Method Article

High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

DOI:

10.3791/64744

⸱

March 3rd, 2023

 ,  ,  ,  , 
1National Physical Laboratory, 2SWISSCI LTD

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige aanpak voor het screenen van eiwitkristallisatieomstandigheden en kristalgroei met behulp van een 96-well high-throughput dialyseplaat. Het gebruik van dialysatorbuizen voor de grootschalige groei van microkristallen wordt ook gedemonstreerd voor seriële kristallografie en MicroED-toepassingen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van de structuur-functierelaties van macromoleculen, zoals eiwitten, op moleculair niveau is van vitaal belang voor de biogeneeskunde en de ontdekking van moderne geneesmiddelen. Tot op heden blijft röntgenkristallografie de meest succesvolle methode voor het oplossen van driedimensionale eiwitstructuren met atomaire resolutie. Met recente vooruitgang in seriële kristallografie, hetzij met behulp van röntgenvrije elektronenlasers (XFELs) of synchrotronlichtbronnen, is eiwitkristallografie gevorderd naar de volgende grens, waar het vermogen om tijd-opgeloste gegevens te verkrijgen belangrijke mechanistische inzichten biedt in het gedrag van biologische moleculen bij kamertemperatuur. Dit protocol beschrijft een eenvoudige high-throughput (HTP) workflow voor het screenen van kristallisatiecondities door het gebruik van een 96-well dialyseplaat. Deze platen volgen de standaard van de Society for Biomolecular Screening (SBS) en kunnen eenvoudig worden opgezet met behulp van elk standaard kristallisatielaboratorium. Zodra de optimale omstandigheden zijn geïdentificeerd, kunnen grote hoeveelheden kristallen (honderden microkristallen) worden geproduceerd met behulp van de dialysator. Om de robuustheid en veelzijdigheid van deze aanpak te valideren, werden vier verschillende eiwitten gekristalliseerd, waaronder twee membraaneiwitten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen eeuw is röntgenkristallografie van cruciaal belang geweest bij het ophelderen en begrijpen van het structuur-functieparadigma van biologische macromoleculen. Tot op heden blijft het een van de meest succesvolle methoden bij het ophelderen van atomaire resolutiestructuren van veel uniek verschillende eiwitten die cruciaal zijn voor het fundamentele begrip van celbiochemie, geneeskunde en vroege ontdekking van geneesmiddelen 1,2. Eiwitkristallisatie blijft echter een knelpunt bij het bestuderen van veel eiwitdoelen, met name membraaneiwitten en grote eiwitcomplexen3. Bijgevolg wordt eiwitkristallisatie bijna altijd als een kunst beschouwd vanwege de arbeidsintensieve trial-and-error-benaderingen die 4,5,6 worden gebruikt.

Een neerslagmiddel wordt meestal in hoge concentratie aan een eiwitoplossing toegevoegd om een goed geordende, regelmatige en herhalende roosterindeling van eiwitmoleculen te vormen, bekend als kristallen. Onder gunstige omstandigheden, zoals temperatuur, pH, concentratie en precipitant middel, vormt zich uiteindelijk een oververzadigde oplossing, gevolgd door kristalkernvorming en groei 7,8. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt in de opstelling van kristallisatieproeven, voornamelijk met de ontwikkeling van robotsystemen met hoge doorvoer en de beschikbaarheid van kant-en-klare "schaarse matrix" -schermen, zijn de algemene benaderingen van eiwitkristallisatie in de loop der jaren grotendeels ongewijzigd gebleven. Veel voorkomende experimentele eiwitkristallisatietechnieken zijn dampdiffusie (hangende druppel en zittende druppel)9, microbatch (onder olie)10,11, vrije interfacediffusie (microfluïdische apparaten)12 en dialyse (met behulp van knoppen en andere technieken)13,14,15. Er bestaan echter ook andere, meer gespecialiseerde opstellingen, zoals mesofasebenaderingen voor het kristalliseren van membraaneiwitten16,17. Hoewel de meerderheid van de röntgeneiwitstructuren die in de Protein Data Bank zijn afgezet tot nu toe zijn opgelost door kristallisatie door dampdiffusiemethoden 6,18, lijken andere benaderingen, zoals kristallisatie door dialyse, onderbenut te zijn, waarschijnlijk vanwege de praktische aspecten die verband houden met hun experimentele opstelling.

Kristallisatie door dialyse is eenvoudigweg afhankelijk van de langzame diffusie van opgeloste stoffen (precipitanten, ionen, additieven en buffers) door een semi-permeabel membraan dat tegelijkertijd voorkomt dat eiwitmoleculen circuleren. Op deze manier wordt de eiwitoplossing langzaam in evenwicht gebracht, waarbij de precipitant de noodzakelijke concentratie bereikt om te kristalliseren. De kinetiek van het systeem is afhankelijk van de temperatuur, de precipitantconcentratie en de cellulosemembraanmoleculaire gewichtsafsnijding (MWCO)19. Tot op heden is de meest populaire kristallisatie-opstelling door dialyse het gebruik van microdialyseknoppen gemaakt van transparante acrylplaten. Deze worden meestal ondergedompeld in reservoirs (meestal met behulp van dampdiffusie hangende druppelplaten) met de kristallisatie precipitant oplossingen. Deze methode met een lagere doorvoer vereist echter ook een specifieke assemblage om de eiwitoplossing in het dialysemembraan dat over de knoopkamer is geplaatst, af te dichten, zoals geïllustreerd in figuur 1. Bovendien zijn luchtbellen die vastzitten tussen het dialysemembraan en de eiwitoplossing een veel voorkomend probleem dat de kristalgroei schaadt. Een andere beperking van de methode zijn de monstervereisten, waarbij veel hogere concentraties en volumes nodig zijn in vergelijking met dampdiffusiemethoden, om de dialyseknoppen te accommoderen. Daarom is kristallisatie met behulp van microdialyseknoppen gezien als een onaantrekkelijke methode, vooral voor moeilijke doelen zoals membraaneiwitten, waarvan de zuiveringsopbrengsten frustrerend laag zijn. Onlangs zijn microfluïdische apparaten ontwikkeld om eiwitkristallisatie door dialyse te vergemakkelijken15. Deze chips zijn ook ontworpen om een hoge röntgentransparantie met een lage achtergrond te hebben, waardoor de chips kunnen worden gebruikt voor in-situ gegevensverzameling bij kamertemperatuur, waardoor het ongemak van het oogsten en cryokoelen van kristallen wordt geëlimineerd. Ondanks deze vooruitgang is de aanpak nog steeds zeer laag en duur.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische weergave van kristallisatie door dialyse met behulp van dialyseknoppen. (A) Schematische weergave van een kristallisatiedialyseknop. (B) De eiwitoplossing wordt toegevoegd aan de microdialyseknopkamer. (C) Het dialysemembraan wordt tegen de microdialyseknop gehouden met behulp van een rubberen ring (O-ring) die via een applicator wordt aangebracht. (D) De dialyseknop is klaar om te worden ondergedompeld in het reservoir met de kristallisatieoplossing (dialyseoplossing), zoals weergegeven in (E). De injectieflacon met de ondergedompelde dialyseknop moet worden afgesloten om verdamping te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het screenen van eiwitkristallisatiecondities en kristalgroei met behulp van de 96-well high-throughput dialyseplaat. Deze wegwerpplaten zijn ontworpen om op dezelfde manier te worden gebruikt als de dampdiffusiekristallisatieplaten (pipet dan verzegelen), zoals weergegeven in figuur 2. De platen bieden plaats aan maximaal 3,2 μL eiwit en 350 μL dialyseoplossing. Elke put is voorzien van een afzonderlijk geregenereerd cellulosemembraan om kruisbesmetting tussen de putten te voorkomen. De installatie duurt ongeveer 10 minuten om te voltooien en vereist geen gespecialiseerde apparatuur naast wat te vinden is in alle standaard kristallisatielaboratoria. Vier verschillende eiwitten, waaronder twee membraaneiwitten, worden gebruikt om deze aanpak te demonstreren en te valideren als een effectieve methode voor high-throughput (HTP) eiwitkristallografie.

figure-introduction-2
Figuur 2: Kristallisatieworkflow met behulp van de microdialyseplaat . (A) Verwijdering van de rode kleefstof "afdekfolie". (B) Het doseren van de eiwitdruppels in elk van de druppelputten. (C) De putten zijn bedekt met de UV-"afdekfolie". (D) De plaat wordt omgekeerd om de dialyseoplossingen (of kristallisatiescherm) toe te voegen. (E) De plaat wordt verzegeld en geïncubeerd. (F,G) Microscoop inspectie van de druppels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het gebruik van deze kristallisatie door dialyseprotocol werd gedemonstreerd met behulp van de 0,5 ml dialysatorbuis (figuur 3) voor de grootschalige (honderden tot duizenden) productie van microkristallen, geschikt voor state-of-the-art gegevensverzamelingsmethoden zoals seriële kristallografie in zowel XFEL-faciliteiten 20,21,22,23,24 als synchrotrons25,26,27 , evenals voor MicroED 28,29,30-benaderingen.

figure-introduction-3
Figuur 3: Grootschalige microdialysekristallisatie met behulp van de dialysatorbuis. (A) Schematische weergave van de 0,5 ml dialysatorbuis. (B) Zijaanzicht van een bekerglas met de kristallisatieoplossing en het drijvende buizenrek met een dialysatorbuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van eiwitmonsters

  1. Bereid (via recombinante methoden of anderszins) en zuiver het eiwit (de eiwitten) van belang in een geschikte buffer (d.w.z. een die geschikt is voor eiwitstabiliteit en kristallisatie) die is gefilterd met een filter van 0,22 μm (zie materiaaltabel). Evalueer de eiwitkwaliteit (in termen van zuiverheid, polydispersiteit en stabiliteit) voorafgaand aan kristallisatie31.
    OPMERKING: Zie de sectie representatieve resultaten voor meer informatie over de eiwitten en buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt.
  2. Concentreer het monster tot 10-50 mg.mL-1 of hoger (afhankelijk van het eiwitdoel) met behulp van de juiste MWCO-concentrator (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Het geconcentreerde monster kan onmiddellijk worden gebruikt voor kristallisatie of bevroren worden opgeslagen bij -80 °C.
  3. Als het eiwit is ingevroren, centrifugeer het monster dan gedurende 10 minuten in een bench-top centrifuge (≥ 16.000 × g, bij kamertemperatuur of 4 °C) om ongewenst materiaal (bv. neerslag) te pelleteren en te verwijderen.
  4. Aliquot het eiwit in schone 200 μL PCR-buisjes. Bewaar het op ijs of bij 4 °C als het eiwit bij kamertemperatuur instabiel is.

2. De microdialyseplaat instellen

OPMERKING: De in de handel verkrijgbare microdialyseplaat (zie materiaaltabel) bestaat uit twee zijden ('eiwitzijde' en 'bufferzijde') met een geregenereerd cellulosemembraan (beschikbaar in verschillende MWCO's), zoals weergegeven in figuur 2.

  1. Met de op de plaat georiënteerde eiwitzijde naar boven, verwijder en verwijder de zelfklevende afdekband (figuur 2A) van de 200 μm drukklevende afstandhouder. Let op de positie van goed A1.
  2. Laad met behulp van een meerkanaalspipet maximaal 3,2 μl eiwit (stap 1.4) in elke put (figuur 2B).
    OPMERKING: Het eiwit kan ook worden geladen met behulp van een herhaalde doseerpipet. Het gebruik van een eenkanaals pipet is mogelijk, maar het verhoogt de kans op gedeeltelijke uitdroging van de druppels als gevolg van de verlengde laadtijd.
  3. Plaats de UV-afdekfolie van 200 μm (zie materiaaltabel) over de 96-putplaat en controleer de integriteit ervan (figuur 2C). Zorg ervoor dat de beschermfolie naar boven is gericht.
  4. Gebruik een afdichtingspeddel (zie materiaaltabel), druk de UV-afdekfolie naar beneden om de druklijm te activeren en af te dichten.
  5. Keer de plaat om en let op de positie van put A1. Zorg ervoor dat de plaat met de bufferzijde naar boven is georiënteerd en dat de putposities zijn gespiegeld (figuur 2D).
  6. Laad met behulp van een meerkanaalspipet maximaal 350 μL van de dialyseoplossing in elk van de putten (figuur 2D).
    OPMERKING: In deze stap kunnen in de handel verkrijgbare kristallisatieschermen (schaarse matrixschermen) of in het laboratorium gemaakte aangepaste schermen (rasterschermen) worden gebruikt (zie materiaaltabel).
  7. Sluit de putten zorgvuldig af met de 'reservoir cover film' (zie Materiaaltabel) (Figuur 2E).
  8. Plaats de plaat (bufferzijde naar boven) in een geschikte temperatuurgeregelde incubator (20 °C) voor kristalgroei.
    OPMERKING: Voor de eiwitten die voor dit onderzoek zijn geselecteerd, begonnen de kristallen tussen 1-8 uur bij 20 °C te verschijnen.
  9. Om onder de microscoop op kristallen te inspecteren, keert u de plaat om om de eiwitzijde naar boven te brengen en verwijdert u de beschermende film van de UV-afdekfolie van 200 μm (stap 2.3), zoals weergegeven in figuur 2F,G.

3. Grootschalige kristallisatie met behulp van dialysatorbuizen

OPMERKING: Zodra de kristallisatieomstandigheden zijn onderzocht met behulp van de microdialyseplaat, kan grootschalige kristallisatie van het eiwit (voor seriële kristallografie of andere doeleinden) worden uitgevoerd met behulp van de dialysatorbuis, zoals weergegeven in figuur 3. Net als de microdialyseplaat zijn deze apparaten verkrijgbaar met 3, 5, 10 en 30 kDa MWCO-dialysemembranen.

  1. Bereid de geoptimaliseerde kristallisatieconditie voor op de groei van microkristallen in grote containers (waarbij de omstandigheden worden geoptimaliseerd met behulp van de microdialyseplaat). Zorg ervoor dat de buffer eerder is gefilterd met een filter van 0,2 μm.
  2. Pipetteer het eiwit in de dialysatorbuis (maximaal volume van 0,5 ml) en sluit het uiteinde af met de meegeleverde rode plastic dop (figuur 3A).
  3. Plaats de dialyseerbuis van 500 μl in een container van voldoende grootte (afhankelijk van het totale volume dialyseoplossing) met het drijvende rek (zie materiaaltabel), zoals weergegeven in figuur 3B.
    OPMERKING: Het zwevende rek dat bij de dialyseerkit wordt geleverd, biedt plaats aan maximaal 18 dialysatorbuizen tegelijk.
  4. Plaats de container stationair in een geschikte temperatuurgeregelde incubator (20 °C) voor kristalgroei.
  5. Om te inspecteren op kristallen, pipet 1-2 μL van de oplossing op een glazen dekselglaasje. Dek af met een tweede glazen afdekplaat bovenop (om overmatige uitdroging te voorkomen) en bekijk onder een microscoop (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Kristallen kunnen beschadigd raken wanneer ze tijdens de inspectie tussen twee glazen afdekplaten worden ingeklemd. Kristallen kunnen ook direct worden bekeken door de dialyseerbuis onder een stereomicroscoop met hoge vergroting te plaatsen.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vier eiwitten werden gekristalliseerd met behulp van de microdialyseplaat (met 10 kDa MWCO-membranen), waaronder twee membraaneiwitten. Het kippenei-eiwitlysozym uit het gelyofiliseerde poeder (zie tabel met materialen) werd bereid bij 50 mg.mL-1 in 20 mM NaOAc (pH 4,5) en het gelyofiliseerde thaumatine (zie tabel met materialen) werd opgelost in water tot een eindconcentratie van 25 mg.mL-1. De twee membraaneiwitten die in deze studie werden gebruikt, waren de E. coli multidrug effluxpomp AcrB en de E. coli lactosetransporter LacY. AcrB werd uitgedrukt met behulp van C43 (DE3) cellen en gezuiverd door Ni-NTA affiniteitschromatografie en grootte-uitsluitingschromatografie in 10 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl, 0,03% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) en 5% (v/v) glycerol32. Vervolgens werd het eiwit geconcentreerd met behulp van een 100 kDa MWCO centrifugaalconcentrator tot een uiteindelijke concentratie van 6 mg.mL-1. LacY werd ook uitgedrukt in C43 (DE3) cellen, gezuiverd door Ni-sepharose affiniteitschromatografie gevolgd door grootte-exclusiechromatografie in 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,03% (w/v) DDM, en geconcentreerd met een 100 kDa MWCO concentrator tot 10 mg.mL-1 4,33.

Voor de lysozym- en thaumatine-eiwitten werd de 96-well microdialyseplaat gevuld met een kristallisatierasterscherm dat intern werd voorbereid als de dialyse-oplossing, terwijl voor het membraaneiwit AcrB een rasterscherm in eigen huis werd voorbereid op basis van een eerder gepubliceerde kristallisatieconditie34. Voor LacY werden de eerste hitcondities gevonden op een commercieel scherm (zie Materiaaltabel) en verder geoptimaliseerd met een in eigen huis gemaakt rasterscherm. De kristallisatiedruppelverhouding voor lysozym, thaumatine en AcrB was 1:100, met 2 μL eiwit tot 200 μL precipitant (dialyseoplossing). LacY-kristallisatiedruppels hadden ook een verhouding van 1: 100, met 1 μL eiwit tot 100 μL dialyseoplossing, vanwege een lagere hoeveelheid beschikbaar eiwit.

Kristallen van alle vier de eiwitten, inclusief de membraaneiwitten, begonnen te verschijnen tussen 1-8 uur bij 20 °C na installatie met de microdialyseplaat. In dit geval was het niet nodig om de dialyseoplossing aan te vullen met detergent voor de membraaneiwitkristallisatie, meestal gedaan tijdens het standaard dialyseproces om membraaneiwitaggregatie te voorkomen, omdat de wasmiddelmicellen naar verwachting groter zouden zijn dan de MWCO van de dialysemembranen35.

Na de succesvolle kristallisatie van de eiwitten op de microdialyseplaat (figuur 4) werden kristallisatieomstandigheden opgemerkt en werd grootschalige kristallisatie door dialyse uitgevoerd met behulp van de dialyseerbuis met dezelfde 10 kDa MWCO-dialysemembranen. Duizenden microkristallen voor elk van de individuele eiwitten groeiden in de dialysator, zoals weergegeven in figuur 5. Voor thaumatinekristallisatie werd 250 μL eiwit op de dialysator geladen en gedialyseerd tegen 50 ml (verhouding 1:200). Voor AcrB werd 250 μL eiwit gedialyseerd tegen 25 ml dialyseoplossing (1:100). LacY-kristallisatie werd ook in dezelfde verhouding opgezet met 100 μL eiwit tot 10 ml dialyseoplossing.

figure-results-1
Figuur 4: Kristallen worden gekweekt door dialyse met behulp van de microdialyseplaat. Het protocol toont de toepasbaarheid van de opstelling met oplosbare eiwitten: (A) Lysozym werd gedialyseerd tegen 0,1 M NaOAc (pH 4,0), 0,5 M NaCl en 25% (v/v) glycerol. (B) Thaumatine werd gedialyseerd tegen 0,1 M Bis-tris propaan (pH 6,6), 1 M K/Na-tartraat en 18% (v/v) ethyleenglycol. Kristallen werden ook verkregen voor membraaneiwitten: (C) AcrB werd gedialyseerd tegen 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl en 20% (v / v) PEG-400. (D) LacY werd gedialyseerd tegen 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl en 32% (v/v) PEG-300. De beelden werden vastgelegd met een stereo hoogvergrotingsmicroscoop met een kruispolarisator. Schaalstaven: (A,B,D) = 1 mm; (C) = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 5: Representatieve beelden van membraaneiwitkristallen gekweekt door dialyse met behulp van de dialysatorbuis. (A) Afbeelding van de buis vol microkristallen (aangegeven door de zwarte pijl). (B) Microscopisch beeld van 2 μL uit een slurry van thaumatinekristallen gekweekt door dialyse met behulp van de 0,5 ml dialysatorbuis, gedialyseerd tegen 0,1 M Bis-Tris propaan (pH 6,6), 1,4 M K/Na-tartraat en 18% (v/v) ethyleenglycol. (C) Dark-field (links) en bright-field (rechts) beelden van AcrB microkristallen gekweekt door dialyse tegen 0,1 M MES (pH 5,5), 0,3 M NaCl en 20% (v/v) PEG-400. (D) Dark-field (links) en bright-field (rechts) beelden van LacY microkristallen gekweekt door dialyse tegen 0,1 M MES (pH 6,5), 0,1 M NaCl, en 32% (v/v) PEG-300. Sommige precipitaten worden waargenomen. Schaalstaven: (B,D) = 200 μm; (C) = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Momenteel is kristallisatie door dialyse de meest onderbenutte kristallisatiemethode, namelijk vanwege de lage doorvoer en de vervelende aard van de bestaande benaderingen, zoals microdialyse met knoppen. Hier volgt een eenvoudig maar robuust protocol een HTP-workflow voor eiwitkristalgroei door dialyse via een in de handel verkrijgbare microdialyseplaat en dialysatorbuis. Afhankelijk van het doeleiwit hebben de microdialyseplaat en de dialyseerbuis die in de procedure worden gebruikt, de keuze uit een dialysemembraan met een MWCO van 3, 5, 10 of 30 kDa. Het protocol kan eenvoudig worden opgezet in elke standaard kristallisatiefaciliteit en heeft het grote voordeel dat het toepasbaar is op zowel oplosbare als membraaneiwitten. Eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuurcomplexen werden echter niet getest tijdens dit protocol.

Zoals bij elke kristallisatiebenadering door dialyse, is de volumeverhouding tussen het eiwitmonster en de dialyseoplossing van cruciaal belang. In dit protocol wordt een verhouding van 1:100 tussen het monster en de dialyseoplossing aanbevolen, maar aangezien de microdialyseplaat een maximale capaciteit van 350 μL dialyseoplossing mogelijk maakt, kunnen deze verhoudingen worden onderzocht om kristaltreffers te verkrijgen. Een volume van 1-2 μL eiwit wordt gebruikt in het gepresenteerde protocol bij het opzetten van kristallisatieplaten. Dit is om ervoor te zorgen dat druppels nauwkeurig worden ingesteld met een handmatige meerkanaalspipet. Door gebruik te maken van elektronische pipetten (meerkanaals of herhaalde doseerpipetten) of HTP-vloeistofdoseerrobots kunnen druppels met lagere volumes nauwkeurig worden bereikt, waardoor de benodigde hoeveelheid eiwit wordt verlaagd. Bovendien is het, vanwege de relatief lage volumes dialysebuffer die nodig zijn voor de microdialyseplaat (in tegenstelling tot andere conventionele dialysemethoden), mogelijk (zonder het uitgebreide gebruik van middelen) om grote chemische ruimtes te verkennen, niet alleen met behulp van commercieel beschikbare kristallisatieschermen, maar ook met optimalisatieschermen (ontworpen rond de initiële kristallisatie-hitconditie).

Een cruciale stap in de gepresenteerde HTP-procedure is de tijdige toepassing van kleine eiwitvolumes (0,50-3,2 μL per aandoening) op de dialyseplaat om uitdroging en monsterverlies te beperken. Dit kan eenvoudig worden verzacht door een meerkanaalspipet, een herhaaldoseerpipet of een robotkristallisatiesysteem te gebruiken. De lange incubatietijd, zoals meer dan 2 weken, van de platen bij 20 °C kan leiden tot uitdroging van de eiwitdruppels of schade aan de recent gevormde kristallen. Het houden van de dialyseplaten in een bevochtigingskamer of een afsluitbare zak kan dit effect verlichten. Bovendien wordt het gebruik van steriele materialen en technieken aanbevolen om bacteriegroei te voorkomen.

Zoals vermeld in de inleiding, onlangs, met de toegenomen behoefte om eiwitstructuurdynamiek voor ziektemechanismen, eiwit-ligandbindingsinteracties en eiwit-eiwitinteracties te begrijpen, is het veld van eiwit-röntgenkristallografie revolutionair veranderd door de ontwikkeling van nieuwe en bestaande kristallisatietechnieken, moderne benaderingen van kristalmonsterafgifte, nieuwe generaties röntgenbronnen en nieuwe geavanceerde methoden voor gegevensverzameling en -verwerking36 ,37,38. Daarom is de komst van seriële microkristallografie bij kamertemperatuur, uitgevoerd met behulp van XFELs of synchrotronlichtbronnen, naar voren gekomen als een opmerkelijk hulpmiddel in de structurele biologie, met name op het gebied van membraaneiwitten39. Er zijn echter duizenden microkristallen nodig om voldoende gegevens te genereren voor een robuuste structuuroplossing, wat geen gemakkelijke taak is (althans niet met conventionele kristallisatiemethoden). De hier beschreven dialysekristallisatiemethode maakt de productie van een groot aantal microkristallen mogelijk. Zodra de kristallisatieconditie voor de productie van microkristallen (1-10 μm) is bepaald met behulp van een microdialyseplaat, kunnen grote hoeveelheden microkristallen met hoge dichtheid worden geproduceerd met behulp van het 0,5 ml dialysatorapparaat (figuur 5). Deze kristallen zijn bij uitstek geschikt voor gegevensverzameling met behulp van vaste doelen of vloeistofstraalmonsterafgiftesystemen27,40. Kristallen verkregen via deze methode kunnen ook geschikt zijn voor MicroED-toepassingen. Deze moeten echter mogelijk worden gefreesd tot een geschikte grootte en dikte voor deze specifieke toepassing, omdat elektronen veel sterker interageren met kristallen dan röntgenfotonen41.

Kortom, de hier beschreven kristallisatie door dialysebenadering draagt bij aan de evoluerende strategieën in eiwitkristallisatie voor structuurbepaling en breidt het scala aan inspanningen uit die kunnen worden gebruikt om nieuwe eiwitdoelen te bepalen die eerder niet succesvol waren met andere conventionele methoden.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De co-auteurs Pascelle Draper en Paul Reardon zijn in dienst van SWISSCI.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen financiering van het Department of Business, Energy and Industrial Strategy (BEIS) van het Verenigd Koninkrijk. We bedanken Alex R. Jones en Mike Shaw van het National Physical Laboratory voor hun feedback op het manuscript.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubesThermo ScientificAB0620For aliquoting protein solutions.
0.2 µm syringe filterSartorius17823----------KSurfactant-free cellulose acetate filters. For filtering dialysis solutions.
0.22 µm membrane filtersMilliporeGSTF04700Membrane filters for filtering large volumes of buffers
12-channel, variable 0.5 – 10 µL Research plus pipetteEppendorf3125000028For dispensing protein drops onto the Diaplate.
12-channel, variable 30 – 300 µL Eppendorf Research plus pipette Eppendorf3125000060For dispensing dialysis solutions on the Diaplate reservoirs.
20 mL syringeFisherbrand15889152For use with syringe filters.
96 well 2.2 mL deep-well platesThermo ScientificAB0788Polypropylene deep-well storage plates; for preparing screens using the Hamilton Microlab STARlet.
Centrifuge 5425Eppendorf5405000565With rotor FA-24x2 with a maximum g-force of 21,300 x g.
Diacon dialyserSWISSCIW72010Dialyzer tubes with a regenerated cellulose membrane with a molecular weight cut-off of 10 kDa. Ideal for protein solutions of up to 0.5 mL.
Diaplate 96-well plateSWISSCIW82010Microdialysis plate. The Diaplate consists of two sides with a regenerated cellulose membrane in-between with a molecular weight cut-off of 10 kDa.
Falcon 50 mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning352070For holding dialysis solutions.
Floating rackSWISSCIn/aIncluded in the Diacon kit
Floor-standing vibration-free incubatorMolecular DimensionsMD5-01400 L temperature-controlled incubator set to 20 °C.
Leica M205 C stereo microscopeLeicaPlanapo 1.0x objective, 7.8x – 160x zoom range with DMC 4500 camera
Lysozyme from chicken egg whiteSigma Aldrich62971Lyophilized protein
Memgold2Molecular DimensionsMD1-64Sparse-matrix screen
Microlab STARletHamiltonn/aLiquid handler system.
Reservoir cover filmSWISSCIn/aIncluded in the Diaplate kit
Reusable bottle top filterThermo ScientificDS0320-5045For fitering large volumes of buffers, for use with 0.22 µm membrane filters
Sealing paddleSWISSCIn/aIncluded in the Diaplate kit
Thaumatin from Thaumatococcus danielliiSigma AldrichT7638Lyophilized protein
UV cover filmSWISSCIn/aIncluded in the Diaplate kit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The nobel science: One hundred years of crystallography. Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).">Brooks-Bartlett, J. C., Garman, E. F. The nobel science: One hundred years of crystallography. Interdisciplinary Science Reviews. 40 (3), 244-264 (2015).
  2. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), (2020).">Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), (2020).
  3. Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).">Kwan, T. O. C., Axford, D., Moraes, I. Membrane protein crystallography in the era of modern structural biology. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2505-2524 (2020).
  4. The fine art of integral membrane protein crystallisation. Methods. 147, 150-162 (2018).">Birch, J., et al. The fine art of integral membrane protein crystallisation. Methods. 147, 150-162 (2018).
  5. Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology. Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).">Gorrec, F., Löwe, J. Automated protocols for macromolecular crystallization at the MRC laboratory of molecular biology. Journal of Visualized Experiments. 131 (131), (2018).
  6. Choosing the method of crystallization to obtain optimal results. Crystals. 9 (2), 106(2019).">Govada, L., Chayen, N. E. Choosing the method of crystallization to obtain optimal results. Crystals. 9 (2), 106(2019).
  7. Turning protein crystallisation from an art into science. Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).">Chayen, N. E. Turning protein crystallisation from an art into science. Current Opinion in Structural Biology. 14 (5), 577-583 (2004).
  8. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).">McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  9. Protein crystallography: methods and protocols. Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).">Gulbis, J. Protein crystallography: methods and protocols. Crystallography Reviews. 24 (2), 136-143 (2018).
  10. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).">D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  11. Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).">Shaw Stewart,, D, P., Kolek, S. A., Briggs, R. A., Chayen, N. E., Baldock, P. F. Random microseeding: a theoretical and practical exploration of seed stability and seeding techniques for successful protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
  12. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).">Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20 (2), 296-310 (2020).
  13. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).">Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), 686-698 (2020).
  14. Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).">Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova-Spano, M. Optimization of crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Journal of Visualized Experiments. 169, (2021).
  15. Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).">Jaho, S., et al. Crystallization of proteins on chip by microdialysis for in situ X-ray diffraction studies. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
  16. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. Journal of Visualized Experiments. 49, 2501(2011).">Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. Journal of Visualized Experiments. 49, 2501(2011).
  17. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).">Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. Journal of Visualized Experiments. 59, (2012).
  18. Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).">Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: Current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922. , 61-72 (2016).
  19. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).">Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semi-permeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20 (6), 3927-3936 (2020).
  20. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).">Neutze, R., Wouts, R., Vander Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  21. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).">Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-78 (2011).
  22. Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology. Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).">Mizohata, E., Nakane, T., Fukuda, Y., Nango, E., Iwata, S. Serial femtosecond crystallography at the SACLA: breakthrough to dynamic structural biology. Biophysical Reviews. 10 (2), 209-218 (2018).
  23. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).">Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  24. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity. Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).">Johansson, L. C., et al. XFEL structures of the human MT2 melatonin receptor reveal the basis of subtype selectivity. Nature. 569 (7755), 289-292 (2019).
  25. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).">Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (4), 373-378 (2017).
  26. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature communications. 8 (1), 542(2017).">Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature communications. 8 (1), 542(2017).
  27. Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).">Axford, D., et al. Two states of a light-sensitive membrane protein captured at room temperature using thin-film sample mounts. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 52-58 (2022).
  28. The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED). Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).">Nannenga, B. L., Gonen, T. The cryo-EM method microcrystal electron diffraction (MicroED). Nature Methods. 16 (5), 369-379 (2019).
  29. Beyond protein structure determination with MicroED. Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).">Nguyen, C., Gonen, T. Beyond protein structure determination with MicroED. Current Opinion in Structural Biology. 64, 51-58 (2020).
  30. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).">Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annual Review of Biochemistry. 90, 431-450 (2021).
  31. Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605(2019).">Kwan, T. O. C., et al. Selection of biophysical methods for characterisation of membrane proteins. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 2605(2019).
  32. crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).">Pos, K. M., Purification Diederichs, K. crystallization and preliminary diffraction studies of AcrB, an inner-membrane multi-drug efflux protein. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1865-1867 (2002).
  33. Structural determination of wild-type lactose permease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).">Guan, L., Mirza, O., Verner, G., Iwata, S., Kaback, H. R. Structural determination of wild-type lactose permease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (39), 15294-15298 (2007).
  34. In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study. Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).">Kwan, T. O. C., Reis, R., Moraes, I. In situ measurements of polypeptide samples by dynamic light scattering: membrane proteins, a case study. Methods in Molecular Biology. , 189-202 (2021).
  35. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).">Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. (1-2), 105-117 (2004).
  36. A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 7 (2), 024701(2020).">Wickstrand, C., et al. A tool for visualizing protein motions in time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 7 (2), 024701(2020).
  37. Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs. Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).">Orville, A. M. Recent results in time resolved serial femtosecond crystallography at XFELs. Current Opinion in Structural Biology. 65, 193-208 (2020).
  38. Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).">Schulz, E. C., Yorke, B. A., Pearson, A. R., Mehrabi, P. Best practices for time-resolved serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 78 (1), 14-29 (2022).
  39. Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers. Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).">Neutze, R., Brändén, G., Schertler, G. F. Membrane protein structural biology using X-ray free eletron lasers. Current Opinion in Structural Biology. 33, 115-125 (2015).
  40. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).">Wierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).
  41. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).">Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein CrystallizationMicrodialysis CrystallizationHigh Throughput Screening96 Well PlateDialysis PlateCrystal GrowthSerial CrystallographyMembrane ProteinsX Ray CrystallographyMicrocrystal Formation

Related Articles