Methodenartikel

Op CRISPR gebaseerde strategie in één stap voor endogene gentagging in Drosophila melanogaster

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64729

⸱

26 januari 2024

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, 3Michigan Neuroscience Institute Affiliate, University of Michigan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een vereenvoudigd endogene gentagging-protocol voor Drosophila, dat gebruik maakt van een op PCR gebaseerde techniek voor markervrije identificatie van succesvolle genetische modificaties, waardoor de ontwikkeling van stabiele knock-in-lijnen wordt vergemakkelijkt.

Samenvatting

De studie van subcellulaire lokalisatie, dynamiek en regulatie van eiwitten in levende cellen is ingrijpend getransformeerd door de komst van technieken die het mogelijk maken om endogene genen te labelen om fluorescerende fusie-eiwitten te produceren. Deze methoden stellen onderzoekers in staat om eiwitgedrag in realtime te visualiseren, wat waardevolle inzichten oplevert in hun functies en interacties binnen de cellulaire omgeving. Veel huidige onderzoeken naar het taggen van genen maken gebruik van een proces in twee stappen waarbij zichtbare markers, zoals veranderingen in de oogkleur, worden gebruikt om genetisch gemodificeerde organismen in de eerste stap te identificeren en de zichtbare marker in de tweede stap wordt weggesneden. Hier presenteren we een eenstapsprotocol om nauwkeurige en snelle endogene gentagging uit te voeren in Drosophila melanogaster, waardoor screening op gemanipuleerde lijnen mogelijk is zonder de zichtbare oogmarker, wat een aanzienlijk voordeel biedt ten opzichte van eerdere methoden. Om te screenen op succesvolle gen-tagging-gebeurtenissen, gebruiken we een op PCR gebaseerde techniek om individuele vliegen te genotyperen door een klein segment van hun middenpoot te analyseren. Vliegen die aan de screeningscriteria voldoen, worden vervolgens gebruikt om stabiele bestanden te produceren. Hier beschrijven we het ontwerp en de constructie van CRISPR-bewerkingsplasmiden en methoden voor het screenen en bevestigen van gemanipuleerde lijnen. Samen verbetert dit protocol de efficiëntie van endogene gentagging in Drosophila aanzienlijk en maakt het studies van cellulaire processen in vivo mogelijk.

Inleiding

Fluorescerende eiwitten zijn naar voren gekomen als krachtige hulpmiddelen voor het visualiseren van eiwitlokalisatie, dynamiek en eiwit-eiwitinteracties in cellen in levende organismen 1,2. Het taggen van endogene genen met fluorescerende eiwitten maakt langdurige live beeldvorming van cellulaire processen met subcellulaire resolutie mogelijk. Bovendien hebben deze endogene gen-labelingtechnieken verschillende voordelen ten opzichte van overexpressie- en immunokleuringsbenaderingen. Overexpressie van eiwitten kan bijvoorbeeld leiden tot verkeerde eiwitvouwing, niet-specifieke eiwit-eiwitinteracties en verkeerde lokalisatie3. Tot op heden zijn onderzoekers in staat geweest om enorme bibliotheken van endogene genen te creëren die zijn gefuseerd met fluorescerende eiwitten voor een paar modelorganismen, zoals ontluikende gist, die efficiënte homologe recombinatie kunnen ondergaan4. In het geval van Drosophila melanogaster zijn verschillende hulpmiddelen zoals MiMIC's5, op transposon gebaseerde enhancervallen6 en fosmiden7 bedacht om genen fluorescerend te labelen.

De ontwikkeling van op CRISPR-Cas9 gebaseerde tools heeft het mogelijk gemaakt om genoombewerking, inclusief het taggen van endogene eiwitten, efficiënt uit te voeren in een breed scala aan modelorganismen 8,9. Cas9 is een RNA-geleid enzym dat dubbelstrengs DNA op een zeer efficiënte en specifieke manier splitst8, dat vervolgens kan worden gerepareerd door een niet-homologe eindverbinding (NHEJ) -route die leidt tot puntmutaties of -deleties. Als alternatief maakt de homologie-directed repair (HDR)-route de integratie van heteroloog DNA in het chromosoom mogelijk.

Eerdere methoden voor op CRISPR gebaseerde gentagging in het modelorganisme, Drosophila melanogaster, waren gebaseerd op een tweestapsproces 10,11,12. Dit omvat het gebruik van een waarneembare oogkleurmarkering, Dsred, om succesvolle HDR-gebeurtenissen te detecteren. Daarna zou de Dsred-marker worden weggesneden met behulp van het Cre/loxP-recombinatiesysteem. Om dit proces te stroomlijnen en te versnellen, presenteren we hier een eenvoudigere en efficiëntere methode. Deze aanpak omzeilt de noodzaak van dodelijke genotypering en maakt de directe screening van individuele vliegen mogelijk. In het bijzonder gebruiken we een op PCR gebaseerde benadering om DNA te extraheren uit een klein segment van de middelste poot van de vlieg, waardoor we individuele vliegen kunnen genotyperen. Deze procedure brengt met name de vitaliteit, beweging of voortplantingsmogelijkheden van de bemonsterde vlieg niet in gevaar. Alleen de geschikte individuen, die via deze methode worden geïdentificeerd, worden verder ontwikkeld tot stabiele bestanden.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van fluorescerende eiwitgelabelde vliegen waarin endogene genen worden gelabeld met fluorescerende reporters. Deze techniek maakt gebruik van CRISPR-Cas9-genoombewerking om elke gewenste fluorofoortag te fuseren met de N- of C-terminal van een endogeen gen. Hieronder beschrijven we het ontwerp en de constructie van gRNA-plasmiden en een donorplasmide, een eenstapsscreeningsstrategie om CRISPR-positieve vliegen te selecteren en stappen om stabiele lijnen vast te stellen. In het bijzonder beschrijven we strategieën om een endogene kernklok Drosophila-gen, punt uit, te labelen met een fluorofoor aan de C-terminal. We beschrijven ook kort de controle-experimenten die moeten worden uitgevoerd om te bevestigen dat het gelabelde eiwit functioneel is en live-imaging-technieken om het periode-eiwit te visualiseren in levende klokneuronen in intacte Drosophila-hersenen 13. Het hier beschreven protocol is ook breed toepasbaar om kandidaten te screenen op deleties en inserties van specifieke stukjes DNA door CRISPR-Cas9 genoombewerking.

Protocol

1. Ontwerp en constructie van reagentia voor het bewerken van genen

OPMERKING: Om endogene tagging uit te voeren, is het essentieel om de verschillende isovormen van het gewenste gen te identificeren. Afhankelijk van de specifieke doelen van het experiment kan een fluorescerende tag worden inwendig of aan de N- of C-termini van de geselecteerde eiwitisovorm(en) worden ingebouwd. Voor een optimale CRISPR-gemedieerde bewerking is het van cruciaal belang om de twee sgRNA's voldoende dicht bij de beoogde knock-in-plaats te plaatsen. Om bewerking door middel van homologe recombinatie mogelijk te maken, moet vervolgens een donorvector worden voorbereid die sequenties omvat die homoloog zijn aan het doelgen, samen met de fluorescerende tag. Hieronder vindt u een stap-voor-stap handleiding voor deze processen (Figuur 1).

  1. Ontwerp sgRNA zoals hieronder beschreven.
    1. Ontwerp sgRNA's voor Drosophila met behulp van deze websites: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ of http://www.flyrnai.org/crispr2/.
    2. Voer voor de flycrispr-website de volgorde ±100 bp in rond de gewenste knock-in-locatie (N-terminal, C-terminal of een andere genomische locus van belang). Als u de nos-Cas9 attP2 als injectieachtergrond gebruikt, kies dan de genoomoptie Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). Het Nos-Cas9-systeem zorgt voor kiembaanspecifieke Cas9-expressie.
    3. Om de efficiëntie van de sgRNA-expressie te verbeteren, selecteert u de CRISPR-doelen met de optie 5' G , aangezien sgRNA's die beginnen met een guanine de bewerkingsactiviteit zullen verbeteren. Klik vervolgens op de Vind CRISPR-doelen knop. Er wordt een lijst met mogelijke sgRNA-sequenties weergegeven.
    4. Klik voor elke reeks op de knop Evalueren . Deze actie controleert op mogelijke off-targets voor elke sequentie op basis van het eerder geselecteerde genoom. Kies uit de verstrekte lijst 2 sgRNA's met 0 off-targets. Zorg ervoor dat het ene sgRNA stroomopwaarts is en het andere stroomafwaarts ten opzichte van de knock-in-locatie. Idealiter zouden hun posities zo dicht mogelijk bij de knock-in-plaats moeten liggen (<200 bp), maar ze mogen elkaar niet overlappen (Figuur 2).
      OPMERKING: Het kan soms moeilijk zijn om geschikte sgRNA's te vinden voor een bepaald doelgen. De kloof tussen sgRNA's en de knock-in-locatie kan worden vergroot tot ± 200 bp. Het gebruik van sgRNA's die niet met G beginnen, kan het positieve percentage enigszins verlagen.
  2. Voer de selectie van fluorescerende tags uit zoals hieronder beschreven.
    1. Fluorescerende tags bieden een breed scala aan kenmerken, elk met hun unieke voor- en nadelen 1,2. Bij het bepalen van de ideale fluorescerende tag voor het labelen van een specifiek eiwit, moet u rekening houden met de belangrijkste overwegingen die worden beschreven in de volgende stappen die een rol spelen.
    2. Gezien het feit dat de natuurlijke eiwitexpressieniveaus doorgaans veel lager zijn dan die in overexpressie-experimenten 1,2, begin je met de tags die helder en fotostabiel zijn en die passen bij de experimentele opzet. Sommige fluorescerende tags, met name bepaalde RFP's zoals tdTomato en DsRed, hebben de neiging om multimeren14 te vormen en kunnen leiden tot eiwitaggregatie.
    3. Voor meer veelzijdigheid koppelt u epitooptags (bijv. FLAG of V5) aan de fluorescerende marker met behulp van een flexibele linker, die biochemische analyses zoals Western Blot of Co-Immunoprecipitation mogelijk maakt.
  3. Volg de onderstaande stappen voor het ontwerpen van linkers.
    1. Voor een optimale functionaliteit moet u ervoor zorgen dat zowel het endogene eiwit van belang als de fluorescerende tag afzonderlijk in hun respectievelijke functionele vormen vouwen. Om dit te bereiken, gebruikt u een linkerpeptide met een lengte van 2-20 aminozuren. Plaats bijvoorbeeld twee glycineresiduen tussen het laatste aminozuur van het Period eiwit en het eerste aminozuur van het knock-in fluorescerende eiwit mNeonGreen.
    2. Zorg ervoor dat deze linkerpeptidesequenties aminozuren bevatten zoals glycine en serine, die flexibiliteit geven aan de structuur15. Dit zorgt ervoor dat het natuurlijke gedrag en de locatie van het endogene eiwit onveranderd blijven.
  4. Ontwerp donorvector zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: De donorvector introduceert de fluorescerende tag op de gewenste endogene locatie door het proces van homologiegerichte reparatie, dat wordt geïnitieerd door CRISPR-splitsing. Als zodanig moet de donorvector, naast de fluorescerende tag, sequenties bezitten die homoloog zijn aan beide zijden van de tag.
    1. Begin met het ontwerp van de donorvector door de DNA-sequentie van het linkerpeptide en de fluorescerende tag te organiseren en zorg ervoor dat er homologe sequenties zijn die beide uiteinden flankeren (homologiearmen). Voor optimale resultaten moet u ervoor zorgen dat de homologiearmen ten minste 800 nucleotiden aan elke kant van de beoogde knock-in-plaats bevatten (Figuur 2).
      OPMERKING: Recente rapporten suggereren dat homologiearmen korter kunnen zijn (100-200 bp)16.
    2. Zorg ervoor dat alle PAM-sequenties in het donorplasmide zodanig worden gewijzigd dat de aminozuursequentie van het resulterende eiwit ongewijzigd blijft. Als de PAM-sequentie zich in de UTR bevindt, verwijder deze dan volledig.
    3. De positionering van het START- en STOP-codon is afhankelijk van de locatie van de tag. Zorg er voor interne tagging voor dat de fluorescerende tag in beeld is met de coderende sequentie van het doelgen. Voor N-terminus-tagging plaatst u de fluorescerende tag vóór het endogene startcodon. Voor C-terminus-tagging plaatst u de fluorescerende tag vóór het natuurlijke stopcodon en zorgt u ervoor dat u slechts één startcodon behoudt om mogelijke vertaalproblemen te voorkomen.
  5. Synthetiseer sgRNA en donorplasmiden zoals hieronder beschreven.
    1. Volg voor het maken van sgRNA-plasmide de richtlijnen voor het klonen van U6-gRNA, die u kunt vinden op flycrispr.org/protocols/grna/. Gebruik de alternatieve, op restrictie-enzymen gebaseerde kloonbenadering (in de verstrekte bron strategie C genoemd) om de gRNA-sequentie in het pU6-BbsI-chiRNA-plasmide in te voegen (Addgene, #45946).
    2. Transformeren in DH5a E. coli (NEB, C2987H) volgens de door de fabrikant verstrekte standaardtransformatieprotocollen. Voer ter verificatie Sanger-sequencing uit op de resulterende klonen met behulp van T3- of T7-standaardsequencingprimers.
    3. Voor het maken van donorplasmide verwerft u dubbelstrengs DNA met de gewenste donorsequentie van commerciële leveranciers (bijv. IDT). Integreer het in de pBlueScriptII SK(-) meervoudige kloonsite. Sequentie van het donorplasmide om ervoor te zorgen dat sgRNA- of PAM-sequenties correct worden gewijzigd en dat er geen SNP's in het plasmide aanwezig zijn.
      OPMERKING: Een alternatief voor de integratie met behulp van pBlueScriptII is om de homologiearmen en de fluorescerende tagsegmenten afzonderlijk te PCR'en en ze te consolideren in de ruggengraat met behulp van technieken zoals Golden Gate Assembly of Gibson Assembly.
  6. Gebruik het volgende injectie- en kruisingsschema.
    1. Om kiembaanbewerkte vliegen te verkrijgen, injecteert u gRNA-plasmiden en het donorplasmide samen in de juiste Cas9-achtergrond (bijv. nos-Cas9 III, BDSC 78782). Als u gebruik maakt van commerciële injectiediensten, volg dan de instructies van de verkoper om plasmidevoorbereiding uit te voeren.
      OPMERKING: Doorgaans moet de gRNA-plasmideconcentratie hoger zijn dan 0,5 μg/μL en moet de donorplasmideconcentratie hoger zijn dan 1,0 μg/μL. Een gebruikelijke tijdlijn van het verzenden van plasmidemonsters tot het ontvangen van geïnjecteerde embryo's is ongeveer 2 weken. Een strategie om te screenen op genbewerkingsgebeurtenissen op het X-chromosoom met behulp van de FM7/L-balancerstam wordt hier gepresenteerd. Gebruik voor genen op het tweede of derde chromosoom de juiste balancer-stammen.
    2. Voor het verzamelen van geïnjecteerde vliegen (G0), verdoven met kooldioxide en mannelijke vliegen en maagdelijke vrouwtjes scheiden. Breng vliegenkruisingen tot stand door elk G0-mannetje te koppelen aan ten minste twee FM7/L-maagdelijke vrouwtjes in individuele smalle CT-voedselflesjes. Plaats gekruiste injectieflacons in een geventileerde incubator die op 25°C en ~60% vochtigheid wordt gehouden totdat F1 dicht bij elkaar vliegt (FM7/L is de meest gebruikte X-chromosoombalancer). Koppel op dezelfde manier elk G0-vrouwtje met FM7/Y-mannetjesvliegen.
    3. Verdoof en verzamel ten minste 10 maagdelijke vrouwelijke nakomelingen (F1) van zowel G0 mannelijke als vrouwelijke kruisingen. Verzamel van G0 vrouwelijke kruisingen ten minste 10 mannelijke F1-vliegen (Figuur 3A). Zorg ervoor dat elke F1-vlieg is getagd met de details van zijn afkomst en apart wordt opgeslagen. Ga verder met de screeningstap.
  7. Gebruik het volgende PCR-protocol met één been.
    1. Primer maken: Ontwerp een primerpaar dat de bewerkingsplaats van het doelgen omvat. Idealiter zouden de smelttemperaturen van de primers vergelijkbaar moeten zijn, rond de 55°C.
    2. Lysisbuffervoorbereiding: Bereid 10 μL lysisbuffer voor elk vliegenmonster. De buffer bestaat uit 10 mM Tris (pH 8,2), 1 mM EDTA (pH 8,0), 25 mM NaCl en 400 μg/ml proteïnase K. Bereid de lysisbuffer voor als een mastermix en verdeel vervolgens 10 μL over elk putje van een PCR-plaat met 96 putjes. Zorg ervoor dat de buffer koud blijft tijdens het beendissectieproces (Figuur 3B).
    3. Buisopstelling: Bereid glazen capillaire buizen voor, vul het ene uiteinde met sucrose-agarvoedsel (2% agar en 4% sucrose) en plaats deze in een bord met 96 putjes en diepe putten, waarnaar wordt verwezen als het vlieghotel (Figuur 3C).
    4. Beendissectie: Plaats het kooldioxide-verdovingskussen onder een stereomicroscoop, verdoven een kandidaat-vlieg en snijd een van de middelste poten door. Plaats het been in de lysisbuffer en zorg voor volledige onderdompeling. Het is niet nodig om het been te macereren, ga direct door naar de stap van het lysisprotocol (Figuur 3B). Houd de vliegenvleugel vast met een fijne metalen pincet, verplaats de vlieg naar het vliegenhotel en sluit de buis onmiddellijk af met garen.
    5. Controlemonsters: Twee wildtype vliegen kunnen worden gebruikt als negatieve controles na dezelfde beendissectieprocedure. Een verdund donorplasmide dient als positieve controle.
    6. Zorg na dissectie: Huisvest het vliegenhotel in een geventileerde incubator die wordt gehandhaafd op 25 °C en ~60% luchtvochtigheid. Hoewel vliegen 's nachts kunnen overleven, is het aan te raden om de volgende stappen en paring binnen dezelfde dag te voltooien.
    7. Lysisprotocol: Plaats de afgehakte benen in de lysisbufferoplossing in een thermocycler die gedurende 90 minuten op 37 °C is ingesteld, gevolgd door 95 °C gedurende 5 minuten en ten slotte op 4 °C wordt gehouden. Hiermee wordt voldoende DNA uit de enkele poot van elke vlieg gehaald (Figuur 3B).
    8. PCR-reactie: Organiseer de PCR-reactie volgens de instructies van de fabrikant, met 1,5 μL van het vliegpootlysaat als DNA-bron.
    9. Gelelektroforese: Onderwerp de PCR-producten aan agarosegelelektroforese. Interpreteer de resultaten van de gel op basis van de bandmaat. Doorgaans vertonen negatieve controlevliegen een lagere band en positieve plasmidecontroles een hogere band. Zorg ervoor dat specifieke bandmaten consistent zijn met het oorspronkelijke ontwerp van het donorplasmide. Vrouwelijke positieve vliegen zullen twee banden vertonen omdat ze heterozygoot zijn, en mannelijke positieven zullen een enkele band vertonen (Figuur 3B).
      OPMERKING: Gewoonlijk is het screenen van 70 vliegen op één dag haalbaar. Zorg ervoor dat u minimaal 10 positieve F1-vliegen identificeert in 4 tot 5 verschillende G0-kruisingen, aangezien bepaalde F1's steriel kunnen zijn als gevolg van off-target mutaties.
  8. Voer de volgende post-PCR cross-set-up uit.
    1. Selecteer op basis van de gelresultaten de positieve vliegen uit het vlieghotel en kruis ze individueel met balancervliegen (FM7/L voor het labelen van X-chromosoomgenen) om de F2-generatie te produceren. Zodra de F2-generatie tevoorschijn komt, stelt u kruisingen tussen broers en zussen vast om homozygote stabiele bestanden te creëren (Figuur 3D).
    2. Gebruik homozygote aandelen voor Sanger-sequencing van de bewerkingssite om nauwkeurigheid te garanderen. Terugkruising gevalideerde vlieglijnen met wildtype vliegen om achtergrondmutaties te verwijderen. Screen elke generatie met behulp van het single-leg PCR-protocol.

Resultaten

In onze experimenten vonden we doorgaans een slagingspercentage van ~20%-30% bij het screenen op verschillende endogene gelabelde genen op alle chromosomen (X, II, III). De efficiëntie van dit proces kan variëren op basis van verschillende factoren, zoals gRNA-selectie, de aard van het gen en de injectiekwaliteit. Hier illustreren we de resultaten van onze strategie om het endogene periode-gen te labelen met de mNeonGreen fluorofoor13. Het menstruatiegen , gepositioneerd op het X-chromosoom van D. melanogaster, speelt een cruciale rol in de circadiane klok. Drosophila heeft een goed gekarakteriseerd kloknetwerk dat bestaat uit ongeveer 150 klokneuronen die klokeiwitten tot expressie brengen17.

We hebben het Period-eiwit gelabeld met het groene fluorescerende eiwit mNeonGreen aan het C-terminale uiteinde, verbonden door een dual-glycine linker13. Na de plasmide-injectie hebben we de G0-vliegen gekruist met FM7/L-balancer en vervolgens de F1-generatie geoogst. Van de 126 F1-vliegen die werden gescreend met behulp van gespecialiseerde PCR-primers (tabel 1), identificeerden we 47 positieve gevallen, wat een slagingspercentage van 37.3% opleverde. Hieruit selecteerden we 5 F1-individuen om extra kruisingen op te zetten om stabiele voorraden te produceren. Geslacht had geen invloed op het positieve uitkomstpercentage tijdens deze screening. Nadat we de sequentienauwkeurigheid van het gelabelde gen hadden geverifieerd, voerden we controletests uit, waaronder gedragsbeoordelingen en qPCR-evaluaties om mRNA-oscillaties te garanderen om de functionaliteit van het gelabelde eiwit te bevestigen (PERIOD-mNeonGreen)13.

Om live-imaging experimenten uit te voeren, hebben we deze PERIOD-mNeonGreen vliegen gekruist met Clock856-GAL4; UAS-CD4-tdTomato vliegt, waarbij Clock856-GAL4 alle klokneuronen19 labelt en CD4 is een transmembraaneiwit dat celmembranen labelt. Voor live-imaging-experimenten hebben we 3-4 volwassen hersenen ontleed met behulp van ijskoud Schneider's Drosophila-medium. De hersenen werden gemonteerd en in beeld gebracht met behulp van een Airyscan confocale microscoop. Figuur 4 toont de representatieve afbeeldingen die het PERIOD-eiwit weergeven in klokneuronen in Drosophila-hersenen .

figure-results-1
Figuur 1: Schema van het op CRISPR/Cas9 gebaseerde genbewerkingsprotocol. Het protocol schetst een reeks stappen om sgRNA en donorplasmiden te ontwerpen en te assembleren, gevolgd door screening door middel van de PCR-methode met één been en de productie van stabiele technische lijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Schema van CRISPR/Cas9 genoombewerking om periode-mNeonGroene vliegen te genereren. (A) Schema ter illustratie van de toevoeging van een fluorescerend eiwitlabel aan het C-uiteinde van een endogeen gen. (B) Het endogene periode (per) gen is gelabeld met mNeonGreen, een helder, monomeer groen fluorescerend eiwit aan het carboxyl eindpunt. Twee sgRNA's bevinden zich respectievelijk in het laatste exon en de 3'UTR. De donorvector bevat twee homologiesequenties van ~1 kb die de mNeonGreen-tag flankeren. Stopcodon wordt toegevoegd aan het einde van de tag voor een juiste beëindiging van de vertaling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Strategie om te screenen op CRISPR-positieve vliegen. (A) Aanpak voor het opzetten van pre-screening genetische kruisingen voor genen die bedoeld zijn voor CRISPR-tagging op X- en II-chromosomen. G0 staat voor de aanvankelijk geïnjecteerde vliegen, terwijl F1 staat voor hun nakomelingen van de eerste generatie die moeten worden gescreend. (B) De PCR-screeningmethode met één been en de duur van elke procedurestap worden beschreven. (C) Hier is een foto van het Fly Hotel. Glazen buizen zijn gevuld met vliegenvoer en aan één uiteinde verzegeld. Afzonderlijke vliegen worden in afzonderlijke buizen geladen. Nadat het DNA dat uit de middelste led van individuele vliegen is geëxtraheerd, is getest, worden de juiste vliegen uit het vliegenhotel gehaald en worden de stabiele lijnen vastgesteld. (D) Aanpak voor het opzetten van kruisingen van vliegen na de screening (hier in blauw weergegeven) die de screeningstest hebben doorstaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Representatieve beelden van PERIOD-mNeonGreen eiwit in klokneuronen. Representatieve beelden van periode-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomatenvliegen meegevoerd naar Licht-Donker-cycli. ZT verwijst naar Zeitgeber Time en ZT0 verwijst naar de tijd dat de lichten aan zijn en ZT12 verwijst naar de tijd dat de lichten uit zijn. De nucleaire envelop van het klokneuron is gelabeld met tdTomato, hier in het rood weergegeven, en het PERIOD-eiwit is gelabeld met mNeonGreen en wordt in het groen weergegeven. PERIOD-eiwit is georganiseerd in discrete nucleaire brandpunten gedurende de late nacht en vroege ochtend. Schaal balken, 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

NaamDNA-sequentie (5' tot 3')
Periode screening primer naar vorenATACTCGTCCATAGACCACG
Periode zeefprimer omgekeerdACATTATCCTCGGCTTGCAT
per-gRNA1-zincttcACCAGACACAGCACGGGGAT
per-gRNA1-antisenseaaacATCCCCGTGCTGTGTCTGGT
per-gRNA2-zincttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG
per-gRNA2-antisenseaaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC
periode homologie armen en mNeonGreen inzetstukGAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA
GGGCGACCTGACCATTCGGTTGAACGATGTGCACA
CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC
TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC
AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat
gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcttctcgtagTGGCCACT
TTGACCTGTCGAATCTGTTCAACGACAACAAGGAGC
GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGAGT
GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC
AACGAGGCCTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT
ACAGAGTCTGTGGGCCAACATTCCCTACGACGAGTT
CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT
CCGGTCTAACTAGCCACTCTAGCTAATTACTGATTAAA
CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTTCGATTAA
AACAACTACAAGTGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT
TTATTGTACAATAAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA
AACCTTAGGGCTGAAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC
CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATATTCTGATTAAACAT
AGGATAGATATCATCTAAAAGCTTTGCTTGGCTTGAGAT
CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT
CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTTTCGTTACTTTTTCGGA
TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGAT
TCGAAGAActtgaagggaatggaagggagttaggaataggaactggtgg
gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcacTCGTTTCCA
GGACCCTGCTGCTCCGGTGTCTGCTGCTCGGATCATC
CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT
CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTGTACAGTTCGT
CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT
TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT
TTCGAAAGACATACATCGGTTGGTTCTTGAGATAGTTAG
CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTACGTTGTTCGCGCT
GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTATAGGAC
CATTTGAAAGTGGAAATAATAGTCTTATCATTGGGGTAG
GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC
GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGGGAAACCCG
TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATATGGCTACCT
TCGTAAGTGTACCGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC
CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC
GAGCCATCTACCATCGCGGCTTGGAAGGGCGACATGC
CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG
ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAT
CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC
GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTGTCCGACCATATC
GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG
CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC
TTCACCCTTCGACACACCTCCGCCGTCGCCGTGCT
GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATGATCTTGC
TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaagaacggaaatggatta
cattgaatcgcatcgtggactgaactgtacgtacCTTCAGCTTTCGG
TGCTTGGTCCTTTTCGGTGTCCGGCGGACTCTC
CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA
AGGAGGAGAAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA
TTCCCATTGCTGTCCGTATTTctgtggatgagaccatgttc
ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT
GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGCGGGTCG
GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGGAATGGGCGA
GGAGTCCGGCACCTCCTTCTTGCAGGGATCGGATA
CCGCTGCACTGGAGCCCGGCTCCGTCTTGACGGA
TGCGCTGCGAGGAGGGACGCTGCACCTGGGC
AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC
TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta
tggagttggagttggagttaagacagttcggtgaggcaccaccggccactg
acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG
AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG
GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT
GGCCGTGGCCGCGGCCGCCGCCGGGTGTGTGTGTAG
AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCACGCCGGCCAT
GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGCCGCGGCA
GCCGCCTGCTGCGAGGTGGTGGGCATGTCCGTGC
CACCCTTGTGCGGATGCTTGTGCATCCGGGGAGAG
CGCGTGGGACTGGTGGGCGTCAAGGAGGCGGGGA
TGTAGTAGAAGGTCGGGAAGAGGCCGGCGGAGGA
GAAGCTGCTCTGGGCCATGGCCGTGTGCGTGGGGAG
TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG
GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA

Tabel 1: Lijst met sgRNA-sequenties om het endogene menstruatiegen te taggen op de C-terminal en primers die worden gebruikt om PCR-screening met één been uit te voeren.

Discussie

De resultaten demonstreren een gestroomlijnde, eenvoudige CRISPR-gebaseerde strategie in één stap voor het taggen van endogene genen in Drosophila. In het protocol gebruiken we twee gRNA's om DNA-dubbelstrengsbreuk en homologe recombinatie efficiënter te induceren. De gRNA's en het donorplasmide worden geïnjecteerd in fruitvliegembryo's, die het Cas9-enzym tot expressie brengen in hun kiembaan. Deze embryo's worden vervolgens onder standaardomstandigheden gekweekt tot ze volwassen zijn, waarna ze worden gekruist met balancervliegen om de nakomelingen van de eerste generatie (F1) te produceren. PCR-genotypering wordt uitgevoerd op de middelste poot van elk F1-monster om te screenen op genetisch gemodificeerde vliegen. Deze methode biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van de huidige screeningsmethoden die gebruik maken van twee screeningsstappen, waarbij de eerste stap afhankelijk is van het gebruik van een zichtbare marker zoals oogkleur om het juiste genotype te identificeren en de tweede stap het verwijderen van de oogkleurmarker10 omvat. Hier presenteren we een methode waarbij PCR wordt gebruikt op DNA dat is geëxtraheerd uit een klein segment van de middelste poot van een individuele vlieg, waardoor niet-dodelijke genotypering van individuele vliegen mogelijk is, wat een efficiënter en kosteneffectiever alternatief biedt voor bestaande methoden. Met deze methode kunnen kandidaat-dieren één voor één of in batches worden gescreend totdat het juiste genotype is geïsoleerd. Het aantal dieren dat wordt gescreend voordat geschikte bestanden worden geïsoleerd, varieert van experiment tot experiment, afhankelijk van vele factoren, waaronder de efficiëntie van de geselecteerde sgRNA's, de efficiëntie van de injectie en off-target inserties die de levensvatbaarheid kunnen beïnvloeden. Als alternatief kan DNA van enkele vleugels van individuele vliegen ook worden gebruikt voorgenotyperingsdoeleinden18.

Het is mogelijk dat de toevoeging van een tag aan de N- of C-terminal van een gen de functie van het gen nadelig kan beïnvloeden, wat mogelijk de levensvatbaarheid van de vliegen kan beïnvloeden. Als informatie over de eiwitstructuur beschikbaar is, kan deze worden gebruikt om te bepalen of N- of C-terminale tagging de functie en lokalisatie van het oorspronkelijke eiwit beter kan behouden. Het wordt altijd aanbevolen om controle-experimenten uit te voeren, inclusief testen of het gelabelde eiwit een vergelijkbaar lokalisatiepatroon vertoont als het wildtype-eiwit door middel van antilichaamkleuringsmethoden. Dezelfde screeningsstrategie kan worden gebruikt om andere soorten op CRISPR gebaseerde genetische inserties of deleties te screenen. Kortom, de eenstapsscreeningstrategie maakt het veel gemakkelijker om CRISPR-bewerkte vliegen te genereren en opent veel mogelijkheden om de subcellulaire lokalisatie en dynamiek van endogene genen in hun oorspronkelijke context te bestuderen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

We danken George Watase en Josie Clowney voor de discussies tijdens de beginfase van de ontwikkeling van het protocol. Het werk werd ondersteund door fondsen van de NIH (subsidie nr. R35GM133737 aan S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (aan S.Y.) en McKnight Scholar Award (aan S.Y.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5M EDTA pH8.0InvitrogenAM9260G
5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)NEBC2987H
96-well deep well plateBRAND701354
AgarFisher ScientificBP1423-500
BbsI-HFNEBR3539S
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo ScientificK1081
D-SucroseFisher ScientificBP220-1
EcoRI-HFNEBR3101S
Hydrochloric AcidFisher ScientificA142-212
Prolong Glass Antifade Mounting MediumInvitrogenP36982
Proteinase KQIAGEN19131
Schneider's Drosophila MediumGibco21720001
Sodium ChlorideFisher ScientificS271-500
T4 DNA ligaseNEBM0202S
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
XbaINEBR0145S

Referenties

  1. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
  2. Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670(2015).
  3. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  4. Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
  5. Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  6. Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
  7. Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068(2016).
  8. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
  9. Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  10. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  11. Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539(2019).
  12. Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
  13. Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118(2021).
  14. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
  16. Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077(2022).
  17. Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
  18. Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
  19. Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR genlabelingfluorescent eiwit knock inhomologe recombinatiesgRNA ontwerpconstructie van donorplasmidenPCR genotyperingSanger sequencingconfocale microscopie

Gerelateerde artikelen