Methodenartikel

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

DOI:

10.3791/64700

⸱

23 december 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Skidmore College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glucaanfosfatasen behoren tot de grotere familie van dual specificity phosfatases (DSP) die glucaansubstraten defosforyleren, zoals glycogeen bij dieren en zetmeel in planten. De kristalstructuren van glucaanfosfatase met modelglucaansubstraten onthullen verschillende glucaanbindende interfaces gemaakt van DSP- en koolhydraatbindende domeinen. Kwantitatieve metingen van glucaan-glucaanfosfatase-interacties met fysiologisch relevante substraten zijn echter fundamenteel voor het biologische begrip van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen en de regulatie van het energiemetabolisme. Dit manuscript rapporteert een op Concanavaline A (ConA) gebaseerde in vitro sedimentatietest die is ontworpen om de substraatbindingsaffiniteit van glucaanfosfatasen tegen verschillende glucaansubstraten te detecteren. Als proof of concept werd de dissociatieconstante (KD) van glucaanfosfatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) en amylopectine bepaald. De karakterisering van SEX4-mutanten en andere leden van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen toont verder het nut van deze test aan om de differentiële binding van eiwit-koolhydraatinteracties te beoordelen. Deze gegevens tonen de geschiktheid van deze test aan om een breed scala aan zetmeel- en glycogeeninteragerende eiwitten te karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glucaanfosfatasen zijn leden van een functioneel diverse onderfamilie van duale specificiteitsfosfatasen (DSP's) binnen de eiwit tyrosinefosfatase (PTP) superfamilie1. Ze zijn gevonden in de meeste levensvormen, waaronder sterk uiteenlopende fotosynthetische organismen, mensen, gewervelde dieren en sommige ongewervelde dieren en protisten 2,3,4. Planten bevatten drie bekende glucaanfosfatasen: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) en Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Planten zonder glucaanfosfatasen vertonen een verminderde snelheid van tijdelijke zetmeelafbraak en ophoping van zetmeel in de bladeren 8,9. Laforin is de stichtende van de glucaanfosfatasefamilie die glycogeen defosforyleert bij gewervelde dieren en mensen 3,10. De mutaties van laforine resulteren in neurodegeneratieve ziekte van Lafora, een fatale autosomaal recessieve vorm van epilepsie11. Glucaanfosfatasen zijn nodig voor het glycogeen- en zetmeelmetabolisme en zijn naar voren gekomen als belangrijke enzymen voor het moduleren van het zetmeelgehalte in planten en de behandeling van neurodegeneratieve ziekte van Lafora12,13. Recente röntgenkristallografiestudies op glucaanfosfatasen met modelglucaansubstraten hebben licht geworpen op substraatbinding en het katalytische mechanisme van glucaandefosforylering14,15,16,17. Het huidige begrip van hoe glucaanfosfatasen binden aan hun fysiologische substraten is echter onvolledig.

Zetmeel is een onoplosbaar polymeer van glucose gemaakt van 80% -90% amylopectine en 10% -20% amylose18. De substraten voor plantaardige glucaanfosfatasen zijn gefosforyleerde koolhydraatmoleculen, zoals glycogeen- en zetmeelkorrels. De gefosforyleerde glucosylresiduen zijn aanwezig in een verhouding van 1:600 fosfaat:glucosylresidu. Interessant is dat de fosfaten alleen aanwezig zijn op de amylopectinemoleculen19. De belangrijkste plant glucaanfosfatase SEX4 werkt op de zetmeelkorrel om amylopectinemoleculen te defosforyleren. De röntgenkristalstructuur van SEX4 in combinatie met structuurgeleide mutagenesestudies heeft de unieke substraatspecificiteiten van SEX4 aangetoond voor verschillende posities binnen een glucaanstructuur15. We hebben onlangs aangetoond dat de biologisch relevante activiteit van SEX4 alleen kan worden waargenomen wanneer het inwerkt op de opgeloste amylopectinesubstraten20. Het begrijpen van glucaan-SEX4-interacties is echter moeilijk gebleken vanwege de structurele complexiteit van het substraat, bredere bindingsspecificaties en lage bindingsaffiniteiten tussen het eiwit en zijn substraten. Deze problemen hebben het vermogen belemmerd om methoden te gebruiken die vaak worden gebruikt in eiwit-ligandinteracties, zoals isothermische titratiecalorimetrie (ITC), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -gebaseerde assays.

Interessant is dat veel van ons begrip van koolhydraat-eiwitinteracties afkomstig is van het bestuderen van lectines. Concanavalin A (ConA) is een peulvrucht lectine familie van eiwitten oorspronkelijk geëxtraheerd uit de jack boon. ConA bindt koolhydraten met een hoge specificiteit, wat voordelig is voor het gebruik ervan in toepassingen voor het richten en afleveren van geneesmiddelen. De binding van ConA aan een verscheidenheid aan substraten die niet-reducerend α-D-mannosyl en α-D-glucosyl bevatten, is uitgebreid bestudeerd19,20. In de handel verkrijgbare ConA-gebonden Sepharose-kralen worden vaak gebruikt om glycoproteïnen en glycolipiden te zuiveren21. ConA bindt aan deze glucanen via C3-, C4- en C6-hydroxylgroepen van de glucoseresiduen. ConA-Sepharose kralen zijn ook met succes gebruikt om de binding van glycogeen-eiwit en zetmeel-eiwit interacties te meten22,23. In deze studie gebruikten we ConA-Sepharose-kralen om een bindingstest te ontwikkelen om de bindingsspecificiteiten van glucaanfosfatase-amylopectine-interacties te meten.

Eerder werd een op ConA gebaseerde sedimentatietest gebruikt om het bindingsvermogen van glucaanfosfatasesubstraat te beoordelen14,20,24. In deze studie werd dezelfde strategie gebruikt om een nieuwe methode te ontwikkelen om de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase en koolhydraatinteracties te bepalen. Deze methode heeft ook een voordeel voor het onderzoeken van verschillende opgeloste koolhydraat-eiwitinteracties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van ConA-Sepharose kralen

  1. Maak 250 ml van een bindingsbuffer met 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 en 0,2 mM CaCl2. Pas de pH aan met behulp van 1 M NaOH-oplossing.
  2. Pipetteer 250 μL ConA-Sepharose kraalsuspensie in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer de inhoud bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
    OPMERKING: 250 μL ConA-Sepharose-kralen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml is nodig voor elke amylopectineconcentratie die voor de test wordt gebruikt.
  3. Voeg 750 μL van de bindingsbuffer toe aan elke buis met 250 μL ConA-Sepharose kralen. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Verwijder het supernatant. Herhaal deze stap 2x om ervoor te zorgen dat de kralen op de juiste manier worden gewassen en in evenwicht worden gebracht met de bindbuffer.

2. Bereiding van amylopectine-oplossingen

  1. Maak een stamoplossing van 10 mg/ml aardappelamylopectine. Amylopectine is onoplosbaar in water en kan worden opgelost door warmte. Om op te lossen, voegt u 0,1 g aardappelamylopectine toe aan 10 ml gedestilleerd water. Verwarm de suspensie in een waterbad op 80 °C gedurende 1 uur of totdat de oplossing niet langer troebel is.
  2. Laat de oplossing terugkeren naar kamertemperatuur (RT), met herhaalde vortexing om klonteren te voorkomen.
  3. Alcohol-alkalische behandeling is een alternatieve methode om amylopectine substraten op te lossen. Volg de onderstaande stappen om met deze methode op te lossen.
    1. Suspensie 0,5 g amylopectinesubstraat in 5 ml 20% ethanol en 5 ml 2 M NaOH. Roer de inhoud krachtig gedurende 15-20 minuten bij RT.
    2. Voeg vervolgens 10 ml water toe en stel de pH van de oplossing in op 6,5 door 2 M HCl toe te voegen. Breng het volume van de resulterende oplossing met gedestilleerd water op 50 ml om een amylopectine-oplossing van 10 mg / ml te maken.
  4. Verdun de 10 mg/ml opgeloste amylopectineoplossing om een reeks van 2 ml verdunde amylopectine-oplossingen te maken. Voer bijvoorbeeld halve verdunningen van 10 mg / ml uit om een reeks amylopectineconcentraties te bereiden (5 mg / ml, 2, 5 mg / ml, 1, 25 mg / ml, 0, 625 mg / ml, 0, 3125 mg / ml, 0, 156 mg / ml, 0, 0, 078 mg / ml, 0, 039 mg / ml, 0, 0, 019 mg / ml en 0 mg / ml).

3. Bereiding van ConA-Sepharose: amylopectine kralen

  1. Voeg 250 μL van elke verdunde amylopectineoplossing toe aan microcentrifugebuizen van 1,5 ml die 250 μL ConA-Sepharose-kralen bevatten die vooraf in bindingsbuffer zijn uitgebalanceerd. Meng de inhoud goed door elkaar. Label de buisjes met de bijbehorende amylopectineconcentratie.
  2. Incubeer de inhoud op een draaiend wiel bij 4 °C gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Er is geen verandering in het ConA-Sepharose:amylopectine gebonden complex in de loop van de tijd na 20 min. De incubatietijd van 30 minuten werd gekozen door verschillende incubatietijden van 10 minuten tot 1 uur om ervoor te zorgen dat het evenwicht werd bereikt.
  3. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Verzamel het supernatant in een nieuw gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar deze bovennatuurlijke fracties om D-glucosetest12 uit te voeren (zure hydrolyse van amylopectine gevolgd door UV-bepaling van glucose via enzymatische assay). Deze stap is nodig om ervoor te zorgen dat alle amylopectine aan de kralen is gebonden.
  4. Voeg 750 μL bindingsbuffer toe aan de ConA-Sepharose:amylopectine kralen. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi het supernatant weg om eventuele ongebonden amylopectinemoleculen te verwijderen.
  5. Herhaal stap 3.4 om ervoor te zorgen dat u voldoende wordt gewassen. Elke buis bevat nu ConA-Sepharose kralen gebonden aan verschillende hoeveelheden amylopectine substraten.

4. Sex4 incuberen met ConA-Sepharose: amylopectine kralen

  1. Meng 250 μL ConA-Sepharose:amylopectine beads met 100 μL van de bindingsbuffer die 10 μg SEX4-eiwit, 10 mM dithiothreitol (DTT) en 10 μM proteaseremmercocktail (PIC) bevat. Merk op dat het totale volume in elke buis 350 μL is.
    OPMERKING: Een proteaseremmercocktail wordt toegevoegd als voorzorgsmaatregel om onnodige SEX4-degradatie te voorkomen. Dit is een optionele stap. In deze test wordt het recombinante eiwit Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4) gebruikt. Het gezuiverde eiwit bevat een N-terminale histidine-tag die nodig is voor het detecteren van het eiwit via chemiluminescentie. Gedetailleerde informatie over glucaanfosfatasezuiveringen is beschreven in eerdere publicaties14,20,24.
  2. Incubeer het eiwit en ConA-Sepharose:amylopectine kraal suspensie bij 4 °C gedurende 45 minuten met zachte rotatie.
    OPMERKING: De incubatietijd van 45 minuten wordt gekozen om ervoor te zorgen dat het evenwicht voor het complex wordt bereikt.
  3. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Pipetteer 50 μL van het supernatant voorzichtig met behulp van een gel-laadpunt in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 20 μL 4x SDS-PAGE-kleurstof en 10 μL water toe aan elke buis met 50 μL van de verzamelde bovennatuurlijke fracties. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C. Sla deze voorbeelden op voor het uitvoeren van de SDS-PAGE-gels. Zorg ervoor dat 10 nieuwe buizen met het label "supernatant (S)" de overeenkomstige substraatconcentraties hebben.
  4. Voeg 750 μL van de bindingsbuffer toe aan de ConA-Sepharose:amylopectin: SEX4 kralen om ongebonden eiwit uit de kralen te verwijderen. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Herhaal deze stap nog een keer om een goede wasbeurt te garanderen. Gooi het supernatant weg.
  5. Voeg 20 μL 4x SDS-PAGE kleurstof en 80 μL gedestilleerd water toe aan de buisjes met gewassen ConA-Sepharose:amylopectin:SEX4 kralen. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C en centrifugeer gedurende 1 minuut op 10.000 x g .
  6. Gooi de pellet weg en bewaar het supernatant voor het uitvoeren van de SDS-PAGE-gels. Pipetteer 80 μL van het supernatant in nieuwe buisjes en label ze als "pellet (P)".

5. SDS-PAGE gels draaien

  1. Laad 40 μL van de ongebonden eiwitmonsters (gemaakt in stap 2.3, gelabeld S) in 4% -12% prefab polyacrylamide-gelputten van de laagste substraatconcentratie tot de hoogste, maar houd de eerste rijstrook vrij om de eiwitmoleculaire gewichtsmarker te laden. Gebruik een tweede gel om 10 gebonden eiwitmonsters te laden die zijn gemaakt in stap 2.5 (gelabeld als P).
  2. Voeg vers bereide 1x SDS-PAGE lopende buffer toe aan beide kamers van het apparaat. Laat de gel gedurende 35 minuten op 150 V lopen of totdat de kleurstofvoorkant de bodem van de gel bereikt.
  3. Verwijder de loopgel uit het apparaat en verwijder de afstandhouders en glasplaten. Gebruik de gescheiden gel om een western blot-analyse uit te voeren.

6. Western blotting voor chemiluminescentiedetectie14,15

OPMERKING: Deze methode kan eenvoudig worden aangepast / aangepast, afhankelijk van de westerse blottingapparatuur die gebruikers in hun laboratoria hebben.

  1. Maak 1 l transferbuffer met 5,8 g Tris-base, 2,9 g glycine, 0,37 g SDS en 200 ml methanol.
  2. Breng de grootte-gescheiden eiwitten van de polyacrylamidegel over naar een nitrocellulosemembraan. Monteer kort de sponzen, filtreerpapier, gel en nitrocellulosemembraan volgens het westerse transferprotocol14,15. Draai op 70 V gedurende 1 uur.
  3. Om niet-specifieke eiwitbinding te voorkomen, incubeert u het nitrocellulosemembraan met de eiwitoplossing van 1% -5% runderserumalbumine (BSA) of melkeiwit in 50 ml TBST-buffer (20 mM Tris [pH 7,5], 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) gedurende 1 uur. Was het membraan 3x met behulp van TBST-buffer om eventuele niet-gebonden blokkerende oplossing te verwijderen.
  4. Incubeer het membraan met een mierikswortelperoxidase (HRP)-gekoppeld antilichaam specifiek voor His-tagged eiwit gedurende 1 uur. Was het membraan 3x in TBST-buffer om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen. Gebruik een 1:2.000 verdunning van antilichamen tegen TBST voor optimale reproduceerbaarheid en gevoeligheid.
  5. Het HRP-enzymgebonden antilichaam bindt specifiek aan de histidine-tag van het SEX4-eiwit, dat een band oplevert in aanwezigheid van chemiluminescentiereagentia. Maak voor digitale beeldvorming een oplossing van gelijke delen chemiluminescente substraatoplossingen (elk 750 μL) in een buis van 1,5 ml. Incubeer het membraan gedurende ten minste 5 minuten in de oplossing.
  6. Plaats het membraaneiwit met de zijkant naar beneden op de vlekscanner en voer de acquisitiesoftware uit om het eiwit in zowel de pellet- als de bovennatuurlijke fractie te kwantificeren.

7. Data-analyse

  1. Voer de kwantitatieve signaalmetingen uit met behulp van de acquisitiesoftware met de blotscanner. Normaliseer alle kwantitatieve metingen in de supernatant- en pelletfracties tot het totale eiwit dat geladen is.
    OPMERKING: De software maakt het mogelijk om de intensiteit van elke eiwitband in de supernatant en pelletfracties te kwantificeren.
  2. Plot in het verzadigingsbindingsexperiment het percentage eiwitgebonden versus amylopectineconcentratie. Pas de gegevens aan op Y = Bmax x X / (K D + X), met behulp van data-analysesoftware om KD te berekenen.
    OPMERKING: Bmax is de maximale specifieke binding, de Y-as is het percentage eiwitgebonden, de en X-as is de amylopectineconcentratie.

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van de ConA-Sepharose sedimentatie assay workflow. (A) Bereiding van ConA-Sepharose kralen. (B) Incubatie met amylopectinesubstraat. (C) Incubatie met SEX4-eiwit. (D) Scheiding van gebonden en ongebonden eiwitfracties door centrifugatie. (E) Scheiding van eiwitten door middel van SDS-PAGE. (F) Western-blot analyse. (G) Chemiluminescentiedetectie van His-tagged SEX4-eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste kenmerken van de glucaanfosfatasefamilie van eiwitten is hun vermogen om te binden aan glucaansubstraten. Eerst werd de bindingscapaciteit van SEX4 aan ConA-Sepharose:amylopectine beads geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE (Figuur 2A). Runderserumalbumine (BSA) diende als een negatieve controle om niet-specifieke binding van eiwitten aan de ConA-Sepharose: amylopectine-kralen te detecteren. De SDS-PAGE analyse van eiwitten toonde de aanwezigheid van SEX4-eiwit in de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie toont de succesvolle ontwikkeling van een nieuwe in vitro sedimentatietest waarmee de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase-interacties kan worden bepaald. Het testontwerp maakt gebruik van de specifieke binding van lectine ConA aan glucanen via de hydroxylresiduen van glucose om indirect opgeloste koolhydraatsubstraten op Sepharose-kralen te vangen. Dit maakt de scheiding van gebonden en ongebonden eiwitfracties via centrifugatie en bepaling van de bindingsaffiniteit van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation award MCB-2012074. De auteurs bedanken Dr. Craig W. Vander Kooi van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor waardevolle discussies en ondersteuning. De auteurs bedanken ook Dr. Matthew S. Gentry van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor zijn steun. We willen Dr. Sara Lagalwar, voorzitter van het Skidmore College Neuroscience-programma, bedanken voor het feit dat ze ons in staat heeft gesteld om de LICOR C-digit blot-scanner te gebruiken voor western blot-beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6x-His Tag monoklonale antilichaam (HIS.H8), HRPTherm Fisher ScientificMA1-21315-HRP
Biorad gelelektroforese en Western blot kitBiorad 1703930
CalciumchlorideSigma-Aldrich208291
C-Digit blot scannerLICOR3600-00Blot scanner
Complete protease remmercocktailSigma-Aldrich11836170001
Concanavalin A-sepharose kralenSigma-AldrichC9017Dit product bevat  in 0,1 M acetaatbuffer, pH 6, bevattende 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, en 1 mM MgCl2 in 20% ethanol 
CentrifugeEppendorf 5425R
GlycineFisher ScientificBP381-5
GraphPad Prism 8.0 softwareGraphPad Versie 8.0Gegevensanalysesoftware 
HEPESSigma-AldrichH8651
Image StudioLICOR3600-501Acquisitiesoftware
MagnesiumchlorideSigma-AldrichM2670
MethanolFisher ScientificA452SK-4
NatriumdodecylsulfaatFisher ScientificPI28312
Aardappel amylopectineSigma-AldrichA8515
Voorgevormd SDSPAGE GelsGenscriptM00653S
Tris baseFisher ScientificBP154-1
Tween 20Fisher ScientificMP1TWEEN201
Westernsure premium chemiluminescentie substraat LI-COR 926-95000

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
  2. Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
  3. Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
  4. Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138(2009).
  5. Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
  6. Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
  7. Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
  8. Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
  9. Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
  10. Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
  11. Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
  12. Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
  13. Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
  14. Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
  15. Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
  16. Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
  17. Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
  18. Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
  19. Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
  20. Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
  21. Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
  22. Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
  23. Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
  24. Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
  25. Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
  26. Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
  27. Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Concanavaline A assayprote ne koolhydraatinteractiesamylopectinebindingSDS PAGEWestern blotdissociatieconstantestijfseloverschot4

Gerelateerde artikelen