Methodenartikel

Analyse en beeldvorming van osteocyten

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64699

⸱

29 november 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Engineering, University of Missouri-Kansas City, 2Department of Oral and Craniofacial Sciences, School of Dentistry, University of Missouri-Kansas City

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie schetst de methode om driedimensionale (3D) modellen van osteocyten binnen het lacunair-canaliculaire netwerk (LCN) te visualiseren en te ontwikkelen voor computationele vloeistofdynamica (CFD) analyse. De gegenereerde modellen met behulp van deze methode helpen om osteocyt-mechanosensatie in gezonde of zieke botten te begrijpen.

Samenvatting

Osteocyten zijn de botcellen waarvan wordt aangenomen dat ze reageren op mechanische spanningen en vloeistofstroomschuifspanning (FFSS) door verschillende biologische routes te activeren in een proces dat bekend staat als mechanotransductie. Confocale beeldafgeleide modellen van osteocytennetwerken zijn een waardevol hulpmiddel voor het uitvoeren van Computational Fluid Dynamics (CFD)-analyse om schuifspanningen op het osteocytenmembraan te evalueren, die niet kunnen worden bepaald door directe meting. Computationele modellering met behulp van deze beelden met hoge resolutie van de microstructurele architectuur van bot werd gebruikt om de mechanische belasting die op het bot wordt uitgeoefend numeriek te simuleren en de door belasting geïnduceerde stimulatie van osteocyten te begrijpen.

Deze studie gaat dieper in op de methoden om 3D-modellen voor enkelvoudige osteocyten te ontwikkelen met behulp van confocale microscoopbeelden van het Lacunar-Canalicular Network (LCN) om CFD-analyse uit te voeren met behulp van verschillende computationele modelleringssoftware. Voorafgaand aan confocale microscopie worden de botten van de muis doorgesneden en gekleurd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) kleurstof om de LCN te labelen. Met een resolutie van 100x worden Z-stack-beelden verzameld met behulp van een confocale microscoop en geïmporteerd in MIMICS-software (3D-beeldgebaseerde verwerkingssoftware) om een oppervlaktemodel te construeren van de LCN- en osteocyt-dendritische processen.

Deze oppervlakken worden vervolgens afgetrokken met behulp van een Booleaanse bewerking in 3-Matic-software (3D-gegevensoptimalisatiesoftware) om de lacunaire vloeistofruimte rond het osteocytcellichaam en de kanaalruimte rond de dendrieten die lacunocanaliculaire vloeistof bevatten, te modelleren. 3D volumetrische vloeistofgeometrie wordt geïmporteerd in ANSYS-software (simulatiesoftware) voor CFD-analyse. ANSYS CFX (CFD-software) wordt gebruikt om fysiologische belasting op het bot toe te passen als vloeistofdruk, en de wandschuifspanningen op de osteocyten en dendritische processen worden bepaald. De morfologie van de LCN beïnvloedt de schuifspanningswaarden die worden waargenomen door het celmembraan en de celprocessen van de osteocyt. Daarom kunnen de details van de ontwikkeling van confocale beeldgebaseerde modellen waardevol zijn voor het begrijpen van osteocytmechanosensatie en kunnen ze de basis leggen voor toekomstige studies op dit gebied.

Inleiding

Osteocyten worden verondersteld de botmassa te reguleren als reactie op lichamelijke inspanning1. Membraanvervorming van osteocyten en hun dendritische processen als gevolg van mechanische belasting, onderwerpt ze aan FFSS, die wordt gedetecteerd door de osteocyten en intracellulaire signalering activeert 2,3,4. De botmicrostructuur ondergaat verslechtering of veranderingen in de lacunair-canaliculaire morfologie als gevolg van veroudering of botziekten zoals osteoporose en diabetes en bij aandoeningen zoals perlecandeficiëntie die een verminderde mechano-respons van osteocyten veroorzaakt 5,6. Deze veranderingen in de botarchitectuur zorgen ervoor dat osteocyten verschillende niveaus van FFSS en stammen ervaren 7,8. Belangrijk is dat FFSS die osteocyten ervaren als reactie op mechanische belasting in vivo moeilijk te kwantificeren is omdat ze zijn ingebed in de verkalkte botmatrix.

Confocale beeldgebaseerde modellering is een krachtige techniek om de beperkingen van het bestuderen van ontoegankelijke osteocyten in hun natuurlijke omgeving te overwinnen door computermodellen van de LCN 9,10 te repliceren. Het verwerken en modelleren van het onderling verbonden netwerk van LCN in 3D was een uitdaging. Er zijn verschillende beeldvormingstechnieken, zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), scanning-elektronenmicroscopie (SEM), seriële blokvlaksecties en seriële gefocusseerde ionenbundelscanning-elektronenmicroscopie (FIB/SEM)2,11,12. Er werd een waardevolle techniek ontwikkeld om bot 13,14,15 te visualiseren en 3D-osteocytenmodellen te genereren via confocale laserscanningmicroscopie (CLSM). CLSM werd hier gekozen voor computationele modellering in plaats van andere beeldvormingstechnieken vanwege het vermogen om het hele lacunevolume en het grootste deel van de canaliculi in 3D16,17 in beeld te brengen. De LCN-geometrie kan worden gegenereerd met behulp van CLSM voor osteocyte Finite Element Analysis (FEA) om botspanningen te voorspellen. Vloeistofanalyse om FFSS te voorspellen die door osteocyten wordt ervaren, is echter ingewikkelder omdat het modellering van het celmembraan van de osteocyt en zijn dendrieten binnen de LCN vereist om modellering mogelijk te maken van de smalle lacunair-canaliculaire ruimte, waarin de interstitiële vloeistof rond18 beweegt.

In dit protocol wordt fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) kleurstof aangebracht op niet-ontkalkte dikke botsecties vóór confocale microscopie om de LCN in het bot te labelen, en osteocyt-dendritische membranen worden gemodelleerd op basis van beeldvormingsgegevens van de LCN. De lacunair-canaliculaire ruimte wordt gesimuleerd met behulp van computationele modellering en fysiologische belasting als gevolg van fysieke activiteit wordt gemodelleerd met behulp van een CFD-benadering. De osteocyten worden onderworpen aan een vloeistofdrukgradiënt in de CFD-software om het vloeistofprofiel in de LCN te analyseren en FFSS op de osteocyt en dendritische membranen te meten. Bovendien kan een FEA-benadering osteocytenspanningen of -spanningen meten door mechanische drukbelasting toe te passen.

Er werd ook een techniek voor het wijzigen van de geometrie ontwikkeld om de microstructuren te wijzigen die zijn afgeleid van afbeeldingen van jong, gezond bot om de veranderde lacunair-canaliculaire morfologie te simuleren bij oudere dieren of dieren met botziekte. Veranderingen van de botmicrostructuur omvatten het verminderen van het aantal canaliculi bij veroudering, het verkleinen van het lacunair-canaliculaire ruimtegebied om te modelleren wat er gebeurt bij perlecan-deficiëntie en het vergroten ervan om verouderingseffecten te modelleren, en het verkleinen van het canaliculaire en dendritische wandgebied om diabetisch bot te modelleren 5,6. De geometriemodificatietechniek stelt ons in staat om FFSS te vergelijken die wordt ervaren door osteocyten in bot met verschillende microstructuren, zoals jong versus oud of botten bij gezonde versus zieke dieren.

Over het algemeen is confocale beeldgebaseerde modellering een waardevol hulpmiddel voor het simuleren van de morfologie van osteocyten in gezond bot, evenals bij verouderings-/ziektegerelateerde veranderingen in de morfologie van osteocyten. Bovendien kunnen morfologische parameters van osteocyten, zoals het oppervlak en het volume van de lacunair-canaliculaire ruimte, worden gemeten en vergeleken in verschillende botten om cellulaire reacties op mechanische belasting te voorspellen.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Missouri, Kansas City (UMKC), en in overeenstemming met de relevante federale richtlijnen.

1. Bot voorbereidingsproces

  1. Verzamel dijbenen van 4 maanden oude en 22 maanden oude vrouwelijke C57BL6-muizen en fixeer ze gedurende 24 uur bij 4 °C met zacht schommelen in koud 4% paraformaldehyde in PBS, spoel ze vervolgens af in PBS en bewaar ze in 70% ethanol voordat ze worden ingebed.
    OPMERKING: Het fixatievolume moet ongeveer 20x het weefselvolume zijn
  2. Veranker botten snel in een snel polymeriserend acryl (Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Het is belangrijk om voor deze stap een snelle polymeriserende hars te gebruiken (~10 min). Het doel is om het botweefsel te ondersteunen tijdens het doorsnijden met behulp van de diamantzaag, maar zonder dat de hars in de LCN doordringt, waardoor de FITC-vlek niet zou doordringen.
  3. Snijd met een diamantzaag dikke dwarsplakken van 300 μm dik op een gestandaardiseerde plaats boven de derde trochanter en bewaar ze bij 4 °C in 70% ethanol vóór de FITC-kleuring.
  4. Polijst de secties met schuurpapier met korrel 600, 800 en vervolgens 1200 tot een uiteindelijke dikte van ~90-100 μm.
    OPMERKING: Het bereiken van de juiste dikte werd gegarandeerd met behulp van een digitale schuifmaat.
  5. Spoel de secties elk 5 minuten in 70%, 95% en 100% ethanol.
  6. Beits ze in 1% FITC in 100% ethanol gedurende 4 uur bij kamertemperatuur (RT) in het donker met matig schudden.
  7. Was de secties 30 minuten in 100% ethanol en schud ze zachtjes in het donker. Laat ze vervolgens een nacht in het donker aan de lucht drogen.
  8. Om te monteren, plaatst u het gedeelte in een druppel montagemedia op een glazen microscoopglaasje. Gebruik een tang om het gedeelte zo plat mogelijk tegen het objectglaasje te plaatsen, vermijd het genereren van luchtbellen en gebruik de omringende hars om het monster te manipuleren. Monteer een dekglaasje op het preparaat.

2. Confocale microscopie

  1. Gebruik een confocale microscoop voor beeldvorming van met FITC bevlekte botplakjes.
  2. Gebruik een 100x 1.44NA olieobjectief met een digitale zoom van 1.7 en een stapgrootte van 0.126 μm om gedetailleerde Z-stacks van 400 Z-vlakken te verzamelen met 1024 x 1024 pixels, 0.089 μm pixelresolutie.
  3. Gebruik een laser van 488 nm voor excitatie, met een emissieverzamelvenster van 496-596 nm. Verzamel de beeldstapels met behulp van compensatie-instellingen om signaalverlies te corrigeren met toenemende beelddiepte.
  4. Verhoog de nauwkeurigheid en resolutie van de afbeeldingen door gebruik te maken van technieken voor het verzamelen van afbeeldingen, zoals oversampling en verhoogde lijngemiddelde. Verzamel ook de afbeeldingen met een vergroting van 5x, 20x en 100x resolutie van dwarsdoorsneden van dijbeensecties, zoals weergegeven in figuur 1.
    OPMERKING: Het beeld met lage resolutie (5x) in figuur 1 toont de volledige doorsnede van het dijbeen, met drie regio's geselecteerd voor 100x beeldvormingsvelden.
  5. Gebruik de 100x Z-stacks voor de computermodellering van osteocyten.

3. Computermodellering

  1. Importeer de verzamelde 100x beelden, in TIFF formaat, naar de ImageJ software om een reeks beelden van de LCN in de Z-richting op te bouwen.
  2. Importeer de Z-stacks in de 3D-beeldgebaseerde verwerkingssoftware om een masker van de LCN te maken na het definiëren van de beeldrichting.
  3. Drempel het originele beeld van de jonge en oude muizen tussen respectievelijk 30.012-45.677 Hounsfield-eenheden en 15.000-46.701 Hounsfield-eenheden om sterk op de LCN te lijken. Pas de drempel in het sectiemenu aan om de limieten voor pixelintensiteit te wijzigen voor opname in een masker.
  4. Snijd één lacune met zijn canaliculi als het interessegebied (ROI) bij van de stapel met behulp van de bewerking Bijsnijdmasker . Definieer de ROI zo dat deze de lacune in het midden van de kubus omcirkelt en dat alle verbonden canaliculi zich uitstrekken tot aan de zijkanten van de kubus. Verhul de lacune in een denkbeeldige grotere kubus met zijlengtes van 21 μm, 14 μm en 19 μm.
  5. Aangezien het model uit meerdere onderdelen bestaat, voert u een bewerking uit om de verbonden pixelgebieden te selecteren, ruis te verwijderen en te ontspikkelen om een uniforme LCN te genereren.
  6. Zet het lacunair-canaliculaire masker om in een object met behulp van de bewerking Berekend onderdeel in de verwerkingssoftware op basis van 3D-beelden.
  7. Bouw de osteocyt- en dendritische membranen op door het LCN-volume te verminderen met behulp van de afvlakkingsoperatie. Voer deze handeling meerdere keren uit om een lacunaire en canaliculaire ruimtedikte van respectievelijk 0,75 μm en 0,08 μm 9,18 te bereiken.
  8. Exporteer de objecten (STL-formaat) als laatste stap in de op 3D-beelden gebaseerde verwerkingssoftware.
  9. Importeer twee lagen van de LCN- en osteocyt-dendritische membranen in de 3D-gegevensoptimalisatiesoftware om een volumemesh te genereren.
  10. Gebruik de Fix Wizard-tool in de software om mesh-problemen in elk onderdeel te identificeren. Controleer de mesh-kwaliteit in het diagnostische gedeelte van de wizard Repareren na elke bewerking.
  11. Verwijder de omgekeerde normale delen, kruisende driehoeken en slechte contouren met behulp van de bewerking Automatisch herstellen in de wizard Repareren.
  12. Vervang de overlappende driehoeken handmatig door nieuwe te definiëren of automatisch via de normale functie Vulgat .
  13. Verbeter de gaaskwaliteit met behulp van bewerkingen zoals het filteren van scherpe driehoeken, kleine randen en kleine schelpen.
  14. Na het verbeteren van de gaaskwaliteit, combineert u twee oppervlakken van de LCN- en osteocyt-dendritische membranen tot één oppervlak (lacunair-canaliculaire fluïdische ruimte) dat tot beide delen behoort met behulp van een niet-spruitstukassemblage.
  15. Maak een volumetrisch model van de lacunair-canaliculaire ruimte met behulp van de bewerking Remesh en exporteer het vervolgens als een STL-bestand. Pas de objectschaal aan zodat deze in micrometers is in het exportgedeelte.

4. Geometrie-modificatietechniek in de 3D-beeldgebaseerde verwerkingssoftware en 3D-gegevensoptimalisatiesoftware

OPMERKING: De geometriemodificatietechniek wordt gebruikt om veranderingen in de morfologie van osteocyten te modelleren, zoals canaliculaire dichtheid en diameter en lacunair-canaliculaire dikte als gevolg van veroudering of botziekte.

  1. Kies de jonge osteocyt als basismodel en pas het aan om andere afzonderlijke osteocytmodellen te bouwen door morfologische veranderingen toe te passen.
  2. Genereer een osteocytenmodel met andere canaliculaire dichtheden dan het basismodel door de beelddrempel in de op 3D-beelden gebaseerde verwerkingssoftware te wijzigen.
    1. Selecteer een lagere drempel om de lichtintensiteit van het beeld te verminderen en een lacune met minder canaliculi te verkrijgen. Het voordeel van de drempeltechniek is dat de vorm en grootte van de lacune hetzelfde blijven en dat alleen de invloed van de kanaaldichtheid wordt bestudeerd. Figuur 2 toont het gesimuleerde verouderingsmodel dat is gegenereerd uit de jonge osteocyt met behulp van de geometriemodificatietechniek.
  3. Ontwikkel osteocytmodellen met verschillende lacunaire-canaliculaire ruimtediktes of dendriet/canaliculaire diameters in de 3D-beeldgebaseerde verwerkingssoftware en 3D-gegevensoptimalisatiesoftware. Bouw grotere of kleinere osteocytenmodellen door respectievelijk inpak - of gladstrijkoperaties . Figuur 3 toont zes osteocytmodellen met een veranderde geometrie ontwikkeld uit de jonge osteocyt.

5. CFD-analyse

OPMERKING: Na het genereren van de volumetrische osteocytmodellen worden verschillende stappen, waaronder geometrie, mesh en setup, uitgevoerd in de CFX-module van de simulatiesoftware.

  1. Creëer een Fluid Flow in de simulatiesoftware om de modellen voor te bereiden op de CFD-analyse.
  2. Importeer de ontwikkelde confocale beeldgebaseerde geometrieën in de geometriesectie van CFX, bekend als ANSYS SpaceClaim (3D-modelleringstool). Stel de afmetingen van de eenheid in op nanometer in de instelling.
  3. Geometrie verschijnt als twee facetten van de LCN- en osteocyt-dendritische processen. Klik op Facet in het bovenste menu en verwijder de geometrische fouten zoals snijpunten, scherpe of oververbonden randen en hoekpunten, openingen of gaten voor elk facet.
  4. Klik op Aftrekken in het menu Facet om de kleinere facet- en osteocyt-dendritische processen te verminderen van het grotere facet, de LCN, om een enkel lichaam van lacunair-canaliculaire ruimte te bereiken. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op het gegenereerde facet en converteer het van facetten naar een solide domein zonder gezichten samen te voegen. Figuur 4 toont de dwarsdoorsnede van het jonge osteocytmodel, dat de lacunair-canaliculaire ruimte weergeeft.
  5. Klik op mesh en selecteer lineaire tetraëdrische elementen met een elementgrootte van 0,06 μm. Verfijn het gaas met een gaasconvergentieonderzoek om voldoende elementen in het kleine dendritische systeem te hebben om ervoor te zorgen dat de resultaten onafhankelijk zijn van de maaswijdte.
  6. Selecteer het oppervlak en kies de canaliculi aan de bovenzijde van de denkbeeldige kubus als vloeistofinlaten. Selecteer de canaliculi op de andere vijf vlakken als vloeistofuitlaten met behulp van Box select.
  7. Exporteer de mesh (vloeiende bestandsindeling) omdat deze sneller laadt in de installatie in de volgende stap.
  8. Maak een andere vloeistofstroom in de simulatiesoftware en importeer de vloeiende mesh in het installatiegedeelte van CFX. Definieer twee randvoorwaarden van inlaten en uitlaten voor de vlakken die vooraf zijn geselecteerd als inlaten/uitlaten met behulp van de optie Grens invoegen .
  9. Om fysiologische omstandigheden na te bootsen, oefent u een vloeistofinlaatdruk uit van respectievelijk 300 Pa en 0 Pa op de inlaten en uitlaten,19,20. Behandel de overige oppervlakken als muren met een antislip toestand in die vloeistof die een snelheid van nul heeft op het grensvlak van muren. Vloeistof stroomt uit de inlaten rond de dendrieten en het osteocytcellichaam en verlaat de andere canaliculi die als uitlaten zijn aangewezen.
  10. Behandel de interstitiële laminaire vloeistof als water9, gekozen uit de materiaalbibliotheek. Stel de secties Warmteoverdracht, Verbranding en Thermische straling in op Geen, aangezien er geen warmteoverdracht is gedefinieerd in het probleem. Selecteer de turbulentiemodus als de vloeistofkarakteristiek in de LCN, een laminaire vloeistof9.
  11. Voer de software uit met Double Precision en Direct Start als het inzendingstype. Bewaak massa en momentum totdat de residuen dalen en constant worden. Meet na de convergentie van de oplossing FFSS-gegevens met behulp van de CFD-post-sectie van de CFD-software.

6. CFD nabewerking

  1. Om FFSS weer te geven die osteocyten en hun dendrieten ervaren, voegt u een nieuwe contour in het resultatengedeelte van de CFD-software in. Creëer een FFSS-contour door de wandafschuiving op de osteocyt-dendritische membranen te kiezen als variabele op het domein.
    OPMERKING: Om hoge FFSS beter weer te geven op dendritische membranen, is het bereik van FFSS ingesteld op Door de gebruiker gespecificeerd om de min/max-waarden van FFSS te wijzigen.
  2. Plaats een snelheid stroomlijnt de contour in het lacunaire-canaliculaire domein, beginnend bij de inlaten. Stel de steekproef in op gelijke afstand van elkaar en selecteer het aantal punten als 2500. Een animatiesectie in de CFD-software geeft nauwkeurig in 3D weer hoe de vloeistofdeeltjes in de lacunair-canaliculaire ruimtes stromen met behulp van de snelheidsstroomlijngrafiek.
  3. Gebruik de functiecalculator in de CFD-software voor het analyseren van de grootte van FFSS of snelheid op basis van geometrische parameters, vooral wanneer er verschillende osteocytenmodellen zijn (d.w.z. jong versus oud). Meet het volume en de oppervlakte van de lacunair-canaliculaire ruimte als geometrische parameters samen met maximale, minimale of gemiddelde FFSS-waarden.

Resultaten

Dit protocol beschrijft hoe confocale osteocytmodellen kunnen worden ontwikkeld om de hoeveelheid vloeistofstroomschuifspanning te onderzoeken waaraan een osteocyt en zijn dendritische processen worden blootgesteld als gevolg van mechanische belasting. Een oude en een jonge C57BL6-muis werden geselecteerd om jonge en oude confocale beeldgebaseerde osteocytenmodellen te bouwen. Zes andere gesimuleerde osteocytmodellen werden gegenereerd op basis van hetzelfde jonge osteocytmodel met behulp van de geometriemodificatietechniek om de verandering van de LCN-morfologie als gevolg van veroudering of botziekte te bestuderen. Geometrie-gemodificeerde parameters omvatten de lacunair-canaliculaire dikte, canaliculaire dichtheid en diameter. Gemodificeerde osteocytmodellen werden ontwikkeld door één parameter tegelijk te wijzigen terwijl de andere parameters hetzelfde bleven. Daarom wordt het effect van elk van de morfologische parameters op FFSS afzonderlijk onderzocht. De resultaten toonden aan dat de hoeveelheid FFSS die door een osteocyt werd ervaren anders was in deze osteocytenmodellen, wat de afhankelijkheid van FFSS van LCN-morfologie aantoont. FFSS-waarden werden voorspeld op verschillende delen van het osteocytenmodel, zoals het osteocytcellichaam of dendritische membranen. Dendrieten in alle modellen ervoeren hogere FFSS-waarden dan het lichaamsmembraan van de osteocytcel.

Figuur 5 toont de FFSS-contouren voor jonge vs. oude osteocytmodellen die rechtstreeks zijn gegenereerd uit confocale FITC-beeldstapels en zes andere osteocytmodellen die zijn ontwikkeld op basis van model 1 met behulp van de geometriemodificatietechniek. De gemiddelde FFSS op osteocyten en dendritische membranen in het jonge osteocytenmodel (Model 1) was 0,42 Pa, wat significanter is dan de gemiddelde FFSS van 0,13 Pa in het verouderde osteocytenmodel (Model 2). De verkregen gegevens tonen een toename van de gemiddelde FFSS in osteocyten met een grotere lacunair-canaliculaire ruimte (Model 7 en Model 8) en een afname van FFSS in osteocyten met een lagere canaliculaire dichtheid (Model 3 en Model 4), terwijl FFSS niet significant veranderde met veranderende dendrietdiameter in Model 5 en Model 6. Model 2 en Model 4 hadden de laagste FFSS-waarden van respectievelijk 0,19 Pa en 0,13 Pa. De omvang van FFSS in Model 8 is groter dan in de andere osteocytenmodellen. Niet alleen zijn de meeste dendrieten in rode kleur in Model 8, maar het osteocytcellichaam ervaart ook een hogere FFSS dan in andere modellen.

FFSS ervaren door osteocyten werd ook gepresenteerd op basis van het lacunair-canaliculaire ruimtevolume en het oppervlak, die werden verkregen door nabewerking in ANSYS CFX om de correlatie tussen FFSS en de veranderde structuur van de LCN te achterhalen. Het was ook mogelijk om het oppervlak van elk model dat werd blootgesteld aan FFSS groter dan 0,8 Pa te meten, waarvan wordt aangenomen dat dit het niveau van FFSS is dat botvorming veroorzaakt21,22. De osteocytenmodellering toonde een correlatie tussen de gemiddelde FFSS en het lacunair-canaliculaire ruimtevolume of oppervlak voor alle osteocytenmodellen, zoals weergegeven in Tabel 1. De gerijpte osteocyt (Model 2) en de gesimuleerde osteocyt van middelbare leeftijd (Model 4) met de laagste canaliculaire dichtheid hadden het laagste lacunair-canaliculaire oppervlak van 1372,7μm2 en 1122,6 μm2. Model 2 en Model 4 hadden ook het laagste lacunair-canaliculaire ruimtevolume van respectievelijk 229,4 μm3 en 203,5 μm3, wat kan worden gecorreleerd met hun lage hoeveelheden FFSS. Model 6, met de grootste dendrietdiameter, had het grootste lacunair-canaliculaire oppervlak. Model 8 had het grootste lacunair-canaliculaire ruimtevolume en de grootste FFSS-waarden.

figure-results-1
Figuur 1: Confocale beelden van een enkel Z-vlak van een dwarsdoorsnede van een met FITC gekleurd dijbeen, gemaakt met 5x, 20x en 100x olieobjectieven. Het lacunaire-canaliculaire netwerk is zichtbaar op de foto die is gemaakt met het 100x-objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Confocale beeldgebaseerde modellen van een jonge (Model 1) en een oude (Model 2) osteocyt gegenereerd uit het met FITC bevlekte dijbeen van een 4 maanden oude en 22 maanden oude C57BL6-muis. Het vergrote beeld toont de lacunair-canaliculaire (LC) dikte voor jonge osteocyten en hetzelfde voor de oude osteocyt. De afbeelding van model 1 is gewijzigd met toestemming van Niroobakhsh et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Zes osteocytenmodellen ontwikkeld op basis van model 1 met behulp van de geometriemodificatietechniek. De canaliculaire dichtheid werd verminderd om Model 3 (gesimuleerd van middelbare leeftijd) en Model 4 (gesimuleerd verouderd) te genereren, terwijl de dendrietdiameter en LC-dikte hetzelfde waren als in Model 1. Model 5 en Model 6 werden ontwikkeld met dezelfde canaliculaire dichtheid en LC-dikte als Model 1, terwijl hun dendrietdiameter twee en vier keer groter was dan die van Model 1. Model 7 en Model 8 hadden respectievelijk twee keer en vier keer meer lacunair-canaliculaire dikte, terwijl de kanaaldichtheid en dendrietdiameter hetzelfde bleven als in Model 1. De afbeelding van model 1 is gewijzigd met toestemming van Niroobakhsh et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: 3D-weergave confocaal beeldgebaseerd model voor jonge osteocyten. 3D-weergave van de dwarsdoorsnede van het confocale beeldgebaseerde model voor jonge osteocyten die de modellering van de lacunair-canaliculaire ruimte weergeven, die wordt gebruikt voor vloeistofanalyse rond de osteocyt en dendrieten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: FFSS-verdeling voor alle osteocytenmodellen toont de afhankelijkheid van de FFSS-grootte van de osteocytmorfologie. Rode gebieden vertonen de hoogste FFSS-waarden, vooral op de dendritische membranen in plaats van op het osteocytcellichaam. Deze afbeelding is aangepast met toestemming van Niroobakhsh et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ModellenLacunair-canaliculair oppervlak (μm2)Lacunair-canaliculair ruimtevolume (μm3)Ave FFSS (Pa)
Confocale beeldgebaseerde osteocytenmodellenModel 12652.92610.42
Jong (4 maanden oud)
Model 21372.7229.40.19
Oud (22 maanden oud)
Gesimuleerde osteocytmodellen gegenereerd met behulp van geometriemodificatietechniekModel 31530.4242.60.27
(Gesimuleerde middelbare leeftijd)
Model 41122.6203.50.13
(Gesimuleerde leeftijd)
Model 53724.9302.90.49
(2 x dendriet diameter)
Model 647913370.57
(4 x dendriet diameter)
Model 73116.3440.61.17
(2 x LC dikte)
Model 83542.2658.21.89
(4 x LC dikte)

Tabel 1: Vergelijking van osteocytenmodellen. Vergelijking van de gemiddelde FFSS, het lacunair-canaliculaire ruimtevolume en het oppervlak in acht verschillende osteocytmodellen, waaronder twee confocale beeldgebaseerde modellen en zes gesimuleerde modellen gegenereerd op basis van model 1 met behulp van de geometriemodificatietechniek.

Discussie

Dit protocol schetst een confocale beeldvormingstechniek voor visualisatie en computationele modellering van de osteocyten. Vóór confocale beeldvorming wordt het botvoorbereidingsproces voor het doorsnijden en kleuren van botmonsters uitgevoerd. Confocale beelden met een vergroting van 100x worden geïmporteerd in verschillende software om computermodellen van osteocyten en de lacunair-canaliculaire ruimte te ontwikkelen. Ten slotte wordt een CFD-analyse uitgevoerd op de confocale beeldgebaseerde modellen om FFSS rond de osteocyten en dendritische membranen te modelleren als gevolg van fysieke activiteit, wat in vivo technisch uitdagend is vanwege de ontoegankelijkheid van osteocyten in de botmatrix. Het meegeleverde protocol is ook nuttig bij het bepalen van andere spanningen of spanningen met behulp van een eindige-elementen- of vloeistof-structuurinteractie (FSI)-benadering in multifysische modellering.

Confocale beeldvorming is gebruikt om de LCN 7,9,24,25 te visualiseren dankzij de beelden met hoge resolutie die kunnen worden bereikt met behulp van FITC-kleuring van het bot. Hoewel de diameter van de canaliculi dicht bij de resolutielimiet van de microscoop ligt, kunnen betrouwbare confocale beelden van de canaliculi worden verkregen, die het grootste deel van de canaliculi kunnen vastleggen. Vanwege de kleinere diameter van de osteocytendendrieten is het technisch uitdagender om nauwkeurig beelden van de dendrieten vast te leggen. Daarom werd een nuttige techniek ontwikkeld om de osteocyt en dendrieten te modelleren op basis van confocale beelden van de LCN door hun volume te verminderen met behulp van een afvlakkingsbewerking in de software. Sommige andere gepubliceerde studies gebruikten een vergelijkbare benadering om de LCN te compenseren om het osteocyt-dendritische membraante genereren 9. Het andere voordeel van de afvlakkingstechniek is het verbeteren van sommige beeldvormingsfouten in CLSM, zoals de verlenging van de kanaaldiameter die optreedt in de Z-as als gevolg van de lagere beeldresolutie in de Z-as, wat een kenmerk is van optische beeldvorming. Deconvolutie wordt ook beschouwd als een alternatieve methode om de optische rek in de Z-richting te verminderen, omdat het de signaal-ruisverhouding in de originele dataset verbetert. De lacunair-canaliculaire ruimte wordt gemodelleerd op basis van LCN- en osteocyt-dendritische membranen om het vloeistofprofiel in de LCN te analyseren.

Er werd met name een nieuwe techniek geïntroduceerd met betrekking tot bestaande methoden om geometrie-gemodificeerde osteocytmodellen te ontwikkelen zonder nog een muis op te offeren. De geometriemodificatietechniek helpt ook om de verandering van de botmicrostructuur te simuleren als gevolg van veroudering of botziekten zoals osteoporose, diabetes en aandoeningen zoals perlecandeficiëntie, enz. In deze techniek werd een confocaal beeldgebaseerd osteocytenmodel van een jonge muis gebruikt om de morfologie van oude of andere botzieke osteocyten te modelleren door parameters zoals canaliculaire dichtheid, lacunair-canaliculaire ruimte en dendrietdiameter te wijzigen. Deze benadering werd gevalideerd door de gelijkenis van de twee verouderde osteocytmodellen, de ene van confocale beeldgebaseerde modellering van een echte osteocyt van een 22 maanden oude muis en de andere van geometriemodificatiemodellering van een osteocyt die oorspronkelijk was afgebeeld van een 4 maanden oude muis door de canaliculaire dichtheid te verminderen. Deze twee verouderde osteocytenmodellen vertoonden een vergelijkbare FFSS-omvang, wat de laagste was van alle osteocytenmodellen. De techniek voor het wijzigen van de geometrie zou vele toepassingen kunnen hebben in verschillende biologische gebieden, omdat het vergelijkbare resultaten kan voorspellen als osteocytenmodellen die zijn gegenereerd met behulp van echte osteocyten van een dier. Enkele van de beperkingen van dit werk zijn het verlies van een deel van de details van de oppervlakteruwheid als gevolg van de afvlakkingstechniek en het feit dat de kanaaldiameters zich op de resolutielimiet van de confocale microscopen bevinden, wat mogelijk zou kunnen leiden tot enige onnauwkeurigheid voor canaliculi met kleinere diameters, en ook idealisering van de vloeistofstroom in plaats van modellering met behulp van oscillerende stroming.

Om de functionaliteit van de techniek aan te tonen, werden osteocyten FFSS-waarden gemeten voor verschillende osteocytmodellen die waren gegenereerd van een jonge en een oude muis of met behulp van de geometriemodificatietechniek. Een van de opmerkelijke bevindingen met behulp van deze computermodellen was dat het volume van de lacunair-canaliculaire ruimte recht evenredig is met de gemiddelde FFSS die door de osteocyten wordt ervaren. Deze nieuwe bevinding, die nog niet eerder was onderzocht, kan verschillende toepassingen hebben bij het bepalen van de mechanische-responsiviteit van osteocyten, aangezien het de morfologie van het osteocytennetwerk kan correleren met gedetecteerde FFSS door de osteocyten en hun processen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de National Science Foundation (NSF, toekenningsnummer NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh), National Institute of Health (NIH - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) en (NIH/SIG S10OD021665 en S10RR027668 PI: SL Dallas) erkennen, en het Research Grant Program van de University of Missouri-Kansas City School of Graduate Studies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,200 Grit schuurpapierBuehler30-5170-012-100
3-Matic softwareMaterialisehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic3D data optimalisatie software
600 grit schuurpapierBuehler30-5118-600-100
800 Grit schuurpapierBuehler30-5170-800-100
ANSYS softwareANSYShttps://www.ansys.com/simulatie software
Fluoresceïne Isothiocyanaat (FITC)Sigma-AldrichF7250
ImageJ softwarehttps://imagej.net/ij/
Immersiol voor microscopenLeica Microsystems195371-10-9
Leica TCS Sp5 II confocale microscoop Leica MicrosystemsTCS Sp5 II 
Leitz 1600 innerlijk gat diamantzaagLeica 
MIMICS Innovation Suite softwareMaterialisehttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite3D beeldgebaseerde verwerkingssoftware
Permount montagemediumFisher scientificSP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acryl KitBuehler20-3560
Single Platform Laboratory ShakerReliable scientific INCModel 55S

Referenties

  1. Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
  2. Fritton, S. P., Weinbaum, S. Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction. Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).
  3. Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton. Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).
  4. Knothe Tate, M. L. "Whither flows the fluid in bone?" An osteocyte's perspective. J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).
  5. Tiede-Lewis, L. M., et al. Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging. Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).
  6. Lai, X., et al. The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease. Bone Res. 3 (1), 15009(2015).
  7. Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118(2021).
  8. van Tol, A. F., et al. The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).
  9. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach. Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).
  10. Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system. Bone. 137, 115328(2020).
  11. Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49 (2), 304-311 (2011).
  12. Kamioka, H., et al. A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography. Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).
  13. Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy. Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).
  14. Sharma, D., et al. Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency. Bone. 51 (3), 488-497 (2012).
  15. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes. J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).
  16. Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease. Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).
  17. Kamioka, H., et al. Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model. Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).
  18. Wang, L., et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).
  19. Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading. J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).
  20. Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone. J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).
  21. You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).
  22. Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).
  23. Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging. Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).
  24. Dallas, S. L., Moore, D. S. Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network. Bone. 138, 115463(2020).
  25. Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. Vital confocal microscopy in bone. Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Osteocytbeeldvormingconfocale microscopievloeistofstroomschaarcomputationele vloeistofdynamicalacunair canaliculaire netwerkosteocyt mechanotransductie3D osteocytmodellendendritische membranenbeeldgebaseerde modelleringschuifspanningsanalyse

Gerelateerde artikelen