Methodenartikel

Evaluatie van antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken in vitro

DOI:

10.3791/64712

⸱

21 april 2023

 ,  , 
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We introduceren vier methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te evalueren met behulp van in vitro technieken. Deze methoden kunnen worden aangepast om de interacties van verschillende nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken met een breed scala aan microbiële soorten te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken, zoals zilver, zinkoxide, titaniumdioxide en magnesiumoxide, zijn eerder onderzocht in klinische en omgevingsomgevingen en in verbruiksartikelen. Een gebrek aan consistentie in de gebruikte experimentele methoden en materialen heeft echter geleid tot tegenstrijdige resultaten, zelfs tussen studies van dezelfde nanostructuurtypen en bacteriesoorten. Voor onderzoekers die nanostructuren willen gebruiken als additief of coating in een productontwerp, beperken deze tegenstrijdige gegevens hun gebruik in klinische omgevingen.

Om dit dilemma het hoofd te bieden, presenteren we in dit artikel vier verschillende methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te bepalen en bespreken we hun toepasbaarheid in verschillende scenario's. Het aanpassen van consistente methoden zal naar verwachting leiden tot reproduceerbare gegevens die kunnen worden vergeleken tussen studies en geïmplementeerd voor verschillende nanostructuurtypen en microbiële soorten. We introduceren twee methoden om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes te bepalen en twee methoden voor de antimicrobiële activiteiten van nanogestructureerde oppervlakken.

Voor nanodeeltjes kan de directe cocultuurmethode worden gebruikt om de minimale remmende en minimale bacteriedodende concentraties van nanodeeltjes te bepalen, en de directe blootstellingscultuurmethode kan worden gebruikt om real-time bacteriostatische versus bacteriedodende activiteit als gevolg van blootstelling aan nanodeeltjes te beoordelen. Voor nanogestructureerde oppervlakken wordt de directe kweekmethode gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën indirect en direct in contact met nanogestructureerde oppervlakken te bepalen, en de methode voor gerichte contactblootstelling wordt gebruikt om antimicrobiële activiteit op een specifiek gebied van een nanogestructureerd oppervlak te onderzoeken. We bespreken de belangrijkste experimentele variabelen waarmee rekening moet worden gehouden voor in vitro onderzoeksontwerp bij het bepalen van de antimicrobiële eigenschappen van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken. Al deze methoden zijn relatief goedkoop, maken gebruik van technieken die relatief gemakkelijk te beheersen en herhaalbaar zijn voor consistentie, en zijn toepasbaar op een breed scala aan nanostructuurtypen en microbiële soorten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alleen al in de VS ontwikkelen jaarlijks 1,7 miljoen mensen een ziekenhuisinfectie (HAI), waarbij één op de 17 van deze infecties resulteert in de dood1. Bovendien wordt geschat dat de behandelingskosten voor zorginfecties variëren van $ 28 miljard tot $ 45 miljard per jaar 1,2. Deze zorginfecties worden gedomineerd door methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)3,4 en Pseudomonas aeruginosa4, die vaak geïsoleerd zijn van chronische wondinfecties en meestal uitgebreide behandeling en tijd nodig hebben om een gunstig patiëntresultaat te produceren.

In de afgelopen decennia zijn meerdere antibioticaklassen ontwikkeld om infecties te behandelen die verband houden met deze en andere pathogene bacteriën. Rifamycine-analogen zijn bijvoorbeeld gebruikt voor de behandeling van MRSA, andere grampositieve en gramnegatieve infecties en Mycobacterium spp. infecties5. In de jaren 1990, om een toenemend aantal M. tuberculosis-infecties effectief te behandelen, werden aanvullende geneesmiddelen gecombineerd met rifamycine-analogen om hun effectiviteit te vergroten. Ongeveer 5% van de gevallen van M. tuberculosis blijft echter resistent tegenrifampicine 5,6 en er is toenemende bezorgdheid over multiresistente bacteriën7. Momenteel is het gebruik van antibiotica alleen mogelijk niet voldoende bij de behandeling van zorginfecties, en dit heeft geleid tot een voortdurende zoektocht naar alternatieve antimicrobiële therapieën1.

Zware metalen, zoals zilver (Ag)8,9,10 en goud (Au)11, en keramiek, zoals titaandioxide (TiO 2)12 en zinkoxide (ZnO)13, in nanodeeltjes (NP) vorm (respectievelijk AgNP, AuNP, TiO2 NP en ZnONP) zijn onderzochtop hun antimicrobiële activiteiten en zijn geïdentificeerd als potentiële antibioticaalternatieven. Daarnaast zijn bioresorbeerbare materialen, zoals magnesiumlegeringen (Mg-legeringen)14,15,16, magnesiumoxide nanodeeltjes 17,18,19,20,21, en magnesiumhydroxide nanodeeltjes [nMgO en nMg(OH)2, respectievelijk]22,23,24, zijn ook onderzocht. De eerdere antimicrobiële studies van nanodeeltjes gebruikten echter inconsistente materialen en onderzoeksmethoden, wat resulteerde in gegevens die moeilijk of onmogelijk te vergelijken zijn en soms tegenstrijdig van aard zijn18,19. De minimale remmende concentratie (MIC) en de minimale bacteriedodende concentratie (MBC) van zilveren nanodeeltjes varieerden bijvoorbeeld aanzienlijk in verschillende onderzoeken. Ipe et al.25 evalueerden de antibacteriële activiteiten van AgNP's met een gemiddelde deeltjesgrootte van ~26 nm om de MIC's te bepalen tegen grampositieve en gramnegatieve bacteriën. De geïdentificeerde MIC's voor P. aeruginosa, E. coli, S. aureus en MRSA waren respectievelijk 2 μg / ml, 5 μg / ml, 10 μg / ml en 10 μg / ml. Parvekar et al.26 evalueerden daarentegen AgNP's met een gemiddelde deeltjesgrootte van 5 nm. In dit geval bleken de AgNP MIC en een MBC van 0,625 mg/ml effectief te zijn tegen S. aureus. Daarnaast evalueerden Loo et al.27 AgNP's met een grootte van 4,06 nm. Wanneer E. coli werd blootgesteld aan deze nanodeeltjes, werden de MIC en MBC gerapporteerd bij 7,8 μg / ml. Ten slotte onderzochten Ali et al.28 de antibacteriële eigenschappen van bolvormige AgNP's met een gemiddelde grootte van 18 nm. Wanneer P. aeruginosa, E. coli en MRSA werden blootgesteld aan deze nanodeeltjes, werd de MIC geïdentificeerd bij respectievelijk 27 μg / ml, 36 μg / ml, 27 μg / ml en 36 μg / ml, en de MBC werd geïdentificeerd bij respectievelijk 36 μg / ml, 42 μg / ml en 30 μg / ml.

Hoewel de antibacteriële activiteit van nanodeeltjes de afgelopen decennia uitgebreid is bestudeerd en gerapporteerd, is er geen standaard voor de gebruikte materialen en onderzoeksmethoden om directe vergelijkingen tussen studies mogelijk te maken. Om deze reden presenteren we twee methoden, de directe co-cultuurmethode (methode A) en de directe blootstellingsmethode (methode B), om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes te karakteriseren en te vergelijken, terwijl de materialen en methoden consistent blijven.

Naast nanodeeltjes zijn ook nanogestructureerde oppervlakken onderzocht op antibacteriële activiteiten. Deze omvatten op koolstof gebaseerde materialen, zoals grafeen nanosheets, koolstofnanobuizen en grafiet29, evenals pure Mg- en Mg-legeringen. Elk van deze materialen heeft ten minste één antibacterieel mechanisme vertoond, waaronder fysieke schade aan celmembranen door op koolstof gebaseerde materialen en schade aan metabole processen of DNA door het vrijkomen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) wanneer Mg wordt afgebroken. Bovendien, wanneer zink (Zn) en calcium (Ca) worden gecombineerd bij de vorming van Mg-legeringen, wordt de verfijning van de Mg-matrixkorrelgrootte verbeterd, wat leidt tot een vermindering van bacteriële hechting aan substraatoppervlakken in vergelijking met Mg-only monsters14. Om antibacteriële activiteit aan te tonen, presenteren we de directe kweekmethode (methode C), die bacteriële hechting op en rond nanogestructureerde materialen in de loop van de tijd bepaalt door de kwantificering van bacteriële kolonievormende eenheden (CFU's) met direct en indirect oppervlaktecontact.

De geometrie van nanostructuren op oppervlakken, inclusief de grootte, vorm en oriëntatie, kan de bacteriedodende activiteiten van materialen beïnvloeden. Lin et al.16 fabriceerden bijvoorbeeld verschillende nanogestructureerde MgO-lagen op de oppervlakken van Mg-substraten door anodisatie en elektroforetische depositie (EPD). Na een periode van blootstelling aan het nanogestructureerde oppervlak in vitro was de groei van S. aureus aanzienlijk verminderd in vergelijking met niet-behandeld Mg. Dit duidde op een grotere potentie van het nanogestructureerde oppervlak tegen bacteriële hechting ten opzichte van het niet-behandelde metallische Mg-oppervlak. Om de verschillende mechanismen van de antibacteriële eigenschappen van verschillende nanogestructureerde oppervlakken te onthullen, wordt in dit artikel een gerichte contactblootstellingsmethode (methode D) besproken die de cel-oppervlakte-interacties binnen het interessegebied bepaalt.

Het doel van dit artikel is om vier in vitro methoden te presenteren die van toepassing zijn op verschillende nanodeeltjes, nanogestructureerde oppervlakken en microbiële soorten. We bespreken de belangrijkste overwegingen voor elke methode om consistente, reproduceerbare gegevens voor vergelijkbaarheid te produceren. In het bijzonder worden de directe cocultuurmethode17 en de directe blootstellingsmethode gebruikt voor het onderzoeken van de antimicrobiële eigenschappen van nanodeeltjes. Door middel van de directe co-cultuur methode kunnen de minimale remmende en minimale bacteriedodende concentraties (respectievelijk MIC en MBC 90-99,99) voor individuele soorten worden bepaald en kan de krachtigste concentratie (MPC) voor meerdere soorten worden bepaald. Door de directe blootstellingsmethode kunnen de bacteriostatische of bacteriedodende effecten van nanodeeltjes bij minimale remmende concentraties worden gekenmerkt door real-time optische dichtheidsmetingen in de loop van de tijd. De direct culture14 methode is geschikt voor het onderzoeken van bacteriën die direct en indirect in contact komen met nanogestructureerde oppervlakken. Ten slotte wordt de focused-contactexposure 16-methode gepresenteerd om de antibacteriële activiteit van een specifiek gebied op een nanogestructureerd oppervlak te onderzoeken door de directe toepassing van bacteriën en de karakterisering van bacteriegroei op de cel-nanostructuurinterface. Deze methode is aangepast van de Japanse industriële standaard JIS Z 2801:200016 en is bedoeld om zich te concentreren op microbe-oppervlakte-interacties en de effecten van bulkmonsterafbraak in microbiële cultuur op antimicrobiële activiteiten uit te sluiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de directe co-cultuur en directe blootstellingsmethoden te presenteren, gebruiken we magnesiumoxide nanodeeltjes (nMgO) als modelmateriaal om bacteriële interacties aan te tonen. Om de directe kweek- en gerichte contactblootstellingsmethoden te presenteren, gebruiken we een Mg-legering met nanogestructureerde oppervlakken als voorbeelden.

1. Sterilisatie van nanomaterialen

OPMERKING: Alle nanomaterialen moeten worden gesteriliseerd of gedesinfecteerd voordat microbiële kweek plaatsvindt. De methoden die kunnen worden gebruikt, omvatten warmte, druk, straling en ontsmettingsmiddelen, maar de tolerantie van de materialen voor elke methode moet voorafgaand aan de in vitro experimenten worden geïdentificeerd.

  1. Nanodeeltjes
    OPMERKING: Monsters kunnen worden opgeslagen in een organisch oplosmiddel zoals ethanol of worden verpakt in een schaal of doos, gevolgd door sterilisatie of desinfectie op een geschikte manier. De nanodeeltjes werden gesteriliseerd met behulp van de volgende methode voor demonstratie van de directe co-cultuurmethode17 en de directe blootstellingsmethode.
    1. Steriliseer MgO nanodeeltjes in een heteluchtoven van 200 °C30 gedurende 60 minuten voorafgaand aan elk in vitro experiment.
      OPMERKING: Deze methode is gekozen omdat waterstoom en UV-licht de structuren van de MgO-nanodeeltjes (nMgO)17 kunnen beïnvloeden.
  2. Bulkmaterialen
    OPMERKING: De nanogestructureerde materialen werden gesteriliseerd met de volgende methode voor demonstratie van de directe kweekmethode.
    1. Desinfecteer voor de directe kweekmethode14 de monsters zoals bereid ZC21, Mg en T64 gedurende 4 uur met ultraviolette (UV) straling voordat met de in vitro onderzoeken wordt begonnen.
    2. Voor de blootstellingsmethode16 met gericht contact moeten alle monsters gedurende 2 uur vóór aanvang van het in vitro onderzoek alle monsters met UV-straling worden gedesinfecteerd.
  3. U kunt ook ethyleenoxide (EtO) gebruiken voor de sterilisatie van warmtegevoelige materialen.

2. Directe cocultuurmethode (methode A)

OPMERKING: In methode A worden bacteriën in een lag-fase zaaicultuur direct gemengd met nanodeeltjes van bepaalde concentraties. Voor het onderzoek van antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes volgen we een protocol beschreven door Nguyen et al.17.

  1. Karakterisering van nanodeeltjes en nanostructuren
    OPMERKING: De samenstelling en vorm van de nanostructuur worden bevestigd met behulp van röntgenpoederdiffractie.
    1. Meting van nanodeeltjes
      1. Weeg de nanodeeltjes met 9x de gewenste massa per ml om 3 ml monsters in drievoud te plaatsen. Weeg bijvoorbeeld 0,2 mg / ml nMgO bij 1,8 mg / ml.
        OPMERKING: Dit zorgt voor de consistente verdeling van nanodeeltjes in de bacterieculturen en bouillons.
      2. Meet alle nanodeeltjes in een microcentrifugebuis van 5,0 ml die vooraf is gewogen en geteerd met behulp van een analytische balans.
  2. Bereiding en kweek van bacterieculturen
    1. Haal voor elk in vitro experiment bacteriecelvoorraden op uit opslag bij -80 °C. Voeg 10 μL van elke bacteriecelvoorraad toe aan 5 ml van een geschikt groeimedium.
    2. Plaats het geënte medium gedurende ongeveer 16 uur gedurende een nacht in een couveuse-shaker bij 37 °C en 250 tpm.
      1. Als Staphylococcus-soorten worden gekweekt, subcultuur door 400 μL van elke nachtcultuur in 20 ml vers groeimedium (100 μL / 5 ml medium) te plaatsen en te incuberen met schudden bij 37 ° C en 250 tpm gedurende nog eens 4-6 uur.
  3. Wassen en tellen van de bacteriecellen om de zaaidichtheid te bepalen
    OPMERKING: De gewenste zaaidichtheid van 7,8 × 106 CFU / ml werd geïdentificeerd als het celaantal dat groter is dan wat nodig is om een urineweginfectie te bevestigen.
    1. Verzamel gekweekte bacteriën door 1 ml van de nachtelijke bacteriecultuur in microcentrifugebuizen van 1,5 ml te aliquoteren. Maak voldoende aantallen aliquots uit nachtelijke bacterieculturen en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 1.956 × g om de gewenste zaaidichtheden te bereiken.
    2. Na centrifugeren, pipet om het supernatant uit de gepelleteerde cellen te verwijderen en het supernatant in een opvangbak te plaatsen. Resuspendie van de celkorrels in 0,5 ml vers groeimedium. Combineer twee suspensies van 0,5 ml om 1 ml suspensie te creëren om het aantal aliquots van 1 ml geresuspendeerde cellen tot zes te verminderen. Herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1.956 × g.
    3. Voltooi een tweede wascyclus met vers groeimedium, zoals in stap 2.3.2, om het aantal aliquots van 1 ml geresuspendeerde gewassen cellen tot drie te verminderen.
    4. Voltooi de derde cyclus, zoals in stap 2.3.2, behalve de celpellets resuspenderen in 0,33 ml Tris-buffer (hydroxymethyl) aminomethaanbuffer (Tris-buffer, pH 8,5). Combineer de drie suspensies, elk met een volume van 0,33 ml, in één microcentrifuge van 1,5 ml. Herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1,956 × g.
      OPMERKING: Tris-buffer bevat geen Mg 2+ of Ca2+ ionen31. Dit is belangrijk voor het gebruik van inductief gekoppelde plasma-optische emissiespectrometrie (ICP-OES) om Mg 2+ en Ca2+ ionen te meten in post-kweekbouillons. Daarentegen vangen de fosfaten die aanwezig zijn in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)32, bijvoorbeeld, zowel Mg 2+ als Ca2+ ionen33,34,35 vast en veroorzaken verwarring bij de interpretatie van de ICP-OES-gegevens.
    5. Verwijder het supernatant uit de gepelleteerde cellen. Resuspendeer de celpellet in 1 ml verse Tris-buffer, bekend als de celsuspensie - een vertragingsfase bacteriële zaaicultuur.
    6. Bepaal de celsuspensieconcentratie (cellen / ml) met behulp van een hemocytometer.
  4. Creatie van de zaaibacteriecultuur
    OPMERKING: Het monster heeft een totaal volume van 3 ml en wordt in drievoud voltooid (totaal 9 ml).
    1. Bepaal het totale volume van de benodigde zaaicultuur van bacteriën. Om de zaaicultuur te maken, gebruikt uC 1 V1 = C 2 V2om het volume van de celsuspensie te berekenen dat nodig is om een zaaicultuur van 7,8 × 106 cellen / ml te maken. Voeg het berekende volume van de celsuspensie (V1) toe aan het vereiste volume groeimedia (V2).
    2. Bepaal de werkelijke zaaidichtheid van bacteriën in CFU / ml. Maak een tienvoudige seriële verdunning tot 10-4. Spreid de 10-4 verdunning uit op de juiste groeiagar en incubeer een nacht. Tel na incubatie het aantal kolonies en bereken de CFU / ml.
  5. Vorming van bacteriën en nanodeeltjesculturen
    1. In 12-well, niet-weefselbehandelde polystyreenplaten, aliquot 2 ml van de bacteriële zaaicultuur in elke put voor het aantal benodigde putten.
    2. Voeg voor elke microcentrifugebuis van 5 ml die vooraf gewogen nMgO bevat, 3 ml van de bacteriële zaaicultuur toe. Vortex kort om de nMgO te mengen met de bacteriën. Aliquot 1 ml van het mengsel in drie afzonderlijke putjes om de drievoudige monsters van elk vooraf gemeten gewicht van nMgO te maken. Pipetteer het bacterie/nMgO-mengsel 2-3x voordat elke aliquot van 1 ml wordt gemaakt om nMgO in suspensie te houden.
      OPMERKING: Controlemonsters bestaan uit 3 ml cellen, slechts 3 ml media en 3 ml met de laagste en hoogste concentraties nanodeeltjes die worden gebruikt. Deze worden voorbereid zoals in stap 2.5.2. Alle controlemonsters worden in drievoud ingevuld.
    3. Incubeer alle 12-putplaten bij 37 °C en 120 tpm gedurende 24 uur.
  6. Het bepalen van de bacteriële celgroei na blootstelling aan nMgO
    1. Na een nacht incubatie van de bacterieculturen, verzamelt u elk monster van 3 ml door te pipetteren in een individuele conische buis van 15 ml.
    2. Gebruik een plaat met 96 putten om 1:10 seriële verdunningen te creëren. Bepaal het aantal kolommen dat nodig is om alle monsters die bacteriën bevatten serieel te verdunnen. Voeg 180 μL Tris-buffer toe aan elke put in rij B aan rij G voor het juiste aantal kolommen.
    3. Draai kort elke conische buis van 15 ml met bacteriële monsters en voeg 50 μL toe aan een individuele put in rij A.
    4. Breng voor elke put in rij A 20 μL over in rij B (bijvoorbeeld A1 tot B1) en meng kort door pipetteren om een volume van 200 μL te verkrijgen. Breng met behulp van een steriele pipetpunt 20 μL over van de put in rij B naar de put in rij C. Zet dit patroon voort totdat de put in rij G 200 μL bevat, het voltooien van een seriële verdunning van 10−1 in rij B tot 10−6 in rij G.
    5. Pipetteer 100 μL van elke put op een geschikte groei-agarplaat en verspreid over de plaat om de celcultuur te verspreiden. Plaats de platen een nacht bij 37 °C in een incubator-shaker. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 24 uur.
    6. Onderzoek de platen en tel die met ongeveer 25-300 kolonies. Kies indien mogelijk platen met dezelfde verdunningswaarde. Gebruik het aantal kolonies per plaat om de CFU/ml te berekenen.
  7. Evaluatie van de pH na incubatie
    OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor elk pH-metermodel.
    1. Kalibreer een pH-meter vooraf met behulp van standaardisatieoplossingen van pH 4, pH 7 en pH 10. Lees elk bacteriemonster af door de pH-sonde in de conische buis van 15 ml te plaatsen.
  8. Voorbereiding van monsters voor ICP-OES
    OPMERKING: ICP-OES wordt gebruikt om de concentratie van Mg 2+ en Ca2+ ionen te bepalen. Deze kationen worden als belangrijk beschouwd, omdat elk deel uitmaakt van het cellulaire metabolisme.
    1. Centrifugeer elke conische buis van 15 ml bereid in stap 2.6.1 gedurende 5 minuten bij 5.724 × g om het cellulaire en nanodeeltjesafval te pelleteren.
    2. Verdun met behulp van een conische buis van 15 ml 30 μL van het supernatant tot 2,97 ml 18,2 Ω gefilterd water om een verdunning van 1:100 te creëren.
      OPMERKING: De verdunningsfactor kan worden aangepast op basis van de geprojecteerde ionenconcentraties en de detectiegrens van het spectrometerinstrument.
    3. Lees de voorbeelden met ICP-OES.

3. Methode voor directe blootstelling (methode B)

OPMERKING: Als de groeisnelheid van de gekozen bacteriën onbekend is, moet een standaardisatie van de groeicurve worden voltooid voordat deze methode wordt geïmplementeerd.

  1. Bepaal de real-time bacteriostatische en bacteriedodende activiteiten bij blootstelling aan de nanodeeltjes van belang.
    1. Bereid de gewenste concentraties nanodeeltjes voor met behulp van de methoden die worden beschreven in stap 2.1-2.1.2.2. Bereid twee sets van elk gewicht nanodeeltjes voor die moeten worden gebruikt: één om te worden toegevoegd aan 3 ml aliquots van bacteriecultuur in de logaritmische groeifase, en de andere om te worden toegevoegd aan 3 ml aliquots groeimedium zonder bacteriën als controlegroepen.
    2. Bepaal de juiste bacteriostatische en bacteriedodende antibiotica voor de te testen bacteriesoorten.
      OPMERKING: Kennis van de minimale remmende concentratie voor elk antibioticum is vereist.
  2. Bereken het totale volume bacteriecultuur dat nodig is voor drievoudige monsters van 3 ml voor alle nanodeeltjes-, antibiotica- en controlemonsters.
    OPMERKING: Een gelijk volume steriel groeimedium is vereist. Als het gebruik van spectrofotometrie is gepland, moet het totale volume dat nodig is voor de opvang van het volume van 0,5 ml tot 1,0 ml dat nodig is voor cuvetten, worden aangepast.
  3. Dag 1: Maak voor elk in vitro experiment 's nachts voorraden volgens stap 2.2.1-2.2.2.
  4. Dag 2: Controleer of de instellingen van de plaatlezer geschikt zijn voor een plaat met 96 putten met een optische dichtheid van 600 nm. Meet de monsters in aliquots van 200 μL met behulp van een plaat met 96 putten.
    1. Bepaal een initiële bacteriecultuur OD600 bij 0,01 - de dichtheid die wordt gebruikt om de initiële incubatietijd te beginnen voorafgaand aan de toevoeging van nanodeeltjes en antibiotica.
    2. Verzamel de nachtelijke bacteriecultuur uit de incubator-shaker.
      1. Maak voor elk te testen materiaal (bijv. vooraf gemeten nanodeeltjes of antibiotica) een afzonderlijke bacteriecultuur bij een OD600 van 0,01. Gebruik een container die groot genoeg is voor het benodigde volume celkweek (bijvoorbeeld een gesteriliseerde Erlenmeyer of conische buisjes van 50 ml).
      2. Verdun de nachtelijke bacteriële monsters met groeimedium door drie aliquots van 200 μL van het groeimedium in drie putjes en drie aliquots van 200 μL van de bacteriecultuur in extra putjes (bijv. A1 tot en met A6) te plaatsen.
      3. Plaats de 96-puts plaat in de plaatlezer en scan deze.
        OPMERKING: De metingen worden gemiddeld voor elk gescand putje om een gemiddelde waarde te produceren.
      4. Om de dichtheid van bacteriën in suspensie te berekenen, neemt u het gemiddelde gemiddelde van de gemiddelde waarde voor elke put die een drievoudig monster bevat.
      5. Om de optische dichtheid van de bacteriën te bepalen, trekt u het gemiddelde van het bouillonmonster af van het bacteriële gemiddelde.
      6. Als het nodig is om de bacteriële suspensie te blijven aanpassen, blijft u indien nodig bouillon of nachtelijke bacteriecultuur toevoegen en herhaalt u het scannen in de plaatlezer indien nodig totdat een OD600 van ongeveer 0,01 is bereikt.
      7. Incubeer bij 37 °C met schudden bij 150 rpm tot logaritmische groei is bereikt.
  5. Verwijder de bacterieculturen uit de incubator shaker.
    1. Aliquot 3 ml van de OD600 0,01 bacteriecultuur in gelabelde 15 ml conische buizen voor test- en controlemonsters in drievoud.
    2. Aliquot 200 μL van de bacteriecultuur in drie putjes van een plaat met 96 putten en meet de monsters met behulp van de plaatlezer.
    3. Bereken de metingen zoals eerder beschreven in stap 3.4.2.2 en stap 3.4.2.6 - de "-0,5 uur aflezing".
  6. Creatie en meting van mengsels van bacteriën en nanodeeltjes
    1. Aliquot 3 ml steriel groeimedium in gelijke aantallen als de bacterieculturen in gelabelde 15 ml conische buisjes voor controlemonsters (in drievoud).
    2. Om bacteriën/nanodeeltjessuspensies en steriele media/nanodeeltjessuspensies te bereiden, verwijdert u 1 ml bacteriecultuur of -medium uit elke drievoudige set conische buisjes van 15 ml.
      1. Plaats de aliquots van 1 ml in een centrifugebuis van 5 ml met vooraf afgemeten nanodeeltjes en draaikolk kort om te mengen.
      2. Retourneer vanuit de centrifugebuis van 5 ml 1 ml aliquots van de bacteriën/nanodeeltjes of medium/nanodeeltjessuspensies naar de 15 ml conische buis om de nanodeeltjes homogeen te verdelen.
        OPMERKING: Pipetteer het bacterie/nanodeeltjesmengsel 2x-3x voordat elke aliquot van 1 ml wordt gepipetteerd om de nanodeeltjes in suspensie te houden.
  7. Creatie en meting van bacterie/antibiotica mengsels
    1. Om de bacteriële/antibiotische culturen te maken, aliquoteert u 3 ml van de geïncubeerde bacteriecultuur in de overeenkomstig gelabelde conische buisjes van 15 ml.
    2. Nadat alle monsters zijn bereid, aliquot 200 μL van elk monster in de afzonderlijke putten van een plaat met 96 putten.
    3. Plaats de plaat(en) in de plaatlezer en start het scannen - de "0 h" -meting.
    4. Plaats de conische buizen van 15 ml met de monsters in een incubator-shaker bij 37 °C en 150 tpm. Noteer alle gegevens zoals eerder beschreven in stap 3.4.2.2 en stap 3.4.2.6.
  8. Herhaal ongeveer 15 minuten na het voltooien van de 0 uur-meting de stappen beschreven in stap 3.7.2-3.7.3-de "0,5 h" -meting.
    1. Herhaal na de vastgestelde 0 uur de stappen beschreven in stap 3.7.2-stap 3.7.3 elke 90 minuten gedurende zes cycli; voltooid in 9 uur.
    2. Nadat de zesde cyclus is voltooid, plaatst u de monsters nog eens 15 uur in de incubator-shaker bij 37 °C en 150 tpm. Herhaal de stappen beschreven in stap 3.7.2-3.7.3 om de 24-uursmeting te verkrijgen. Noteer alle gegevens zoals eerder beschreven in stap 3.4.2.2 en stap 3.4.2.6.

4. Directe kweekmethode (methode C)

OPMERKING: In methode C worden bacteriën in een lag-fase zaaicultuur direct op de nanogestructureerde oppervlakken van belang geplaatst. Voor onderzoek van de antimicrobiële activiteiten van de nanostructuur volgen we een protocol beschreven door Zhang et al.14. Om deze directe kweekmethode te demonstreren, werden ZC21 (Mg-Zn-Ca-legering) en Mg-pinnen als monsters gebruikt.

  1. Voorbereiden en kweken van de bacterieculturen
    1. Maak voor elk in vitro experiment 's nachts voorraden volgens stap 2.2.1-2.2.2.
  2. Wassen en tellen van de bacteriën om de zaaidichtheid te bepalen
    OPMERKING: De gewenste zaaidichtheid van 7,5 × 105 CFU/ml werd geïdentificeerd als de gerapporteerde celconcentratie die orthopedische infecties veroorzaakt14.
    1. Haal de nachtelijke bacteriecultuur uit de incubator-shaker.
    2. Was en verzamel de bacteriën volgens stap 2.3.2-2.3.2.3, maar vervang het verse medium door herziene gesimuleerde lichaamsvloeistof (rSBF) voor elke wasstap.
      OPMERKING: rSBF is een bufferoplossing die de ionische concentratie van menselijk bloedplasma nabootst. rSBF bevat echter alleen anorganische verbindingen en heeft geen bio-organische verbindingen zoals eiwitten. Om dit op te lossen, wordt foetaal runderserum (FBS) gecombineerd met rSBF om de samenstelling van menselijk bloed te simuleren om de natuurlijke vorming van apatiet in verkalkte weefsels onder experimentele omstandigheden beter na te bootsen36.
    3. Verwijder het supernatant uit de gepelleteerde cellen. Resuspendeer de celkorrel in 1 ml rSBF aangevuld met 10% FBS-de celsuspensie.
    4. Bepaal de celsuspensieconcentratie (cellen / ml) met behulp van een hemocytometer. Verdun de celsuspensie tot een concentratie van 7,5 × 105 cellen/ml in rSBF aangevuld met 10% FBS. Maak een zaaicultuur volgens stap 2.4.1.
    5. Bepaal de werkelijke zaaidichtheid volgens stap 2.4.2.
  3. Verdeel bacteriële celsuspensie over de monsters in de kweekputten.
    1. Plaats zowel de monsters als de controlemonsters in de afzonderlijke putjes van een 48-wells, niet-weefselbehandelde polystyreenplaat.
    2. Aliquot 0,75 ml van de celsuspensie in elk putje met de monsters en controles. Plaats de 48-putplaat(en) gedurende 24 uur bij 37 °C in een incubator-shaker met schudden bij 120 tpm.
  4. Karakterisering van de bacterieconcentratie
    1. Verzamel na 24 uur incubatie de monsters en plaats ze in afzonderlijke, gelabelde verzamelbuizen.
    2. Verzamel twee monsters van elke groep en plaats ze afzonderlijk in gelabelde microcentrifugebuizen van 5,0 ml. Voeg 2 ml rSBF toe aan elke buis.
    3. Plaats de monsters die in stap 4.4.2 zijn verzameld in een ultrasoonapparaatbad en soniceer gedurende 10 minuten. Na elke periode van 5 minuten, vortex elk monster gedurende 5 s.
    4. Verzamel de rSBF met de nieuw losgemaakte bacteriële cellen en plaats de suspensie in een gelabelde, verse microcentrifugebuis.
  5. Seriële verdunningen en plating van de bacteriën
    1. Verdun en plaat de bacteriële suspensie serieel volgens stap 2.6.2-2.6.6.
  6. Evalueer de post-incubatie pH van kweekmedia door stap 2.7 te volgen.
  7. Bereid het nakweekmedium voor op ICP-OES door de methoden te volgen die worden beschreven in stap 2.8.

5. Methode voor gerichte contactblootstelling (methode D)

OPMERKING: Bij methode D worden bacteriën op een nitrocellulosefilterpapier in direct contact gebracht met een interessegebied op de nanogestructureerde oppervlakken. Deze methode minimaliseert de interferentie van bulkmonsterafbraak in bacterieculturen met de bacteriële activiteiten. Om antimicrobiële activiteiten op nano-oppervlak te onderzoeken, volgen we een protocol beschreven door Lin et al.16.

  1. Volg de procedures in stap 2.2.1-2.2.2.1 om een bacteriële zaaicultuur te maken. Bevestig de werkelijke zaaidichtheid volgens stap 2.4.2.
  2. Bereid de monsters voor tot een grootte van 1 × 1 cm2 in een vierkante vorm. Bereid alle monstertypen in drievoud voor. Plaats de monsters indien nodig op een driedimensionale (3D) houder met een diameter van 15 mm en een hoogte van 10 mm. Plaats het monster en de houder in een put van een met niet-weefselkweek behandelde polystyreenputplaat.
  3. Bereid gesteriliseerd nitrocellulosepapier door elk tot een diameter van 1 cm bij te snijden. Leg de bereide nitrocellulosepapieren op een agarplaat met het juiste medium.
  4. Pipetteer 50 μL van de verdunde bacteriecultuur op het filtreerpapier.
  5. Pipetteer 50 μL van een geschikt medium op het midden van elk monsteroppervlak.
  6. Pak met een gesteriliseerd pincet het nitrocellulosepapier van het oppervlak van de agar. Draai het nitrocellulosepapier voorzichtig om en plaats het op het monsteroppervlak, zodat de bacteriën in contact komen met de 50 μL medium en het nanogestructureerde oppervlak van belang.
  7. Voeg 1 ml Tris-buffer toe aan elk putje met een monster om de luchtvochtigheid te handhaven. Incubeer de polystyreen putplaat met alle monsters bij 37 °C gedurende 24 uur.
  8. Verzamel het nitrocellulosepapier van elk monsteroppervlak. Doe elk in 5 ml Tris-buffer. Vortex het verzamelde filterpapier en nanosurfaced materiaalmonsters voor 5 s.
  9. Soniceer elk monster gedurende 10 minuten. Vortex gedurende 5 s na 5 min en opnieuw na 10 min.
  10. Verzamel de Tris-buffersuspensies van alle monsters en plaats elk volume in afzonderlijke verse opvangbuizen.
  11. Verdun en plaat de monsters volgens stap 2.6.2-2.6.6.

6. Nacultuurkarakterisering van bacteriën en nanomaterialen

  1. Onderzoek van bacteriële adhesie en morfologie met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM)
    1. Voeg na een nachtelijke incubatie 10% glutaaraldehyde toe aan elke put van de 48-well, niet-weefselbehandelde polystyreenplaat totdat de monsters volledig zijn bedekt. Incubeer de monsters gedurende 1 uur om de bacteriële cellen te fixeren.
    2. Zuig het glutaaraldehyde op in een afvalfles en spoel alle monsters 3x af met Tris-bufferoplossing om niet-hechtende bacteriën te verwijderen.
    3. Droog de monsters uit met 30%, 75% en 100% ethanol gedurende 30 minuten per16.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een kritische puntdroger te gebruiken om de monsters te drogen. Het is niet ideaal om de monsters gedurende 24 uur bij kamertemperatuur aan de lucht te drogen.
    4. Gebruik geleidende tapes, zoals koper- of koolstoftapes, om de monsters op een SEM-stub te bevestigen. Bedek de monsteroppervlakken via een sputtercoating om geleidbaarheid te bieden voorafgaand aan de beeldvorming (bijv. Bedek Mg-platen met aangehechte bacteriën onder platina / palladium (Pt / Pd) gedurende 45 s bij 20 mA16).
      OPMERKING: De coatingmaterialen, verwerkingstijd en bewerkingsstroom kunnen variëren, afhankelijk van de monstertypen.
    5. Maak foto's van de bacteriën op de monsters met behulp van SEM met een geschikte werkafstand en versnellende spanning en met de gewenste vergrotingen. Gebruik bijvoorbeeld een SEM met een secundaire elektronendetector om beelden te maken op een werkafstand van 5 mm en een versnellingsspanning van 10 kV16.
  2. Onderzoek de oppervlaktemorfologie van nagekweekte nanomateriaalmonsters met behulp van SEM.
    1. Voor nanomaterialen was u de monsters 3x met Tris-buffer om de vrije bacteriën te verwijderen die niet aan het monster zijn bevestigd. Voor nanodeeltjes, dispergeer de deeltjes in een oplosmiddel dat de monstereigenschappen niet beïnvloedt door ultrasoonbehandeling om een betere dispersie te bereiken wanneer dat nodig is.
    2. Droog de monsters na de wasprocedure.
    3. Gebruik dubbelzijdige tapes van koolstof of koper om de monsters op de SEM-stomp te plakken.
    4. Maak een geleidende oppervlaktelaag van Pt/Pd met behulp van een sputtercoater, zoals beschreven in stap 6.1.4, voorafgaand aan de beeldvorming. Neem de voorbeeldafbeeldingen zoals beschreven in stap 6.1.5.
    5. Analyseer de elementaire samenstelling van het oppervlak met behulp van EDS met een geschikte versnellingsspanning en bij de gewenste vergrotingen (bijvoorbeeld bij 10 kV na het uitvoeren van de SEM-analyse16).
  3. Fluorescentie beeldvorming van bacteriële hechting
    1. Bereid de monsters voor om te worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie door ze eerst 3x te wassen met Tris-buffer. Droog de monsters aan de lucht bij kamertemperatuur.
    2. Bevlek elk monster met 10 μM thioflavine, T, fluorescentiekleurstof volgens het vastgestelde protocol37.
    3. Voer fluorescentiebeeldvorming uit van bacteriële hechting met behulp van een omgekeerde microscoop in combinatie met een elektronenvermenigvuldigende lading-gekoppelde digitale camera.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De identificatie van de antibacteriële activiteit van magnesiumoxide nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken is gepresenteerd met behulp van vier in vitro methoden die toepasbaar zijn op verschillende materiaalsoorten en microbiële soorten.

Methode A en methode B onderzoeken bacteriële activiteiten bij blootstelling aan nanodeeltjes in een vertragingsfase (methode A) en logfase (methode B) gedurende een duur van 24 uur of langer. Methode A geeft resultaten met betrekking tot ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben vier in vitro methoden (A-D) gepresenteerd om de antibacteriële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te karakteriseren. Hoewel elk van deze methoden de groei en levensvatbaarheid van bacteriën in de loop van de tijd kwantificeert als reactie op nanomaterialen, bestaat er enige variatie in de methoden die worden gebruikt om de initiële bacteriële zaaidichtheid, groei en levensvatbaarheid in de loop van de tijd te meten. Drie van deze methoden, de directe cocultuurmethode (A)...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs waarderen de financiële steun van de Amerikaanse National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 en NSF PIRE 1545852), de National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship, de Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) en de UC-Riverside Graduate Research Mentorship Program Grant toegekend aan Patricia Holt-Torres. De auteurs waarderen de hulp van de Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) bij UC-Riverside voor het gebruik van SEM / EDS en Dr. Perry Cheung voor het gebruik van XRD. De auteurs willen ook Morgan Elizabeth Nator en Samhitha Tumkur bedanken voor hun hulp bij de experimenten en data-analyses. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen in dit artikel zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation of de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeMilipore SigmaZ336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven MTI CorporationBPG-7082https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer Sigma-Aldrich 42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADEFisher Scientific50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera HamamatsuC9100-13
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific14-959-49B
GluteraldehydeSigma-Aldrich G5882
HemocytometerBrightline, Hausser Scientific1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES)PerkinElmer8000
Inverse microscopeNikonEclipse Ti-S
Luria Bertani BrothSigma Life Science L3022
Luria Bertani Broth + agarSigma Life Science L2897
MacroTube 5.0  Benchmark ScientificC1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticlesUS Research Nanomaterials, IncStock #: US3310   MMgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro BalanceMettler ToledoMS105D
Nitrocellulose paperFisherbrand09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plateFalcon Corning Brand 351172
Petri dish 100 mmVWR470210-568
Petri dish, 15 mmFisherbrandFB0875713A
pH meterVWRSP70P
Scanning electron microscopy (SEM)TESCAN Vega3 SBH
SonicatorVWR97043-936
Table top centrifugeFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Table top centrifuge EppendorfCentrifuge 5430
Tryptic Soy AgarMP1010617
Tryptic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G
UV-Vis spectrophotometer TecanInfinite 200 PROhttps://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10LVWRN/A
X-ray power defraction PanalyticalN/APANalytical Empyrean Series 2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19(2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441(2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260(2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54(2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41(2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074(2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555(2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178(2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066(2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Antimicrobial NanoparticlesNanostructured SurfacesIn Vitro EvaluationMinimum Inhibitory ConcentrationBactericidal ConcentrationDirect Co CultureSerial DilutionBacterial ViabilityMagnesium Oxide NanoparticlesMRSA Antimicrobial Activity

Gerelateerde artikelen