Geoptimaliseerde methoden voor de oppervlakte-immobilisatie van collagenen en collageenbindingstesten

Summary

Dit werk presenteert een geoptimaliseerd protocol om type I en III collageen reproduceerbaar te immobiliseren en te kwantificeren op microplaten, gevolgd door een verbeterd in vitro bindingstestprotocol om interacties tussen collageen en verbindingen te bestuderen met behulp van een tijdopgeloste fluorescentiemethode. De daaropvolgende stapsgewijze gegevensanalyse en gegevensinterpretatie worden verzorgd.

Abstract

Fibrose komt voor in verschillende weefsels als een herstellende reactie op letsel of schade. Als fibrose echter buitensporig is, kan het leiden tot weefsellittekens en orgaanfalen, wat gepaard gaat met hoge morbiditeit en mortaliteit. Collageen is een belangrijke aanjager van fibrose, waarbij type I en type III collageen de primaire typen zijn die betrokken zijn bij veel fibrotische ziekten. In tegenstelling tot conventionele protocollen die worden gebruikt om andere eiwitten te immobiliseren (bijv. elastine, albumine, fibronectine, enz.), zijn uitgebreide protocollen om verschillende soorten collageen reproduceerbaar te immobiliseren om stabiele coatings te produceren, niet direct beschikbaar. Het immobiliseren van collageen is verrassend uitdagend omdat meerdere experimentele omstandigheden de efficiëntie van immobilisatie kunnen beïnvloeden, waaronder het type collageen, de pH, de temperatuur en het type microplaat dat wordt gebruikt. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven om collageen type I en III reproduceerbaar te immobiliseren en te kwantificeren, wat resulteert in stabiele en reproduceerbare gels/films. Bovendien laat dit werk zien hoe in vitro tijdopgeloste fluorescentiebindingsstudies kunnen worden uitgevoerd, geanalyseerd en geïnterpreteerd om de interacties tussen collagenen en kandidaat-collageenbindende verbindingen te onderzoeken (bijv. een peptide geconjugeerd aan een metaalchelaat dat bijvoorbeeld europium [Eu(III)] draagt). Een dergelijke benadering kan universeel worden toegepast op verschillende biomedische toepassingen, waaronder het gebied van moleculaire beeldvorming om gerichte beeldvormingssondes, geneesmiddelenontwikkeling, celtoxiciteitsstudies, celproliferatiestudies en immunoassays te ontwikkelen.

Introduction

De ophoping van fibreus bindweefsel als onderdeel van het natuurlijke wondgenezingsproces na weefselbeschadiging staat bekend als fibrose. Als de afzetting van fibreus weefsel echter niet eindigt en langer doorgaat dan wat nodig is voor weefselherstel, wordt fibrose buitensporig ^1,2. Overmatige fibrose schaadt de fysiologie en functie van organen en kan leiden tot orgaanschade en mogelijk orgaanfalen ^3,4,5. Twee belangrijke aanjagers van fibrose zijn de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten collageen type I en type III⁶. Collageen is een structureel eiwit dat in verschillende organen wordt aangetroffen en dat ongeveer een derde van het totale eiwitgehalte van het menselijk lichaam uitmaakt¹. Er zijn 28 verschillende soorten collagenen geïdentificeerd door sequencing van het menselijk genoom, en de meest voorkomende zijn de fibrillaire collagenen⁷. Het primaire fibrillaire collageen is type I collageen, dat de ECM voorziet van treksterkte en weerstand tegen vervorming⁸. Type III collageen is een structurele component die zorgt voor elasticiteit en colocaliseert met type I collageen. Het wordt tot expressie gebracht tijdens de embryogenese en wordt van nature in kleine hoeveelheden aangetroffen in de huid, spieren en bloedvaten^{van volwassenen 9}.

In vivo collageensynthese begint met een intracellulair proces waarbij mRNA wordt getranscribeerd in de kern en vervolgens naar het cytoplasma gaat, waar het wordt vertaald. Na translatie ondergaat de gevormde keten posttranslationele modificatie in het endoplasmatisch reticulum, waar procollageen (de voorloper van collageen) wordt gevormd. Pro-collageen reist vervolgens naar het Golgi-apparaat voor de laatste wijziging voordat het wordt uitgescheiden naar de extracellulaire ruimte¹⁰. Door proteolytische splitsing wordt pro-collageen omgezet in tropocollageen. Dit wordt vervolgens verknoopt, hetzij via een enzymatisch-gemedieerde verknopingsroute die wordt gekatalyseerd door het enzym lysyloxidase (LOX), hetzij via een niet-enzymatisch-gemedieerde verknopingsroute waarbij de Maillard-reactie¹¹ betrokken is. In vitro protocollen om collageen te immobiliseren zijn voornamelijk gebaseerd op het vermogen van collageen om zichzelf te assembleren. Collageen wordt gewonnen uit weefsels op basis van de oplosbaarheid, die grotendeels afhangt van de mate van verknoping van individuele collageenfibrillen⁷. Fibrillair collageen wordt opgelost in azijnzuur en fibrillen kunnen zich hervormen wanneer de pH en temperatuur worden aangepast¹². In vitro kan de fibrillogenese van collageen worden gezien als een proces in twee fasen⁷. De eerste fase is de nucleatiefase, waarin collageenvezels dimeren en trimeerfibrillen vormen voordat ze worden herschikt om een drievoudige spiraalvormige structuur te vormen. De tweede fase is de groeifase, waarbij de fibrillen lateraal beginnen te groeien en resulteren in de karakteristieke D-bandvorming, die over het algemeen wordt waargenomen door veranderingen in troebelheid⁷. Studies met atoomkrachtmicroscopie (AFM) hebben ook aangetoond dat collageen type I en type III verschillende kenmerken hebben (tabel 1)¹³.

Om de bindingsinteracties tussen collageen en andere verbindingen te bestuderen, moet collageen reproduceerbaar worden geïmmobiliseerd in de putjes van microplaten. Er zijn verschillende protocollen voor het immobiliseren van oplosbaar collageen 14,15,16. In de handel verkrijgbare microplaten die vooraf zijn gecoat met collageen worden meestal gebruikt voor celkweek. Voorgecoate microplaten hebben echter een zeer dunne laag van een onbekende hoeveelheid collageen die op de putjes is aangebracht, waardoor ze ongeschikt zijn voor in vitro bindingstesten. Er zijn verschillende uitdagingen bij het immobiliseren van collageen op de plaatputten. Een van de belangrijkste uitdagingen is het kiezen van een geschikt type microtiterplaat, omdat verschillende soorten collagenen (bijv. type I en III) verschillende chemische eigenschappen hebben en daarom stabieler en effectiever immobiliseren, afhankelijk van het materiaal van de microtiterplaat. Een andere uitdaging zijn de experimentele omstandigheden van het immobilisatieprotocol, aangezien het proces van fibrillogenese afhangt van meerdere factoren, waaronder temperatuur, pH, de voorraadconcentratie van collageen en de ionische concentratie van de buffer⁷.

Voor het bestuderen van de interacties tussen het collageen (het doelwit) en andere verbindingen (d.w.z. een targetingpeptide), is het ook noodzakelijk om een robuuste screeningstest te ontwikkelen om de specificiteit en selectiviteit van de verbinding in de richting van het doelwit te onderzoeken door de dissociatieconstante, K_d, te meten. De positie van het evenwicht van de vorming van een bimoleculair complex tussen een eiwit (collageen) en een ligand wordt uitgedrukt in termen van de associatieconstante K_a, waarvan de grootte evenredig is met de bindingsaffiniteit. Meestal drukken biochemici echter affiniteitsrelaties uit in termen van de evenwichtsdissociatieconstante, K_d, van het bimoleculaire complex, dat wordt gedefinieerd als K_d = 1/K_a (K_d en is het omgekeerde van K_a). Hoe lager de K_d-waarde, hoe sterker de bindingssterkte tussen het eiwit en de ligand. Het voordeel van het gebruik van K_d om de bindingsaffiniteit van verschillende liganden voor hetzelfde eiwit (en andersom) te vergelijken, houdt verband met het feit dat de eenheden van K_d voor een bimoleculair complex mol/L zijn (d.w.z. concentratie-eenheid). Onder de meeste experimentele omstandigheden komt de K_d-waarde overeen met de ligandconcentratie die leidt tot 50% verzadiging van de beschikbare bindingsplaatsen op het doelwit bij het evenwicht^17,18. De dissociatieconstante wordt meestal geëxtraheerd door analyse van de fractionele bezetting (FO) van de receptor, die wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de bezette bindingsplaatsen en de totale beschikbare bindingsplaatsen, als functie van de ligandconcentratie. Dit kan worden gedaan op voorwaarde dat er een analytische test beschikbaar is die in staat is om de hoeveelheid gebonden ligand te onderscheiden en te meten.

In vitro ligandbindingstesten kunnen worden uitgevoerd met behulp van verschillende bioanalytische methoden, waaronder optische fotometrie, radioligandmethoden, inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS) en oppervlakteplasmonresonantie (SPR). Van de fotometrische methoden vereisen die op basis van fluorescentie-emissie doorgaans de labeling van liganden of eiwitten met fluoroforen om de gevoeligheid te verhogen en de detectielimiet van de test te verbeteren. Chelaten van bepaalde lanthanide(III)-ionen, zoals Eu(III), zijn zeer aantrekkelijk als fluoroforen omdat ze grote Stokes-verschuivingen, smalle emissiebanden (die een goede signaal-ruisverhouding bieden), beperkte fotobleken en een lange emissielevensduur hebben. Belangrijk is dat deze laatste eigenschap het gebruik van tijdopgeloste fluorescentie (TRF) van Eu(III)-fluoroforen mogelijk maakt om achtergrondautofluorescentie¹⁹ op te heffen. In de dissociatie-versterkte lanthanide fluorescerende immunoassay (DELFIA)-versie van de op Eu(III) gebaseerde TRF-assay worden liganden gelabeld met een niet-lichtgevend Eu(III)-chelaat geïncubeerd met de receptor geïmmobiliseerd op microtiterplaten. Het gelabelde ligand/receptorcomplex wordt gescheiden van het ongebonden ligand en Eu(III)-fluorescentie wordt geactiveerd door dissociatie van het Eu(III)-complex bij een zure pH, gevolgd door hercomplexatie met een fluorescentieversterkende chelator om een in de micel ingebedd, zeer fluorescerend Eu(III)-complex te vormen²⁰.

De decomplexatiestap kan redelijk worden bereikt met chelatoren, zoals diethyleentriaminepentaacetaat (DTPA), die een snelle decomplexatiekinetiek vertonen. Eu(III)-complexen met bepaalde macrocyclische chelatoren, zoals DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecaan1,4,7,10-tetra-azijnzuur) en zijn monoamidederivaten (DO3AAm), vertonen echter een hoge thermodynamische stabiliteit en een zeer hoge kinetische inertie. In dit geval moeten de decomplexatiestappen nauwkeurig worden geoptimaliseerd om voldoende en reproduceerbare activering van op Eu(III) gebaseerde TRF²¹ te bereiken. Het is vermeldenswaard dat lanthanide (Ln(III))-DOTA- en Ln(III)-DO3AAm-complexen het meest worden gebruikt als contrastmiddelen voor in vivo moleculaire beeldvorming door middel van magnetische resonantiebeeldvorming (MRI)-technieken²². De op Ln(III) gebaseerde TRF-assay is dus het instrument bij uitstek om in vitro de bindingsaffiniteit van moleculaire MRI-sondes met hun beoogde biologische doelen te bestuderen. Momenteel ontbreken uitgebreide en reproduceerbare protocollen voor het immobiliseren van type I en type III collageen en een reproduceerbare pijplijn voor het uitvoeren van in vitro bindende Eu(III) TRF-experimenten. Om deze beperkingen te overwinnen, werden reproduceerbare methoden ontwikkeld om type I en type III collageen zelf te assembleren en te immobiliseren en om respectievelijk stabiele gels en films te genereren met de voldoende concentratie collageen die nodig is voor in vitro bindingstesten. Een geoptimaliseerd protocol voor Eu(III) TRF van zeer inerte Eu(III)-DO3Aam-gebaseerde complexen wordt gepresenteerd. Ten slotte wordt een geoptimaliseerde in vitro microtiterplaat Eu(III) TRF-test gedemonstreerd om de K_d van Eu(III)-gelabelde liganden te meten in de richting van geïmmobiliseerd type I en type III collageen (Figuur 1).

Protocol

OPMERKING: Alle productinformatie die voor dit werk is gebruikt, wordt weergegeven in de materiaaltabel.

1. Immobilisatie van collageen

OPMERKING: Zorg ervoor dat elk putje in de microplaat die tijdens de bindingstest wordt gebruikt, aangrenzende putjes vrij heeft om kruisfluorescentie te voorkomen. Voer dit deel van het protocol op ijs uit, omdat collageen zichzelf assembleert bij stijgende temperaturen en pH-waarden. Voer deze procedure uit in een weefselkweekkap en onder steriele omstandigheden, omdat de microplaten vervolgens worden geïncubeerd in een weefselkweekincubator (TC).

1. Immobilisatie van type I collageen op de microplaten met 96 putjes (Figuur 2)
   Dag 1
   1. Bereid een siliconen bakje met ijs voor. Plaats de injectieflacon met type I collageen, de koude 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en de microplaten op ijs en besproei alles met 70% ethanol. Plaats het materiaal onder de TC-kap.
   2. Neutraliseer het collageen met gelijke hoeveelheden type I collageen en 10x PBS (pH 7,4).
   3. Keer de oplossing een paar keer om en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
   4. Voeg 100 μL van het geneutraliseerde collageen toe aan elke andere put en elke andere rij van de microplaat en incubeer bij 37 °C gedurende 18-20 uur om het collageen droog te verdampen.
      Dag 2
   5. Was de microplaten twee keer met 100 μL 1x PBS, pH 7,4, om eventueel ongebonden collageen te verwijderen.
   6. Breng de microplaten nog 2 uur over in de incubator bij 37 °C om te drogen voordat u ze gebruikt voor verdere bindingsexperimenten.
2. Immobilisatie van collageen type III op de microplaten met 96 putjes (Figuur 3)
   Dag 1
   1. Bereid een siliconen bakje met ijs voor. Plaats de injectieflacon met type III collageen, de koude 10x PBS en de microplaten op ijs en besproei alles met 70% ethanol. Plaats het materiaal onder de TC-kap.
   2. Neutraliseer het collageen met gelijke hoeveelheden collageen type III en 10x PBS (pH 7,4).
   3. Voeg 70 μL van het geneutraliseerde collageen toe aan elke andere put en elke andere rij van de microplaat en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C door de microplaat onder de weefselkweekkap te plaatsen om het collageen droog te verdampen.
      Dag 2
   4. Was de microplaten twee keer met 70 μL 1x PBS, pH 7,4, om eventueel ongebonden collageen te verwijderen.
   5. Breng de microplaten gedurende 1 uur bij 37 °C over in de incubator, leg de microplaten vervolgens op de bank en laat 1 uur drogen voordat u ze gebruikt voor verdere bindingsexperimenten.

2. Beoordeling van de stabiliteit van de geïmmobiliseerde collageengels/-films

1. Incubatie met PBS gedurende 1 uur
   OPMERKING: Incubeer tijdens het bindingsexperiment het geïmmobiliseerde collageen met de betreffende verbinding. Het is belangrijk om de stabiliteit van de resulterende collageengel of -film te onderzoeken. Om dit te doen, meet u de stabiliteit van drie omstandigheden: geen wassen = meet het geïmmobiliseerde collageen direct na incubatie; wassen = meet het geïmmobiliseerde collageen na twee keer wassen van de plaat met 100 μL PBS; en 1 uur PBS mimic & wash = meet het geïmmobiliseerde collageen na 1 uur incubatie met PBS, gevolgd door twee wasbeurten met PBS. Hieronder wordt de PBS-incubatiemethode uitgelegd.
   1. Voeg 70 μL PBS (1x) toe aan elk van de met collageen beklede putjes en incubeer de microplaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   2. Zuig de overtollige vloeistof uit elk putje op met behulp van een pipet en was tweemaal met PBS (1x) voordat u de hieronder beschreven eiwitkwantificeringstest uitvoert.
2. Kwantificering van de hoeveelheid geïmmobiliseerd collageen met behulp van een bicinchoninezuurtest (BCA)
   OPMERKING: Gebruik de Pierce BCA Protein Assay Kit (materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. Maak respectievelijke collageennormen voor deze test. Het concentratiebereik voor collageen I is van 0-3.000 μg/ml en voor collageen III van 0-750 μg/ml. Maak in totaal 11 standaarden per collageen.
   1. Bereid het totale volume van het benodigde werkreagens (WR) voor volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Voeg 25 μL van elk van de collageenstandaard toe aan de microplaatputjes (in tweevoud). Deze oplossingen worden gebruikt om de standaardcurve te tekenen.
   3. Voeg 200 μl werkende reagensoplossing toe aan elk van de putjes met de standaarden en de putjes die bedekt zijn met onbekende concentraties collageen.
   4. Plaats de microplaat gedurende 30 s op een bordschudder. Dek de microplaten af en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
   5. Verwijder de microplaten en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Meet de extinctie bij 560 nm met behulp van een plaatlezer.
   6. Zet een kalibratiecurve uit door de A₅₆₀ (AU) uit te zetten tegen de concentratie (μg/ml) van de 11 standaardoplossingen en gebruik de kalibratiecurve om de hoeveelheid collageen te berekenen.

3. Europium(III) TRF-ligandbindingstest (figuur 1)

OPMERKING: De gebruikte verbinding is een kandidaat-collageenbindend peptide (CBP) gelabeld met een enkel Eu(III)-DO3AAm-complex, aangeduid als Eu(III)-DO3AAm-CBP (Figuur 4).

1. Incubatie van de met collageen beklede platen met de Eu(III)-DO3AAm-CBP-verbinding
   1. Bereid oplossingen van de Eu(III)-DO3AAm-CBP-verbinding met concentraties tussen 0,1-15 μM (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 3 μM, 5 μM, 7 μM, 10 μM en 15 μM) in 1x PBS.
   2. Voeg 75 μl van elke concentratie van de verbinding toe aan de met collageen beklede putjes (plaat A). Voer het experiment in drievoud uit om de hoeveelheid verbinding te berekenen die zich aan het collageen bindt.
   3. Gebruik een tweede ongecoate plaat (plaat B) en voeg 75 μl van elke verbinding toe aan de lege putjes om de niet-specifieke binding van de verbinding aan de plaat te berekenen. Gebruik drievouden voor elke concentratie.
   4. Incubeer de microplaten gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   5. Zuig met een pipet de overtollige oplossing uit elk putje op en gooi deze weg, en was de putjes twee keer met 1x PBS om overtollige, ongebonden verbinding te verwijderen. Voer deze stap uit met behulp van zowel de met collageen beklede als de ongecoate microplaten.
   6. Voeg aan een derde ongecoate plaat (plaat C) 10 μl van hetzelfde bereik van Eu(III)-DO3AAm-CBP-concentraties (in tweevoud) toe. Gebruik de fluorescentiewaarde van de Eu(III)-DO3AAm-CBP in oplossing om een kalibratiecurve te maken.
      NOTITIE: Was of zuig de oplossing niet van deze plaat.
2. Zuurextractie van Europium(III) en tijdopgeloste fluorescentie (TRF) metingen
   OPMERKING: Raadpleeg de aanvullende informatie over de bereiding en kalibratie van de volumes van de zure oplossing (AS) en de bufferoplossing (BS). De volumes van de AS en BS die nodig waren om reproduceerbaar een optimale pH te bereiken, waren in dit werk respectievelijk 54 μL en 46 μL. Voer de volgende handeling uit op plaat A, plaat B en plaat C.
   1. Voeg 54 μL zure oplossing (AS) toe aan elk putje en plaats de plaat 90 minuten in de incubator bij 37 °C, waarbij u de microplaten afdekt met folie om verdamping te voorkomen. De temperatuur en incubatietijd moeten zorgvuldig worden gecontroleerd om een reproduceerbare decomplexatie te bereiken.
   2. Voeg 46 μL bufferoplossing (BS) toe aan elk putje en schud de plaat voorzichtig gedurende 30 s.
   3. Voeg 100 μL verbeteringsoplossing (ES) toe en schud de plaat gedurende 30 s.
   4. Wacht 30 minuten voordat u de plaat leest met behulp van een TRF-plaatlezer. Gebruik de parameters in tabel 2.

4. Gegevensanalyse

1. Kwantificering van de concentratie van geïmmobiliseerd collageen op de putten
   1. Verkrijg de vergelijking van de kalibratiecurve van de A₅₆₀ (AU) versus de concentratie (μg/ml) van de 11 standaardoplossingen.
      1. Gebruik de absorptiemetingen die zijn verkregen uit de putjes die de collageenstandaarden bevatten.
      2. Maak een tabel van de gemiddelde waarden van de dubbele putjes en zet de gemiddelde extinctie uit tegen de bekende eiwitconcentraties (collageen) (μg/ml) om de vergelijking voor de standaardcurve te verkrijgen.
   2. Gebruik de extinctiewaarden om de massa (μg) en concentratie (M) van geïmmobiliseerd collageen te berekenen.
      1. Bereken de gemiddelde extinctiewaarden over de drie putjes die geïmmobiliseerd collageen bevatten en noteer de standaarddeviatie.
      2. Gebruik de standaardcurvevergelijking die is verkregen uit de standaardcurve van collageen (stap 2.2.6) om de extinctie die is gemeten van de met collageen beklede putjes om te zetten in overleg. Bereken hieruit de concentratie collageen die in de experimentele putjes was geïmmobiliseerd in μg/ml.
      3. Zet de in stap 4.1.2.2 berekende concentratie (μg/ml) eerst om in gram/liter en vervolgens, op basis van het molecuulgewicht van het collageen, in molair (M).
      4. Bereken ten slotte de massa van het collageen dat in elk putje is geïmmobiliseerd door de concentratie te delen door het volume collageen dat aan het putje is toegevoegd (100 μL voor type I collageen en 70 μL voor type III collageen).
2. Berekening van de dissociatieconstante (K_d) (Figuur 4)
   1. Extraheer de fluorescentiemetingen.
      1. Exporteer de fluorescentiemetingen van de plaatlezer naar een spreadsheet.
         OPMERKING: Bij bindingstesten is het belangrijk om rekening te houden met de mogelijke niet-specifieke binding van een verbinding aan het plastische oppervlak van de platen.
      2. Bereken de gemiddelde waarden van de drievoudige metingen van elke samengestelde concentratie voor de drie verschillende platen: de specifieke bindingswaarden van de gecoate putjes (plaat A), de niet-specifieke binding van de ongecoate putjes (plaat B) en de totale hoeveelheid Eu(III)-DO3AAm-CBP in oplossing in de niet-gecoate putjes (plaat C).
      3. Bepaal de fluorescentiewaarden voor de gebonden verbinding door de fluorescentiemetingen van de ongecoate putjes (plaat B) af te trekken van die van de gecoate putjes (plaat A).
         Vergelijking 1: Bepaling van de gebonden fluorescentie¹⁷:
         Gebonden fluorescentie = specifiek (beklede putjes) - Niet specifiek (ongecoate putjes)
      4. Genereer een kalibratiecurve met behulp van de metingen van de Eu(III)-gelabelde verbinding in oplossing (plaat C). Zet de verkregen fluorescentiewaarden af tegen de concentratie van de met Eu(III) gelabelde verbinding. Voer een lineaire regressie-fit uit.
   2. Zet de fluorescentiewaarden om naar concentraties.
      1. Zet de meetwaarden van de gebonden fluorescentie (stap 4.2.3) om in concentratie met behulp van de standaard fluorescentiecurve op basis van de gegevens die zijn gegenereerd met behulp van de concentraties van de verbindingen in oplossing (stap 4.2.1.4).
         OPMERKING: Bij het vergelijken van de bindingseigenschappen van een verbinding met verschillende doeleiwitten die bij verschillende concentraties immobiliseren, moet met dit laatste rekening worden gehouden bij het berekenen van de hoeveelheid verbinding die aan het doelwit is gebonden (d.w.z. gebonden verbinding/eiwit).
      2. Deel de concentratie van de gebonden verbinding door de concentratie van het eiwit dat in de put is geïmmobiliseerd.
         OPMERKING: Gebruik voor deze berekening de concentratie geïmmobiliseerd collageen die werd berekend nadat de putjes gedurende 1 uur met PBS waren geïncubeerd (zogenaamd PBS-nabootsingsexperiment; sectie 2.1 hierboven). Dit is om rekening te houden met mogelijke verliezen van collageen tijdens de incubatiestap en wasstap die niet bijdragen aan het uiteindelijke fluorescentiesignaal.
      3. Zet de gegevens uit met behulp van een spreidingsdiagram met de concentraties van de verbinding op de x-as (μM) en de gebonden verbinding/eiwit op de y-as.
   3. Verkrijg de K_d-waarden .
      1. Pas de gegevens die zijn verkregen in stap 4.2.2.3 aan met behulp van twee mogelijke kinetische bindingsmodellen: binding op één plaats en binding op één plaats met een heuvelhelling. De vergelijkingen voor elk model worden weergegeven in figuur 6.
      2. Kies het model dat een niet-dubbelzinnige pasvorm biedt met de hoogste R-kwadraatwaarde bij het passen van de gegevens.
      3. Sluit de uitschieters(en) uit voor elke set fluorescentiemetingen per concentratie per plaat.
      4. Bereken de uiteindelijke K_d-waarde en presenteer de gegevens als het gemiddelde ± standaarddeviatie van onafhankelijke experimenten.
         OPMERKING: Voor robuuste resultaten voert u drievoudige metingen uit binnen elke plaat en ten minste drie onafhankelijke experimenten met verschillende microplaten.
   4. Bereken de fractionele bezetting (FO).
      OPMERKING: Uit vergelijking 2 is de concentratie van het doel onbekend, en daarom ontstaat er door gebruik te maken van algebra en de K_d, uit vergelijking 3, een werkbare vergelijking voor het berekenen van de fractionele bezetting in de vorm van vergelijking 4.
      Vergelijking 2: Definitie van fractionele bezetting¹⁷:
      
      Vergelijking 3: De dissociatieconstante, K_d, dat is de concentratie waarbij de verbinding 50% van het doel inneemt bij evenwicht¹⁷:
      
      Vergelijking 4: Herschikte vergelijking om de FO-vergelijking^{te berekenen 17}:
      
      1. Bereken de FO aan de hand van de onafhankelijke K_d-waarden die voor elke afzonderlijke plaat zijn verkregen. Zet de resultaten, het gemiddelde en de standaarddeviaties van de FO af tegen de concentratie van de verbinding.
      2. Rapporteer de FO met waarden variërend van 0 tot 1 of als een percentage met waarden variërend van 0%-100%.

Results

Beoordeling van de stabiliteit en concentratie van type I en type III collageen geïmmobiliseerd in gels/films
De kwantificering van de geïmmobiliseerde collageenconcentratie per putje werd uitgevoerd aan de hand van drie verschillende omstandigheden: a) in putjes zonder te wassen met PBS na immobilisatie van de eiwitten (niet wassen); b) in putjes met een wasstap (tweemaal met PBS) na immobilisatie om ongecoat eiwit te verwijderen; c) in putten na incubatie met PBS ge...

Discussion

Dit werk presenteert een reproduceerbare methode voor het immobiliseren van collageen type I en type III. Het demonstreert ook een protocol voor het verkrijgen, analyseren en interpreteren van in vitro Eu(III) TRF-bindingsgegevens om de bindingseigenschappen van een kandidaat-ligand ten opzichte van type I en III collageen te karakteriseren. De hier gepresenteerde protocollen voor het immobiliseren van type I en type III collageen zijn ontwikkeld en geoptimaliseerd op basis van ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Gibco	14200075	Gebruik dit om 1x PBS te maken door verdunning in water (1:10)
10x PBS	Gibco	14200075	Gebruik dit om 1x PBS te maken door verdunning in water (1:10)
2M HCL			Gemaakt in huis en details staan in het ondersteunende document
2M HCL			Gemaakt in huis en details staan in het ondersteunende document
2M Sodium hydroxide +2M Glycine			Gemaakt in huis en details staan in het ondersteunende document
2M Sodium hydroxide +2M Glycine			Gemaakt in huis en details staan in het ondersteunende document
Cell-star 96 well  microplate	Greiner Bio-One	655 160
Cell-star 96 well  microplate	Greiner Bio-One	655 160
DELFIA enhacement solution	Perkin Elmer	1244-104
DELFIA enhacement solution	Perkin Elmer	1244-104
Ice
Ice
Infinite 200 PRO NanoQuant microplate reader	TECAN
Infinite 200 PRO NanoQuant microplate reader	TECAN
Non-binding (NBS) 96 well microplates	Corning	3641
Non-binding (NBS) 96 well microplates	Corning	3641
pH electrode Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH electrode Inlab Routine	Mettler Toledo	51343050
pH meter (sevenCompact)	Mettler Toledo
pH meter (sevenCompact)	Mettler Toledo
Pierce BCA protein assay kit	Thermofisher	23227
Pierce BCA protein assay kit	Thermofisher	23227
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2)
Type I bovine collagen, 3 mg/mL	Corning	354231
Type III human placenta collagen, 0.99 mg/mL	Advanced Biomatrix	5021