DOI:

10.3791/64697

⸱

24 maart 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, The Fourth Military Medical University, 2Department of Preventive Dentistry, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3College of Life Science, Northwest University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een methode om aggregaten te construeren op basis van de zelfassemblage van menselijke mesenchymale stamcellen en identificeert de morfologische en histologische kenmerken voor de regeneratieve behandeling van schedelbotdefecten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC's), gekenmerkt door hun zelfvernieuwend vermogen en differentiatiepotentieel voor meerdere afstammingslijnen, kunnen uit verschillende bronnen worden afgeleid en zijn in opkomst als veelbelovende kandidaten voor regeneratieve geneeskunde, vooral voor regeneratie van tand, bot, kraakbeen en huid. De zelfsamengestelde benadering van MSC-aggregatie, die met name celclusters construeert die de zich ontwikkelende mesenchymale condensatie nabootsen, maakt afgifte van stamcellen met hoge dichtheid mogelijk, samen met geconserveerde cel-celinteracties en extracellulaire matrix (ECM) als de micro-omgevingsniche. Het is aangetoond dat deze methode efficiënte celtransplantatie en overleving mogelijk maakt, waardoor de geoptimaliseerde toepassing van exogene MSC's in weefselmanipulatie wordt bevorderd en de klinische orgaanregeneratie wordt beschermd. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de constructie en karakterisering van zelfgeassembleerde aggregaten op basis van mesenchymale stamcellen van de navelstreng (UCMSC's), evenals een voorbeeld van de regeneratieve toepassing van het schedelbot. De implementatie van deze procedure zal helpen bij het opzetten van een efficiënte MSC-transplantatiestrategie voor weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Condensatie van mesenchymale stamcellen (MSC) is een essentiële fase om de normale groei en ontwikkeling van het lichaam te garanderen in de vroege organogenese 1,2, vooral bij de vorming van bot, kraakbeen, tanden en huid 1,3,4. In de afgelopen decennia hebben weefselmanipulatietherapieën met behulp van gekweekte postnatale MSC's in combinatie met biologisch afbreekbare steigers belangrijke vooruitgang geboekt op het gebied van osteogene5 en kraakbeenregeneratie6. Het gebruik van steigers kan echter enkele nadelen hebben, zoals immuunafstoting, evenals een lage cellulaire affiniteit en plasticiteit7. In dit verband hebben we de haalbaarheid onderzocht van het toepassen van een sferoïde celkweekmethode om steigervrije, zelfgeassembleerde aggregaten te leveren die het zich ontwikkelende condensatiefenomeen nabootsen, die alleen MSC's en de afgezette extracellulaire matrix (ECM) bevatten8. De vorming van aggregaten verhoogt de toepassing van plasticiteit om overeen te komen met de defectvorm en vermijdt steigerimplantatie en vertering door proteolytische enzymen om MSC's te oogsten voor transplantatie9.

MSC-aggregaten zijn op grote schaal gebruikt voor de regeneratie van onder andere het bot, de tandpulp, het parodontium en de huid10. Veel verschillende soorten MSC's kunnen worden geselecteerd als kandidaten voor zaadcellen, inclusief maar niet beperkt tot beenmerg-MSC's (BMMSC's), navelstreng-MSC's (UCMSC's), van vetweefsel afgeleide stromale cellen (ADSC's) en tandheelkundige MSC's (bijv. mesenchymale stamcellen van tandpulp [DPSC's], mesenchymale stamcellen van de melktanden [SHED]11 en parodontale mesenchymale stamcellen [PDLSC's])12. In het afgelopen decennium zijn er veel technologieën voor driedimensionale celclusters ontwikkeld, waaronder geassisteerde en zelfgeassembleerde aggregatie. Geassisteerde aggregatiebenaderingen zijn echter vaak zwak in het produceren van ECM's en het vormen van homogene en strakke aggregaten, en zijn daarom niet geschikt voor het nabootsen van fysiologische omstandigheden 13,14,15. Bovendien vereisen sommige geassisteerde aggregatiemethoden interacties tussen cellen en materialen om stabiele structuren te vormen 16,17,18,19, terwijl deze zelf samengestelde aggregatiemethode algemeen beschikbaar is voor een breed scala aan MSC's. Met name in onze recente klinische onderzoeken zijn MSC-aggregaten met succes gebruikt om het pulp-dentinecomplex en het parodontium te regenereren na implantatie in beschadigde menselijke snijtanden, die de novo weefselregeneratie hebben bereikt met fysiologische structuur en functie20,21.

Dit artikel biedt een grondige procedure voor de constructie en karakterisering van MSC-aggregaten, evenals voor in vivo transplantatie. Deze aanpak zal de aandacht trekken van onderzoekers wanneer ze gericht zijn op het herstellen van defecten in weefsels, zoals de tanden, botten, kraakbeen en huid, op basis van stamceltoepassingen. Deze methode is eenvoudig, handig en volledig samengesteld uit cellen en ECM zonder extra steigers, die lange tijd kunnen worden gekweekt om dichte en stabiele aggregaten te verkrijgen22. Ondertussen zijn de op deze manier gekweekte aggregaten rijk aan ECM, dat de zich ontwikkelende niche voor deze cellen met hoge dichtheid nabootst en zo weefselregeneratie bevordert23. Het bouwproces kan worden onderverdeeld in twee fasen: celvoorbereiding en -kweek, en zelf-geassembleerde vorming en oogst van celaggregaten. De karakterisering van aggregaten omvat morfologische identificatie via een omgekeerde optische microscoop en een scanning-elektronenmicroscoop (SEM), en histologische analyse via hematoxyline en eosine (HE) en Masson's kleuring. De gevormde aggregaten werden gedemonstreerd voor regeneratieve implantatie om het schedelbotdefect te herstellen. De implementatie van deze procedure zal helpen bij het opzetten van een efficiënte MSC-transplantatiestrategie voor weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Fourth Military Medical University en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Voor de huidige studie werden gecryopreserveerde menselijke UCMSC's gebruikt die werden verkregen uit een commerciële bron (zie materiaaltabel). Het gebruik van menselijke cellen werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Vierde Militaire Medische Universiteit. UCMSC's werden als voorbeeld genomen om de procedure te beschrijven. Het schedeldefect werd als voorbeeld genomen om de noodzaak van reparatie aan te tonen om de implantatieprocedure te beschrijven. Alle experimenten werden drie keer herhaald.

1. Bouw van UCMSC-aggregaten

  1. Voorbereiding en cultuur van UCMSC's
    1. Voeg 10 ml voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan een nieuwe centrifugaalbuis van 15 ml in een steriele bioveiligheidskast.
    2. Verwijder de vriesbuis met bevroren UCMSC's van vloeibare stikstof en plaats deze snel in een waterbad van 37 °C. Schud de tube voorzichtig om een snelle en grondige ontdooiing van de cellen te vergemakkelijken.
      LET OP: De hele procedure moet binnen 1 minuut zijn voltooid, omdat dimethylsulfoxide (DMSO) in de vriesoplossing cytotoxiciteit kan veroorzaken.
    3. Hang de cellen lichtjes in de vriesbuis en breng de hele inhoud over in de centrifugebuis met 10 ml PBS (stap 1.1.1). Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 100 × g . Gooi het bovenstaande weg en spoel de cellen met 10 ml PBS.
    4. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 100 × g . Gooi het supernatant weg en resustrien de cellen voorzichtig met een volledig alfa-minimum essentieel medium (α-MEM) dat 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine en 584 mg/L glutamine bevat.
    5. Zaai de geresuspendeerde cellen in kweekschaaltjes van 10 cm (vaak één tot twee schaaltjes voor één buis, afhankelijk van de totale hoeveelheid cellen na centrifugatie, met een dichtheid van 5 × 106 cellen per schaal). Voeg een compleet α-MEM-medium toe aan de schalen tot een totaal volume van 10 ml.
    6. Schud de vaatjes voorzichtig om de cellen te verdelen. Incubeer de schaaltjes bij 37 °C met 5% CO2 in een bevochtigde kamer. Gooi na een nacht incubatie het bovenstaande medium weg en voeg 1-2x 5 ml PBS toe om de niet-aanhangende cellen te verwijderen. Voeg 10 ml verse complete α-MEM medium toe. Verander de kweekmedia elke 2 dagen.
    7. Voor celpassage, wanneer de cellen 80%-90% samenvloeiing bereiken, gooit u het bovenstaande weg en wast u de cellen met 5 ml PBS om het medium grondig te verwijderen. Incubeer de cellen in 2 ml 0,25% trypsine-1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bij 37 °C gedurende 2 min.
    8. Wanneer de cellen rond worden met gebroken intercellulaire verbindingen onder een microscoop, scheidt u de cellen van de schaaltjes zonder al te veel verstoring van de celstructuur. Neutraliseer de trypsine door 4 ml volledig α-MEM-medium toe te voegen.
    9. Verzamel de cellen herhaaldelijk en voorzichtig uit de vaat door te pipetteren in een verse centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 100 × g . Gooi de supernatant weg, suspendeer de cellen met volledig α-MEM-medium en zaai ze in verse kweekschalen of putplaten. Verander de kweekmedia elke 2 dagen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van het defectgebied vereist een defect van 25 mm3 het gebruik van een putje met plaatcellen met 6 putjes die zijn gekweekt om aggregaten te vormen.
  2. Vorming en oogst van aggregaten
    1. Bereid celaggregatie-inducerende media voor door 50 μg/ml vitamine C toe te voegen aan α-MEM met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 584 mg/L glutamine.
      LET OP: Directe blootstelling aan licht moet worden vermeden bij het gebruik van vitamine C, omdat vitamine C oxideert bij blootstelling aan licht en niet meer werkt.
    2. Wanneer de cellen in stap 1.1.12 95% samenvloeiing bereiken (aanvullende figuur S1), wijzigt u de media in celaggregatie-inducerende media; Vervang elke 2 dagen nieuwe celaggregatie-inducerende media.
    3. Na 7-10 dagen induceren (de duur van de induceertijd is afhankelijk van de stamceltypen en is vaak ~7 dagen voor de rand van UCMSC's), zoek je onder de microscoop naar gevormde aggregaten, met dikke randen gescheiden van de bodem van de schotel.
    4. Gooi de kweekmedia weg en was de cellen voorzichtig 2x met PBS. Duw de aggregaten voorzichtig van de rand naar het midden met behulp van een kleine steriele tang en vouw de aggregaten.
    5. In sommige gevallen kunnen UCMSC's spontaan naar het midden krullen om een vaste condensatie te vormen. Deze structuur is gelijk aan het aggregaat dat in stap 1.2.4 is verkregen.

2. Morfologische identificatie van aggregaten

  1. Algemene en microscopische waarneming
    1. Merk op dat de aggregaten dicht en geïntegreerd zijn en niet gemakkelijk worden beschadigd door mechanische krachten, zoals trekken tijdens losraken en transplanteren.
    2. Zoek onder een microscoop naar een membraanachtige structuur van een bepaalde dikte met een geweven patroon.
  2. Kleuring van levende/dode cellen
    1. Zaai de cellen in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 1 × 106 cellen per putje.
    2. Bereid 2 μM calceïne AM en 4 μM EthD-1 werkoplossing en gebruik PBS.
    3. Voeg 0,3% triton toe aan de cellen gedurende 5 minuten, was met PBS drie keer om de cellen dood te induceren, als controle op kleuring.
    4. Was de cellen, aggregaten en dode-inducerende cellen twee keer met PBS.
    5. Voeg in stap 2.2.2 100 μl PBS en 100 μl bereide kleuroplossing toe aan elk putje.
    6. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij RT. Was het monster twee keer met PBS.
    7. Voeg 200 μL 10 μg/ml Hoechst toe aan elk putje en incubeer het monster gedurende 5 minuten bij RT. Wah het monster tweemaal met PBS.
    8. Observeer onder een fluorescentiemicroscoop.
  3. SEM-observatie
    1. Zaai en induceer de in stap 1.2.4 of 1.2.5 verkregen aggregaten. Was de cellen met PBS nadat de aggregaten zijn gevormd in stap 1.2.4. of 1.2.5.
    2. Fixeer de cellen met glutaaraldehyde gedurende ten minste 4 uur.
    3. Was de monsters met PBS en dehydrateer ze vervolgens gedurende 5 minuten door een gradiëntconcentratie van ethanol van 30%, 50%, 70%, 80%, 90% tot 100%. Behandel 2x met watervrije ethanol.
    4. Dompel de aggregaten 30 minuten onder in 3 ml hexamethyldisilazaan. Zuig alle vloeistof op en droog de monsters op natuurlijke wijze grondig.
      LET OP: Het hele proces moet worden uitgevoerd in een zuurkast, omdat hexamethyldisilazaan vluchtig en zeer giftig is.
    5. Plak de gedroogde monsters met dubbelzijdig carbontape op de monstertabel en bedek het oppervlak met metaal. Bewaar het monster enkele dagen bij kamertemperatuur (RT).
    6. Observeren onder een SEM.
      1. Plaats het monster terug in de machine. Stel de machine in voltage op 5 k en de brandpuntsafstand op ~12 mm. Pas de scherpstelbalk aan totdat er een duidelijk beeld verschijnt.
      2. Leg de beelden vast met een lage vergroting. Pas de vergroting aan en stel opnieuw scherp om een beeld met een hogere vergroting te verkrijgen.
        LET OP: Het oppervlak van de aggregaten mag niet worden aangeraakt vóór de waarneming om vernietiging van de oppervlaktemorfologie te voorkomen.

3. Histologische analyse van aggregaten

  1. Fixatie en doorsnede van monsters
    1. Fixeer de in stap 1.2.4 of 1.2.5 verkregen aggregaten met 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende ten minste 24 uur. Was na de fixatie met PBS en plaats het monster een nacht in inbeddingscassettes om af te spoelen met stromend water.
    2. Dehydrateer de monsters met behulp van automatische dehydratatiemachines door gradiëntethanol, xyleen en paraffine, volgens de instructies van de fabrikant. Het hele proces is als volgt: 85% ethanol gedurende 2 uur bij RT, 95% ethanol gedurende 2 uur bij RT, 95% ethanol gedurende 2 uur bij RT, 100% ethanol gedurende 2 uur bij RT, 100% ethanol gedurende 1,5 uur bij RT, xyleen gedurende 45 minuten bij RT, xyleen gedurende 45 minuten bij RT, paraffine gedurende 30 minuten bij RT, paraffine gedurende 1,5 uur bij RT en ten slotte paraffine gedurende 2 uur bij 60 °C.
    3. Sluit de monsters in met paraffine. Bereid de coupes van ongeveer 5 μm dik voor, plak ze op kationische objectglaasjes en droog de objectglaasjes gedurende 2 uur bij 45 °C.
    4. Dewax achtereenvolgens door xyleen gedurende 15 minuten, twee keer en 100%, 90%, 80% en 70% ethanol (elk gedurende 5 minuten).
    5. Spoel de dia's 3x langzaam af met stromend water gedurende 5 minuten.
  2. HE kleuring
    1. Bevlek met hematoxyline gedurende 3-5 minuten, spoel af met water en verwijder voorzichtig overtollig vocht rond het weefsel.
    2. Fractioneer met ethanol met 1% zoutzuur gedurende 3-5 s en spoel af met stromend water, waarbij de kleur iets lichter en blauw wordt. Verwijder overtollig water rond het weefsel.
    3. Bevlek gedurende 1 minuut met eosine, spoel af met stromend water en verwijder overtollig vocht rond het weefsel.
    4. Dehydrateer met 70%, 80%, 90% en 100% ethanol gedurende elk 10 s, xyleen gedurende 15 minuten, twee keer en droog op natuurlijke wijze in de zuurkast voordat u de plaat afdicht.
    5. Voeg neutrale harsdruppels toe en sluit de glaasjes af met dekglaasjes. Observeer onder een lichtmicroscoop.
  3. Masson's trichrome kleuring
    1. Bevlek met Weigert's ijzerhematoxyline gedurende 5 minuten, spoel af met water en veeg droog.
    2. Fractioneer met ethanol met 1% zoutzuur gedurende 3-5 s en spoel af met stromend water, waarbij de kleur iets lichter en blauw wordt. Veeg het oppervlak droog.
    3. Kleur met Lixin rode zure magenta oplossing gedurende 5-10 minuten en spoel snel af met gedestilleerd water.
    4. Behandel met fosfomolybdische zure waterige oplossing gedurende 3-5 minuten.
    5. Vlek direct opnieuw met anilineblauwe oplossing gedurende 5 minuten zonder te wassen met water.
    6. Behandel met 1% ijsazijn gedurende 1 min.
    7. Dehydrateer met 70%, 80%, 90% en 100% ethanol gedurende elk 10 s, xyleen gedurende 15 minuten, twee keer en droog op natuurlijke wijze in de zuurkast voordat u de plaat afdicht.
    8. Voeg neutrale harsdruppels toe en sluit de glaasjes af met dekglaasjes. Observeer onder een lichtmicroscoop.

4. Implantatie

  1. Verdoof de naakte muis door een intraperitoneale injectie van 50 mg/kg pentobarbitalnatrium.
    OPMERKING: Controleer of de muizen goed zijn verdoofd op basis van de afwezigheid van hoornvliesreflex en ledemaatreactie wanneer de voetzool wordt bekneld. Breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen.
  2. Knip een dwarse incisie (~3-4 cm) uit in de huid achter de oren van de naaktmuis met een steriel schaartje na desinfectie met jodofoor.
  3. Trek de huid naar voren om de schedel bloot te leggen. Teken de randen van het geplande defectgebied lichtjes met een 11# mes en verwijder het botfragment. Het defectgebied is een cirkelvormig gebied met een diameter van ongeveer 4 mm. Gebruik zoutoplossing om de wond te spoelen en voldoende hemostase te bieden.
  4. Dompel de in stap 1.2.5 of 1.2.6 verkregen aggregaten onder in een steriel gaas om het vocht aan het oppervlak te absorberen voordat u ze implanteert. Plaats de aggregaten in het gebied en zet ze licht onder druk om het defect op te vullen.
  5. Plaats de huid terug na het trekken om er zeker van te zijn dat het implantaat goed vastzit. Sluit de incisie met 1/2, 4 × 10 schuine hechtingen en 4-0 hechtingen.
  6. Leg de dieren na de operatie op de opwarmdeken totdat ze actief zijn en zet ze dan terug in de kooi.
    OPMERKING: De dieren mogen niet zonder toezicht worden achtergelaten totdat ze weer voldoende bewustzijn hebben om de borstspier te laten liggen. De dieren die een operatie hebben ondergaan, worden pas teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren als ze volledig hersteld zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aggregaten kunnen met succes worden opgebouwd uit UCMSC's volgens de experimentele workflow (Figuur 1). De kwaliteit van aggregaten moet vóór gebruik worden geëvalueerd door middel van morfologische observatie en histologische analyse. De gevormde lamellaire structuur moet volledig en dicht zijn, waarbij de cellen met elkaar verweven zijn om een geweven patroon te vormen door microscopische waarneming (Figuur 2A). Randk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de vooruitgang van de biotechnologie van weefselmanipulatie zijn strategieën om een implanteerbare structuur te construeren met een hoge plasticiteit en met cellen die op lange termijn overleven die optimale regeneratie kunnen bereiken, de focus van veel wetenschappers geweest. Er zijn verschillende huidige implantatiemethoden van MSC's, zoals methoden met alleen cellen, steigers aangevuld met cytokines 6,24 of de combinatie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81930025, 82100969 en 82071075) en het National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104400 en 2021YFA1100600). We zijn dankbaar voor de hulp van het National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTA (1x)SigmaT4049Celpassage
Automatische dehydratatiemachineLEICAASP200sAggregaten dehydrateren
CentrifugeEppendorf5418RCentrifugatie
CentrifugebuisThermo Nunc339650Centrifugatie
KweekschaalThermo150466Kweek van UCMSCs
EthanolSCR10009218Aggregaten dehydrateren
Fataalvermijdend bovien serumSijiqing11011-8611Kweek van UCMSCs
PincetJZJD1080Aggregaten oogsten
GlutaraldehydeProandy10217-1Aggregaten fixeren
Hematoxyline en Eosine kleuringssetbeyotimeC0105SHE-kleuring
HexamethyldisilazaneSCR80068416Aggregatenoppervlak drogen
Hoechst33342Sigma14533Celkernkleuring
L-glutamineSigmaG5792Kweek van UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit InvitrogenL3224Live/dead celkleuring
Masson's KleuringssetZHCCD069Masson Kleuring
Minimum Essential Medium Alpha basis (1x)GibcoC12571500BTKweek van UCMSCs
ParaffineLeica39601006Weefselinbedden
ParaformaldehydeSaint-BioD16013Aggregaten fixeren
PBS (1x)MeilunbioMA0015UCMSCs hersuspenderen en zuiveren
Penicilline/StreptomycineProcell Life SciencePB180120Kweek van UCMSCs
Pentobarbital natriumSigmaP3761Dierdier anesthesie
PolysporinPfizerOogdroogte voorkomen
Scanning Electron MicroscopeHitachis-4800SEM observatie
SchaarJZY00030Chirurgische incisie bij dieren
Zes-well plaatThermo140675Kweek van UCMSCs
HechtdraadJinhuanF603Wonden sluiten
NaaldXy4-0Wonden sluiten
ThermostaatapparatuurGrantv-0001-0005Waterbad
UCMSCsBai'ao UKK220201Commercieel verkrijgbare UCMSCs
Vitamine CDiyibioDY40138-25gAggregaten induceren
XyleenSCR10023418Aggregaten dehydrateren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
  2. Hall, B. K., Miyake, T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 22 (2), 138-147 (2000).
  3. Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B., Longaker, M. T. Mechanisms of bone development and repair. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (11), 696-711 (2020).
  4. Mammoto, T., et al. Mechanochemical control of mesenchymal condensation and embryonic tooth organ formation. Developmental Cell. 21 (4), 758-769 (2011).
  5. Khanarian, N. T., Jiang, J., Wan, L. Q., Mow, V. C., Lu, H. H. A hydrogel-mineral composite scaffold for osteochondral interface tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 18 (5-6), 533-545 (2012).
  6. Liu, M., et al. Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. Bone Research. 5, 17014(2017).
  7. Ai, C., et al. Osteochondral tissue engineering: Perspectives for clinical application and preclinical development. Journal of Orthopaedic Translatation. 30, 93-102 (2021).
  8. Huang, X., et al. Microenvironment influences odontogenic mesenchymal stem cells mediated dental pulp regeneration. Frontiers in Physiology. 12, 656588(2021).
  9. Li, M., Ma, J., Gao, Y., Yang, L. Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine. Cytotherapy. 21 (1), 3-16 (2019).
  10. An, Y., et al. marrow mesenchymal stem cell aggregate: an optimal cell therapy for full-layer cutaneous wound vascularization and regeneration. Scientific Reports. 5, 17036(2015).
  11. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  12. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81 (8), 531-535 (2002).
  13. Chen, H., et al. Regeneration of pulpo-dentinal-like complex by a group of unique multipotent CD24a(+) stem cells. Science Advances. 6 (15), (2020).
  14. Yang, T., et al. hDPSC-laden GelMA microspheres fabricated using electrostatic microdroplet method for endodontic regeneration. Materials Science & Engineering. C: Materials for Biological Applications. 121, 111850(2021).
  15. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720(2011).
  16. Nakao, K., et al. The development of a bioengineered organ germ method. Nature Methods. 4 (3), 227-230 (2007).
  17. Hasani-Sadrabadi, M. M., et al. An engineered cell-laden adhesive hydrogel promotes craniofacial bone tissue regeneration in rats. Science Translational Medicine. 12 (534), (2020).
  18. Fan, L., et al. Gravitational sedimentation-based approach for ultra-simple and flexible cell patterning coculture on microfluidic device. Biofabrication. 12 (3), 035005(2020).
  19. Singh, R., et al. Cell specificity of magnetic cell seeding approach to hydrogel colonization. Journal of Biomedical Materials Research: Part A. 105 (11), 2948-2957 (2017).
  20. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 121223(2021).
  21. Xuan, K., et al. Deciduous autologous tooth stem cells regenerate dental pulp after implantation into injured teeth. Science Translational Medicine. 10 (455), (2018).
  22. Sui, B. D., et al. Stem cell-based bone regeneration in diseased microenvironments: Challenges and solutions. Biomaterials. 196, 18-30 (2019).
  23. Shang, F., et al. Human umbilical cord MSCs as new cell sources for promoting periodontal regeneration in inflammatory periodontal defect. Theranostics. 7 (18), 4370-4382 (2017).
  24. Arnold, A. M., Holt, B. D., Daneshmandi, L., Laurencin, C. T., Sydlik, S. A. Phosphate graphene as an intrinsically osteoinductive scaffold for stem cell-driven bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (11), 4855-4860 (2019).
  25. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), e13074(2021).
  26. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy. 30 (10), 3193-3208 (2022).
  27. Vogel, V. Unraveling the mechanobiology of extracellular matrix. Annual Review of Physiology. 80, 353-387 (2018).
  28. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nature Materials. 9 (6), 518-526 (2010).
  29. Shuai, Y., et al. Melatonin treatment improves mesenchymal stem cells therapy by preserving stemness during long-term in vitro expansion. Theranostics. 6 (11), 1899-1917 (2016).
  30. Sui, B. D., Zhu, B., Hu, C. H., Zhao, P., Jin, Y. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods in Molecular Biology. 2002, 87-99 (2019).
  31. Wei, F., et al. Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity. Journal of Cellular Physiology. 227 (9), 3216-3224 (2012).
  32. de Clerck, Y. A., Jones, P. A. The effect of ascorbic acid on the nature and production of collagen and elastin by rat smooth-muscle cells. The Biochemical Journal. 186 (1), 217-225 (1980).
  33. Fujisawa, K., et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 93(2018).
  34. Wang, T., et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner. Cell Stem Cell. 9 (6), 575-587 (2011).
  35. Sun, J., et al. Osthole improves function of periodontitis periodontal ligament stem cells via epigenetic modification in cell sheets engineering. Scientific Reports. 7 (1), 5254(2017).
  36. Wang, Y. J., et al. Resveratrol enhances the functionality and improves the regeneration of mesenchymal stem cell aggregates. Experimental and Molecular. 50 (6), 1-15 (2018).
  37. Shang, F., et al. The effect of licochalcone A on cell-aggregates ECM secretion and osteogenic differentiation during bone formation in metaphyseal defects in ovariectomized rats. Biomaterials. 35 (9), 2789-2797 (2014).
  38. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. Scaffold-free prevascularized microtissue spheroids for pulp regeneration. Journal of Dental Research. 93 (12), 1296-1303 (2014).
  39. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. In vitro analysis of scaffold-free prevascularized microtissue spheroids containing human dental pulp cells and endothelial cells. Journal of Endodontics. 41 (5), 663-670 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenchymal Stem CellsSelf Assembled AggregatesTissue EngineeringRegenerative MedicineCell EngraftmentExtracellular MatrixCell Cell InteractionsUmbilical Cord MSCsCranial Bone Regeneration
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen