Het volgen van de dynamiek van structurele varianten in experimenteel geëvolueerde populaties

Summary

We ontwikkelden een kosteneffectieve methode om niet-enkelvoudige nucleotide polymorfisme alleldynamica te volgen die gemakkelijk kan worden aangepast aan experimentele evolutie bevroren archieven. Een triplet PCR-techniek werd gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese om de relatieve frequentie van een insertie-allel in de loop van de experimentele evolutie te kwantificeren.

Abstract

Van structurele varianten (SV's) (d.w.z. deleties, inserties, duplicaties en inversies) is nu bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij fenotypische variatie, en bijgevolg bij processen zoals ziektebepaling of aanpassing aan een nieuwe omgeving. Single-nucleotidevarianten krijgen echter veel meer aandacht dan SV's, waarschijnlijk omdat ze gemakkelijker te detecteren zijn en hun fenotypische effecten gemakkelijker te voorspellen zijn. De ontwikkeling van short- en long-read deep sequencing-technologieën heeft de detectie van SV's sterk verbeterd, maar de kwantificering van hun frequentie uit poolseq-gegevens (poolseq) is technisch nog steeds complex en duur.

Hier presenteren we een vrij eenvoudige en goedkope methode, waarmee onderzoekers de dynamiek van SV-allelfrequentie kunnen volgen. Als voorbeeld van toepassing volgen we de frequentie van een insertiesequentie (IS) insertie in experimentele evolutiepopulaties van bacteriën. Deze methode is gebaseerd op het ontwerp van drietallen van primers rond de structurele variantranden, zodanig dat de ampliconen geproduceerd door amplificatie van het wild-type (WT) en afgeleide allelen ten minste 5% in grootte verschillen en dat hun versterkingsefficiëntie vergelijkbaar is. De hoeveelheid van elk amplicon wordt vervolgens bepaald door parallelle capillaire elektroforese en genormaliseerd tot een kalibratiecurve. Deze methode kan eenvoudig worden uitgebreid tot de kwantificering van de frequentie van andere structurele varianten (deleties, duplicaties en inversies) en tot pool-seq-benaderingen van natuurlijke populaties, inclusief pathogene populaties binnen de patiënt.

Introduction

Structurele varianten (SV's) zijn veranderingen van de genomische sequentie, die over het algemeen 50 bp of meer beïnvloeden. De vier categorieën beschreven SV's zijn grote inserties, grote deleties, inversies en duplicaties. Tot voor kort werd meer aandacht besteed aan single-nucleotidevarianten (SNV's) dan aan structurele varianten, in termen van hun fenotypische effecten en hun rol als genetische determinanten van ziekte, of hun bijdrage aan aanpassing. Dit komt waarschijnlijk omdat het gemakkelijker is om zowel SNV's te detecteren als hun fenotypische effecten te voorspellen. Kort- en langleestechnologieën voor diepe sequencing hebben de detectie van SV's echter sterk verbeterd, althans in individuele of klonale genomen¹. Tegelijkertijd zijn hun fenotypische effecten beter gekarakteriseerd en zijn er veel voorbeelden van hun implicatie als genetische determinanten van menselijke ziekte ^2,3 of aanpassing aan een nieuwe omgeving⁴ gedocumenteerd.

Deleties en inserties, vaak als gevolg van mobiele genetische element (MGE) inserties, zijn veel disruptiever dan single nucleotide polymorphisms (SNP's) en leiden tot frameshift mutaties en eiwitstructuurmodificaties. Deleties en MGE-inserties in genen resulteren bijna altijd in geninactivatie, en inserties in niet-coderende regio's kunnen leiden tot repressie of constitutieve expressie van aangrenzende genen wanneer insertiesequenties (IS's) promotor- of beëindigingssequenties bevatten⁵. Hoewel het uitschakelen van essentiële genen leidt tot duidelijke schadelijke effecten op bacteriële fitheid, is het verlies van niet-essentiële genen in sommige gevallen gunstig. Ondanks hun inherente kosten kunnen duplicaties ook voordelig zijn en deelnemen aan aanpassing omdat ze leiden tot een verandering in de gendosering; Een toename van de activiteit van een specifiek eiwit kan voordelig zijn, afhankelijk van de omstandigheden⁶.

Microbiële experimentele evolutiepopulaties worden meestal gestart met klonen. Deze aanvankelijke afwezigheid van genetische diversiteit, gecombineerd met de "gesloten omgeving" die kenmerkend is voor reageerbuizen, leidt tot een zeer beperkt potentieel van evolutie door genwinst door horizontale genoverdracht en recombinatie. In deze specifieke omstandigheden is de bijdrage aan de aanpassing van deleties, duplicaties en intragenomische MGE-insertie bijzonder belangrijk; bacteriën passen zich vaak aan door mutaties in functieverlies (voornamelijk als gevolg van deleties of MGE-inserties), waardoor genen worden aangetast die niet nuttig zijn in stabiele, vaak voedselrijke, monocultuur kunstmatige omgevingen⁷. In het langstlopende E. coli-evolutie-experiment komen IS150-inserties vooral vaak voor bij populaties die na 50.000 generaties zijn geëvolueerd, waarbij IS-elementen 35% van de mutaties vertegenwoordigen die een hoge frequentie bereiken in populaties die hun voorouderlijke puntmutatiesnelheid^{behouden 8}.

Evolueren en resequence studies koppelen experimentele evolutie en next-generation sequencing (NGS) technologieën om te onderzoeken hoe bacteriën zich aanpassen, op fenotypisch en genomisch niveau, aan verschillende omgevingsomstandigheden en stress, zoals verschillende koolstof- en energiebronnen, antibiotica en osmotische stress 9,10,11 . Deze studies verkrijgen meestal genomische informatie over de geëvolueerde populaties of klonen alleen op het experimentele eindpunt, en in sommige gevallen op een aantal tussenliggende tijdstippen^12,13,14. Deze gegevens geven inzicht in genen en paden die betrokken zijn bij de aanpassing aan een bepaalde omgeving, maar stellen onderzoekers zelden in staat om de dynamiek van de novo opkomende en vegende allelen in de loop van de tijd te volgen.

Een benadering om deze dynamiek te volgen is om een beperkt aantal scheidende allelen van belang te kiezen (vanwege de functie van de genen die ze beïnvloeden, omdat ze parallel lopen in onafhankelijke populaties, enz.) en ampliconsequencing te gebruiken om de allelverhouding te kwantificeren, waarbij veel tijdspunten in dezelfde sequencingrun¹⁵ worden samengevoegd. Deze methode is met succes gebruikt om de dynamiek van kleine varianten (SNP's of 1 bp indels) te volgen in experimentele¹⁶ en natuurlijke¹⁷ populaties van microben. In het geval van grotere indels of MGE-inserties veroorzaakt het grootteverschil van de amplicons echter PCR-efficiëntieverschillen, die de relatie tussen lees- en allelverhoudingen verstoren. In bepaalde gevallen is het grootteverschil tussen de twee allelen superieur aan de klassieke lengte van het amplicon. Hier hebben we een triplet PCR-techniek gekoppeld aan geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese om de relatieve frequentie van een insertie-allel te kwantificeren op basis van groottediscriminatie. Deze benadering maakt het mogelijk om onderbenutte experimentele tijdspunten te benutten om de dynamiek van een opkomend mutant allel te bepalen en de frequentie ervan te volgen tot fixatie of verlies, op een kosteneffectieve manier. We pasten deze methode toe om opkomende mutS-allelen te volgen, gemuteerd door een IS10-insertie, waardoor het gemuteerde genotype een hypermutatorfenotype kreeg.

Deze methode vereist twee doelallelen met een verschil van ≥5% in grootte. Ten eerste zijn primer-drielingen ontworpen om fragmenten van vergelijkbare grootte te produceren, die een gemeenschappelijke primer delen. Ten tweede worden pcr-condities geoptimaliseerd en wordt een kalibratiecurve geproduceerd met behulp van mixen van wild-type (WT) en mutant gDNA. Ten slotte worden monsters versterkt door PCR en wordt de relatieve frequentie van elk allel gekwantificeerd door parallelle kwantitatieve capillaire elektroforese.

Protocol

Het instellen van dit protocol vereist nauwkeurige kennis van het invoeg-, deletie-, inversie- of duplicatiepunt binnen de voorouderlijke reeks. Deze informatie wordt meestal verkregen door whole-genome sequencing (WGS) van de eind- of tussenpuntmonsters. In het volgende protocol wordt het algemene principe voor het geval van een insertiemutatie gegeven voor elke stap, naast een representatief geval waarin de frequentie van een IS10-insertie in het mutS-gen in een experimentele evolutiepopulatie van E. coli wordt gevolgd. In deze populatie identificeerde WGS van de eindpuntpopulatie de insertie van een IS10 van 1.329 bp tussen posities 2.463 en 2.471, wat resulteerde in de duplicatie van deze insertieplaats. Deze methode is van toepassing op de drie andere SV-typen en de specifieke kenmerken van elk geval worden in de discussie gegeven.

1. Ontwerp van triplet primers

1. Gebruik klassieke primerontwerppraktijken (18-24 bp, 40% -60% GC-gehalte, begin / einde met G / C-paren waar mogelijk, T_m verschil < 5 ° C) om primers FW1 en RV1 te produceren. Ontwerp primers om een korte amplicon op het WT-allel rond de gemuteerde allel-insertieplaats te versterken (figuur 1).
   OPMERKING: De amplicongrootte kan variëren van 100 bp tot maximaal 3.000 bp, in overeenstemming met de DNA-grootteladder die wordt gebruikt bij de capillaire elektroforese. In dit voorbeeld werd een amplicon van 155 bp versterkt. De hier gekozen kleine fragmentgrootte voorkomt off-target versterking van de gehele IS10-insertiesequentie (zie rubriek 2).
2. Ontwerp een tweede voorwaartse primer FW2 binnen de invoegvolgorde om een tweede amplicon te produceren die ongeveer 5% groter of kleiner is dan het WT-amplicon (figuur 1). Dit verschil van 5% is het minimale grootteverschil dat het parallelle capillaire elektroforese-apparaat betrouwbaar kon onderscheiden. Ontwerp daarom de primers zo dat de twee amplicons een verschil in grootte hebben, dat boven maar zo dicht mogelijk bij de relatieve drempel ligt.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u het T_m-verschil en de vorming van primerdimeer minimaliseert. In dit voorbeeld werd een tweede voorwaartse primer ontworpen om een amplicon van 226 bp te produceren, 71 bp groter dan het WT-amplicon. In dit representatieve voorbeeld zijn de primersequenties als volgt:
   FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC
   RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
   FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG

Figuur 1: Schema van triplet primer ontwerp op mutS WT gen en mutant mutS IS10 insertie. De zwarte driehoek vertegenwoordigt de IS10-insertieplaats in het mutS-gen. Het WT-gen is blauw en de IS10 is oranje. Primers FW1 en RV1 markeren de IS10-invoegplaats en produceren een WT-amplicon van 155 bp. De RV1 primer en de intra-IS10 primer FW2 produceren een tweede 226 bp amplicon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Optimalisatie van PCR-voorwaarden

1. Kweek een nachtelijke cultuur van vaste WT- en mutante allelklonen.
2. Extraheer het DNA met behulp van een kit.
3. Kwantificeer het DNA.
4. Bereid het DNA-monster voor door de extractie van WT- en mutant-DNA te verdunnen tot 5 ng/μL. Meng de twee DNA-monsters in een verhouding van 50/50.
5. Amplificeer 10 ng van de drie DNA-monsters (WT, mutant, 50/50 mix) met behulp van een 2x kant-en-klare PCR-mastermix, 0,5 μM FW1-primer, 1 μM RV1-primer en 0,5 μM FW2-primer in een reactievolume van 20 μL. Gebruik een 2% agarose-gel om het PCR-product te migreren door klassieke elektroforese en bepaal de optimale PCR-omstandigheden.
   OPMERKING: Rektijden moeten worden geminimaliseerd om de vorming van het FW1- en RV1-amplicon op het mutante allel te voorkomen. De gloeitemperatuur moet worden aangepast om vertekende versterking van de allelen en niet-specifieke versterking te minimaliseren.
   1. Om het programma in dit voorbeeld te volgen, gebruikt u de volgende instellingen: 98 °C gedurende 10 s, gevolgd door 25 cycli van 98 °C gedurende 1 s, 58 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 8 s en een laatste rekstap bij 72 °C gedurende 1 min.
      OPMERKING: De rektijd werd teruggebracht tot 8 s om versterking van het >1.000 bp product van de voorwaartse primer en de RV1-primer op het mutante allel te voorkomen (mutS met IS10-insertie).

3. Kalibratiecurve

1. Meng de twee DNA-monsters, WT en mutant, in de verhoudingen 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 en 90/10.
   OPMERKING: Biologische replicaties worden bereid uit onafhankelijke nachtelijke bacterieculturen.
2. Versterken met behulp van geoptimaliseerde PCR-condities (zie rubriek 2).
3. Kwantificeer het ampliconproduct.
4. Verdun de PCR-producten tot 0,1 ng/μl.
5. Bereid het parallelle capillaire elektroforese-instrument voor.
   1. Meng verse gel en kleurstof (NGS kwantitatieve analysekit (22, 33 of 55); HS NGS fragment 1-6.000 bp voor dit voorbeeld).
      OPMERKING: Zie de parallelle capillaire elektroforese HS NGS fragmentgids voor gedetailleerde instructies (zie de tabel met materialen).
6. Vervang de capillaire opslagoplossing en de inlaatbuffer en plaats de spoelbufferplaat op de juiste ladeplaatsen van het parallelle capillaire elektroforese-instrument.
7. Voeg 2 μL HS-verdunningsmarker toe aan 22 μL van elk verdund monster in een plaat met 96 putten.
8. Voeg een grootteladder (DNA-grootteladder; bereik 1-6.000 bp) van een HS NGS kwantitatieve analysekit toe aan één put van de 96-putplaat.
9. Plaats de 96-putsplaat in de juiste lade van het parallelle capillaire elektroforese-instrument en selecteer Uitvoeren op de software van het parallelle capillaire elektroforese-instrument.
10. Analyseer de resultaten met behulp van de data-analysesoftware, die elke piek van de grootteladder detecteert en identificeert en elke piek van de monsters toewijst aan hun bekende werkelijke grootte.
    1. Wanneer u een kwantitatieve kit gebruikt, gebruikt u de software om de DNA-hoeveelheid van elk fragment te bepalen door het gebied onder de piek te integreren, zoals bij chromatografiegegevensanalyse. Nogmaals, vergelijk monsters met bekende hoeveelheden in normen om elke piek uit een steekproef te kwantificeren en bereken de verhoudingen tussen de verschillende pieken die in de monsters zijn gedetecteerd.
    2. Construeer een kalibratiecurve (figuur 2), waarbij de bekende verhouding van het gemuteerde allel (DNA-mix) wordt gekoppeld aan de verhouding die is gemeten met behulp van het parallelle capillaire elektroforese-instrument. Met deze kalibratiecurve kan de betrouwbaarheid van de methode worden geëvalueerd en gecorrigeerd voor kleine versterkingsbias.

4. Monstervoorbereiding

1. Kweek tijdpuntmonsters 's nachts in standaardomstandigheden.
2. Extraheer het DNA.
3. Kwantificeer het DNA.
4. Amplificeer de monsters met behulp van geoptimaliseerde PCR-omstandigheden (zie rubriek 2).
5. Voer de monsters uit in het parallelle capillaire elektroforese-instrument (zie stappen 3.5-3.10).

5. Kwantificering van allel

1. Extraheer mutante allelhoeveelheden uit de parallelle capillaire elektroforese-instrumentgegevens met de software en bereken de werkelijke verhoudingen door deze waarden op de kalibratiecurve uit te zetten.

Results

Met behulp van DNA geëxtraheerd uit een voorouderlijke kloon en een hypermutatorkloon geïsoleerd uit de S2.11-populatie bij generatie 1.000, hebben we de kalibratiecurve vastgesteld die in figuur 2 wordt weergegeven. De werkelijke mutante verhoudingen van in het laboratorium bereide DNA-mengsels en gemeten door het parallelle capillaire elektroforese-instrument waren verbonden door een lineaire relatie van helling 1,0706, met een R² van 0,9705. Daarnaast was er een goede overeenko...

Discussion

Hier hebben we een kosteneffectieve methode voorgesteld waarmee de dynamiek van opkomende adaptieve SV-allelen in experimentele evolutiepopulaties kan worden gevolgd. Deze methode koppelt klassieke PCR-technieken en geautomatiseerde parallelle capillaire elektroforese, waardoor de relatieve hoeveelheden van twee allelen kunnen worden bepaald. Eenmaal ingesteld, maakt het de kwantificering van allelverhoudingen in veel monsters parallel mogelijk en is het veel goedkoper dan WGS. Deze methode kan worden gezien als een equi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Skirted PCR Plate	4titude	4Ti - 0740	PCR
Agarose molecular biology grade	Eurogentec	EP-0010-05	Agarose gel elektroforese
Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems	Agilent		PDF instructiehandleiding
Buffer TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Agarose gel elektroforese
Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles	LABELIANS	8175CSR40H	Bacteriecultuur
Dneasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69506	DNA extractie
Electrophoresis power supply	Amilabo	ST606T	Agarose gel elektroforese
Fragment Analyzer Automated CE System	Agilent		Parallel capillaire elektroforese
Fragment DNA Ladder	Agilent	DNF-396, range 1-6000bp	Parallel capillaire elektroforese
GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Bacteriecultuur
High Sensitivity diluent marker	Agilent	DNF-373	Parallel capillaire elektroforese
High Sensitivity NGS quantitative analysis kit	Agilent	DNF-474	Parallel capillaire elektroforese
Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder	NEB	N0469S	Agarose gel elektroforese
LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Bacteriecultuur
Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Primers	Eurogentec		PCR
Prosize data analysis software v.4	Agilent	V.4	Parallel capillaire elektroforese
Qubit assays	Invitrogen	MAN0010876	DNA kwantificatie
Qubit dsDNA HS Assay Kit	LIFE TECHNOLOGIES SAS	Q32854	DNA kwantificatie
Thermocycler	Eppendorf	Ep gradients	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Agarose gel elektroforese visualisatie
Water for injectable preparation	Aguettant	PROAMP	PCR