Dit protocol beschrijft de isolatie van pulmonale interstitiële macrofagen (IM's) en hun adoptieve overdracht na IL-33 stimulatie van de longblaasjes in een muismodel, wat de in vivo studie van idiopathische longfibrose (IPF) kan vergemakkelijken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen naar bleomycine-geïnduceerde muismodellen om hun effect op idiopathische longfibrose in vivo te bestuderen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
De ontstekingsreactie veroorzaakt door vroege longbeschadiging is een van de belangrijke oorzaken van de ontwikkeling van idiopathische longfibrose (IPF), die gepaard gaat met de activering van ontstekingscellen zoals macrofagen en neutrofielen, evenals de afgifte van ontstekingsfactoren zoals TNF-α, IL-1β en IL-6. Van vroege ontsteking veroorzaakt door geactiveerde pulmonale interstitiële macrofagen (IM's) als reactie op IL-33-stimulatie is bekend dat ze een vitale rol spelen in het pathologische proces van IPF. Dit protocol beschrijft de adoptieve overdracht van IM's gestimuleerd door IL-33 in de longen van muizen om IPF-ontwikkeling te bestuderen. Het omvat de isolatie en kweek van primaire IM's uit de longen van gastheermuizen, gevolgd door de adoptieve overdracht van gestimuleerde IM's in de longblaasjes van bleomycine (BLM) -geïnduceerde IPF-ontvangermuizen (die eerder zijn uitgeput van alveolaire macrofagen door behandeling met clodronate liposomen), en de pathologische evaluatie van die muizen. De representatieve resultaten tonen aan dat de adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen longfibrose bij muizen verergert, wat suggereert dat de oprichting van het macrofaag adoptieve transferexperiment een goed technisch middel is om IPF-pathologie te bestuderen.
Inleiding
Idiopathische longfibrose (IPF) is een diffuse longontstekingsziekte veroorzaakt door vele factoren1. In de cytokine micro-omgeving van de Th1 en Th2 immuunrespons kunnen macrofagen worden gepolariseerd in klassiek geactiveerde macrofagen (M1) en alternatief geactiveerde macrofagen (M2). Lipopolysacchariden (LPS) of het cytokine IFN-γ induceren M1-macrofagen om te polariseren en pro-inflammatoire cytokines te produceren, waaronder iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α en IL-12. Daarentegen drijven de type II-cytokines IL-4 en IL-13 de polarisatie van M2-macrofagen aan, die verschillende fibroblastgroeibevorderende factoren kunnen produceren, zoals TGF-β en PDGF, die longfibrose2 bevorderen. Het pathologische proces van IPF gaat gepaard met macrofaagactivering en infiltratie. IPF bemiddelt letselherstel, ontsteking en fibrose door de afgifte van cytokines3. Omdat er slechts beperkte therapeutische opties beschikbaar zijn, is het verkennen van de moleculaire pathologische mechanismen van IPF van groot belang voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor IPF-preventie en -behandeling. Eerdere studies door onze groep en andere onderzoekers 4,5 hebben de verhoogde afgifte van IL-33 bevestigd bij IPF-patiënten en in muismodellen met bleomycine (BLM)-geïnduceerde IPF. IL-33 wordt vrijgegeven door de epitheel- en endotheelcellen tijdens fibrose en is betrokken bij macrofaagactivatie, wat resulteert in de abnormale proliferatie van fibroblasten, leukocyteninfiltratie en het uiteindelijke verlies van longfunctie5. Het huidige protocol beschrijft de adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde interstitiële macrofagen (IM's) in de longblaasjes als een middel om IPF-ontwikkeling in muismodellen te bestuderen. Hier werden IM's geïsoleerd uit het longweefsel van gastheermuizen, in vitro gekweekt, gestimuleerd met IL-33 gedurende 24 uur en vervolgens adoptief overgebracht in de longblaasjes van ontvangende muizen door tracheale injectie. De directe verzameling van gestimuleerde muizenmacrofagen en hun adoptieve overdracht naar de ontvangende longblaasjes bleek de mate van longfibrose te verergeren en kan de invloed van stimulerende factoren op fibrose duidelijker illustreren in vergelijking met de eerdere studies6. De techniek die in dit artikel wordt beschreven, kan onderzoekers in staat stellen om de functie van macrofagen gestimuleerd door potentiële cytokines bij de ontwikkeling van IPF te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor dierenwelzijn van de Jiangnan University (JN nr. 20211,130m1720615[501]).
OPMERKING: In totaal werden 10 mannelijke C57BL/6-muizen van 6-8 weken oud en met een gewicht van 20-25 g gebruikt in deze studie. De drie experimentele groepen in de studie omvatten elk drie ontvangende muizen en één gastheermuis werd gebruikt voor de IM-isolatie.
1. Uitputting van pulmonale macrofagen bij muizen
- Haal de injectieflacon met clodronaat liposomen (zie Tabel met materialen) 30 minuten van tevoren uit de koelkast, verwarm deze tot kamertemperatuur en keer deze meerdere keren om om een uniforme menging te garanderen.
OPMERKING: Clodronaat liposomen kapselen de hydrofiele dichloormethyleen bisfosfonaat moleculen in. Wanneer deze liposomen worden geconsumeerd door de macrofagen, wordt het clodronaat geleidelijk vrijgegeven door de werking van het lysosoomfosfatase, en de accumulatie ervan veroorzaakt bijgevolg celapoptose en de uitputting van macrofagen7. - Verdoof muizen met 3% isofluraan. Controleer de diepte van de anesthesie door in één voet te knijpen om het bewustzijn te controleren. Breng veterinaire zalf aan op beide ogen om uitdroging onder anesthesie te voorkomen.
- Zuig 60 μL clodronaat liposomen aan met behulp van een pipet met een steriele zuigpunt. Dien het medicijn druppelsgewijs toe in de neusholte van de verdoofde muis, zodat wanneer de muis inademt, het medicijn in de luchtpijp wordt ingeademd. Zorg er na elke druppel voor dat de muis het medicijn volledig inademt en gelijkmatig ademt. Dien liposomen met PBS alleen toe als controle8 (figuur 2).
- Plaats de muizen op een constante temperatuurtabel van 38 °C om opnieuw op te warmen om hun herstel te versnellen. Houd de muizen in de gaten totdat ze wakker worden. Nadat de muizen goed zijn hersteld en sternale lighouding hebben bereikt, brengt u ze over naar de kooi.
- Gebruik muizen met uitgeputte alveolaire macrofagen 2 dagen na de behandeling met clodronate liposomen als de ontvangende muizen voor het overdrachtsexperiment.
OPMERKING: In deze studie werd de depletie van alveolaire macrofagen bevestigd door de expressie van macrofaagmarkers te controleren zoals eerder beschreven 8,9 na toediening van clodronaat liposomen door inademing (zie aanvullende figuur 1).
2. Isolatie en cultuur van IM's
- Verdoof de gastheermuis met een intraperitoneale injectie van Ketamine (120 mg/kg) en Xylazine (16 mg/kg). Bevestig de diepte van de anesthesie via verlies van de teenknijpreflex. Breng veterinaire zalf aan op beide ogen om uitdroging onder anesthesie te voorkomen. Desinfecteer vervolgens de huid van de verdoofde muis met 75% alcohol en jodium. Gebruik een schaar om door de huid te snijden en het cardiopulmonale weefsel bloot te leggen
- Zuig 10 ml 1x PBS op in een spuit met een naald van 20 G en steek de punt van de naald in het rechteratrium van de muis (figuur 3A). Knip de inferieure vena cava van de muis met een chirurgische schaar en perfuseer de muis vervolgens handmatig met PBS met een constante snelheid (10-20 ml / min) totdat het longweefsel wit wordt. Snijd het longweefsel weg en breng het over in ijskoude PBS in een kweekschaal (figuur 3B).
- Snijd het longweefsel in fragmenten van ongeveer 2 mm x 2 mm x 2 mm. Voeg vervolgens 15 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 1% collagenase A toe aan het longweefsel om de macrofagen te isoleren. Incubeer bij 100 rpm gedurende 30 minuten op een 37 °C schudtafel.
- Zuig de longweefselsuspensie minstens 20x door een spuit van 10 ml om het zo fijn mogelijk te maken. Filter deze suspensie door een 40 μm celzeef. Centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten op 400 x g en gooi het supernatant weg.
- Lyseer de rode bloedcellen in de pellet door 3 ml RBC-lysisbuffer (zie materiaaltabel) gedurende 2-3 minuten op ijs toe te voegen.
- Na centrifugeren bij 150 x g gedurende 5 minuten, resuspensie van de celpellet met 10 ml DMEM (met 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine). Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Zaai de cellen in 10 cm hechtende celkweekschalen bij 2 x 107 cellen/schaal en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Hierdoor kunnen de long-IM's zich hechten aan de schotel5. Zuig na 1 uur de supernatante en zwevende cellen op en voeg 10 ml vers compleet kweekmedium toe (DMEM met 10% FBS, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine). Incubeer gedurende meer dan 8 uur of een nacht.
- Bepaal de zuiverheid van de verkregen IM's met behulp van flowcytometrie met kleuring voor F4/80- en CD11c-markers, zoals eerder beschreven5 (zie aanvullende figuur 1).
3. Adoptieve overdracht van IM's naar de longblaasjes
- Vervang het kweekmedium van de plaat met de geïsoleerde pulmonale IM's (stap 2.7) door een volledig kweekmedium met 10 ng/ml IL-33 voor het stimuleren van de IM's. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Gebruik 1x PBS in plaats van IL-33 als controle.
- Dissocieer de pulmonale IM's door ze te behandelen met 1 ml 0,25% trypsine gedurende 5 minuten. Blus vervolgens de vertering door 3 ml vers kweek compleet medium toe te voegen en oogst de pulmonale macrofagen door de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 150 x g en 4 °C te centrifugeren. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en resuspendien de cellen in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 105 cellen/50 μL.
- Verdoof de ontvangende muizen met 3% isofluraangas. Wacht tot de muis bewusteloos raakt (zoals in stap 1.2) en bevestig vervolgens de ledematen van de verdoofde muis op een verticale plaat met medische tape. Trek de tong van de muis voorzichtig naar één kant met een wattenstaafje.
- Zet de intubatielamp aan en schijn deze op de keel van de muis, zodat de luchtpijp te zien is. Controleer of de luchtpijp dicht bij de basis van de tong ligt, de slokdarm zich aan de achterkant van de nek bevindt, maar de opening van de slokdarm is niet zichtbaar tijdens de operatie.
- Gebruik de intubatielamp (22 G) om de muis te intuberen. Leid de inwonende naaldcanule met een geleidingsdraad (0,4 mm diameter) in de luchtpijp. Verwijder de geleidingsdraad en duw de canule in de luchtpijp van de muis om de intubatie te voltooien.
- Nadat is waargenomen dat de canule de luchtpijp binnendringt, injecteert u 50 μL van de celsuspensie (met 5 x 105 IM's) in de ontvangende muis via de luchtpijp.
- Plaats de muizen op een 38 °C constant opwarmkussen om opnieuw op te warmen om het herstel te versnellen. Houd de muizen in de gaten totdat ze wakker worden. Nadat ze goed zijn hersteld en sternale lighouding hebben bereikt, breng je ze over naar de kooi.
- Dien na 24 uur bleomycine (BLM) toe via de luchtpijp (met behulp van de procedure in stappen 3.3-3.5) in een dosis van 1,4 E/kg lichaamsgewicht om IPF te induceren. Dien een gelijk volume zoutoplossing toe aan de controlegroep.
- Bepaal na 21 dagen de mate van ernst van longfibrose voor de verschillende groepen muizen die adoptief werden overgedragen met PBS of de IL-33-gestimuleerde IM-suspensie door de expressie van markers voor fibrose en de Ashcroft-scores10 te evalueren.
- Extraheer het totale RNA uit het longweefsel met behulp van een RNA-extractiereagens (zie tabel met materialen).
OPMERKING: Kwantitatieve analyse werd uitgevoerd met een microplaatlezer. Als de OD260/OD280-verhouding 1,8-2,0 is, is de RNA-zuiverheid hoog. Alle monsters werden opgeslagen bij −80 °C. - Voer fluorescentie kwantitatieve PCR uit om de expressie van α-gladde spieractine (SMA) en fibronectine te evalueren met behulp van specifieke primers.
OPMERKING: De primers die werden gebruikt voor α-SMA waren forward 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' en reverse 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3', en de primers die werden gebruikt voor fibronectine waren forward 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' en reverse 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3'.
- Extraheer het totale RNA uit het longweefsel met behulp van een RNA-extractiereagens (zie tabel met materialen).
- Voer immunohistochemie uit zoals hieronder beschreven.
- Droog de linkerlong uit, sluit deze in en snijd deze met een paraffinesnijder tot een dikte van 4 μm.
- Plaats de weefselsecties op dia's en bak de dia's in een oven op 65-70 ° C gedurende 30 minuten tot 1 uur. Dewax de glaasjes met een afnemend percentage alcohol (d.w.z. 100%, 95%, 90%, 80% en 70% alcohol) gedurende 5 minuten.
- Bevlek de dia's in hematoxyline kleurstofoplossing (analytisch zuiver) gedurende 5 minuten. Was vervolgens de glijbanen met kraanwater. Week de dia's gedurende 3 s in 1% zoutzuuralcohol, was de drijvende kleur af en week gedurende 5 minuten in stromend water. De secties worden blauw.
- Dompel onder in eosine-oplossing gedurende 10 s tot 1 minuut (bepaal de verftijd volgens de kleur), was met kraanwater en plaats in respectievelijk 70%, 80%, 95%, 100% en 100% alcohol gedurende 5 minuten elk. Plaats vervolgens de dia's gedurende 3 minuten in xyleen I- en xyleen II-oplossingen. Na het drogen, observeren en foto's maken onder de verticale microscoop met neutrale zelfklevende afdichtingsfilm.
- Voer Ashcroft-scores uit op de secties om de ernst van longfibrose aan te geven10. Voer statistische analyse van de gegevens uit met behulp van een t-test van twee onafhankelijke steekproeven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het hier gebruikte protocol is samengevat in het stroomdiagram in figuur 1. De inademing van clodronaat liposomen door de neus (figuur 2) werd gebruikt om de pulmonale macrofagen van volwassen C57BL/6 muizen uit te putten, en dit leverde een goed ontvangend muismodel op. Pulmonale IM's werden geïsoleerd uit een andere onbehandelde (gastheer)muis (figuur 3A,B) en in vitro gekweekt. De geïsoleerde macrofagen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie biedt een effectieve methode om macrofagen uit te putten, te isoleren, te kweken en over te dragen, wat kan helpen bij het bestuderen van de mechanismen van longfibrose bij muizen. Er zijn veel methoden voor macrofaagdepletie bij muizen, zoals tracheale toediening, staartaderinjectie en neusinhalatie11. Deze studie optimaliseerde de nasale inhalatiemethode, die eenvoudig te bedienen is en pulmonale macrofagen effectief kan uitputten 8,9
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen het speciale onderwerp van laboratoriumbeheer van Jiangnan University: Construction of Digital Slice Library Based on Pathological Specimens (JDSYS202223) en de National Natural Science Foundation of China (81800065).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arteriële indwellnaald | B Braun Melsingen AG,Duitsland | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycine | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Koolstofdioxide-incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Celcultuurschaal | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomen | Clodronate liposomen,Nederland | CI-150-150 | |
| Collageenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxyline Eosine | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detectiesysteem | Roche, USA | ||
| Murine recombinante factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscoop | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicilline, streptomycine | Life technologies,USA | 877113 | |
| Fosfaatbuffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology,China | 1535882 | |
| RBC lysisbuffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Reagens voor totale RNA-extractie |
| RWD Inhalatieanesthesieapparaat | Shenzhen Rayward Life Technology,China | R500 | |
| Semi-automatische paraffine slicer | Leica, Duitsland | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsine 0,25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
Referenties
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897(2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846(2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
