Methodenartikel

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

DOI:

10.3791/64750

⸱

20 oktober 2023

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, 2Inserm U1280, 3Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraancontactplaatsen (MCS'en) zijn gebieden met nauwe membraannabijheid die de dynamische uitwisseling van diverse biomoleculen (d.w.z. calcium en lipiden) tussen de naast elkaar geplaatste organellen mogelijk maken en reguleren zonder dat er sprake is van membraanfusie. MCS'en zijn essentieel voor cellulaire homeostase en hun functies worden verzekerd door de residente componenten, die vaak bestaan als multimere eiwitcomplexen. MCS'en omvatten vaak het endoplasmatisch reticulum (ER), een belangrijke plaats van lipidesynthese en cellulaire calciumopslag, en zijn vooral belangrijk voor organellen, zoals de mitochondriën, die zijn uitgesloten van de klassieke vesiculaire transportroutes. In de afgelopen jaren zijn MCS'en tussen het ER en mitochondriën uitgebreid bestudeerd, omdat hun functies een sterke invloed hebben op het cellulaire metabolisme / bio-energetica. Verschillende eiwitten zijn begonnen te worden geïdentificeerd op deze contactplaatsen, waaronder membraanbinders, calciumkanalen en lipideoverdrachtseiwitten, waardoor de behoefte aan nieuwe methodologieën en technische benaderingen om deze MCS-componenten te bestuderen, toeneemt. Hier beschrijven we een protocol dat bestaat uit gecombineerde technische benaderingen, waaronder proximity ligation assay (PLA), mitochondriale kleuring en 3D-beeldvormingssegmentatie, waarmee eiwitten kunnen worden gedetecteerd die fysiek dicht (>40 nm) bij elkaar zijn en die zich op hetzelfde membraan bevinden bij ER-mitochondriale MCS'en. We gebruikten bijvoorbeeld twee ER-verankerde lipideoverdrachtseiwitten, ORP5 en ORP8, waarvan eerder is aangetoond dat ze interageren en lokaliseren bij ER-mitochondriën en ER-plasmamembraan MCS'en. Door de ORP5-ORP8 PLA te associëren met celbeeldvormingssoftware-analyse, was het mogelijk om de afstand van het ORP5-ORP8-complex tot het mitochondriale oppervlak te schatten en te bepalen dat ongeveer 50% van de ORP5-ORP8 PLA-interactie plaatsvindt op ER-subdomeinen in de nabijheid van mitochondriën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inter-organel communicatie is een bepalend kenmerk van eukaryote cellen. Een manier waarop organellen communiceren, is door membraancontactplaatsen (MCS'en) te vormen, die nauwe membraanopposities zijn tussen twee organellen die worden onderhouden door structurele en functionele eiwitten, zoals tethers, lipideoverdrachtseiwitten en calciumkanalen1. MCS'en kunnen worden vastgesteld tussen vergelijkbare of verschillende organellen en ze bemiddelen de uitwisseling van cellulaire componenten, wat belangrijk is voor het behoud van cellulaire homeostase. Tot op heden zijn verschillende MCS'en geïdentificeerd, waaronder endoplasmatisch reticulum (ER)-mitochondriën, ER-plasmamembraan (PM) en ER-lipidedruppel (LD) contacten1. Onder hen behoren die gevormd tussen het ER en de mitochondriën (MERCSs) tot de meest bestudeerde omdat ze betrokken zijn bij de regulatie van verschillende cellulaire functies, waaronder lipide- en calciumhomeostase2. Omdat mitochondriën grotendeels zijn uitgesloten van de klassieke vesiculaire transportroutes, vertrouwen ze op MERCS en op hun moleculaire bestanddelen om belangrijke lipiden of lipideprecursoren uit het ER te importeren. Het niet-vesiculaire transport van deze lipiden over MERCSs zorgt voor het behoud van een goede mitochondriale lipidesamenstelling, evenals hun functionele en structurele integriteit3.

Gezien de cruciale betrokkenheid van MCS'en bij verschillende cellulaire functies, is de interesse in het bieden van een dieper inzicht in hun moleculaire componenten de afgelopen jaren sterk toegenomen. Verschillende soorten op beeldvorming gebaseerde benaderingen zijn gebruikt om de kennis over MCS'en te vergroten. Onder hen is de fluorescentiesonde-gebaseerde proximity ligation assay (PLA) op grote schaal gebruikt als een indicator van de overvloed aan MCS'en door inter-organel eiwit-eiwitinteracties (in een detectiebereik van 40 nm) te detecteren op endogene niveaus4. MERCS'en zijn bijvoorbeeld gevisualiseerd en gekwantificeerd door PLA te gebruiken tussen verschillende mitochondriën-ER-eiwitparen, waaronder VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 en PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Hoewel deze technologie is gebruikt om inter-organel eiwit-eiwitinteracties te detecteren en te kwantificeren die aanwezig zijn bij de MCS 5,7,9,10,11, combineerden de meeste studies PLA niet met organelkleuring. Daarom is er nog geen kwantitatieve methode ontwikkeld waarmee de nabijheid tussen PLA-interacties en geassocieerde organellen kan worden gemeten. Tot nu toe is in het geval van ER-eiwitten hun interactie binnen membraansubdomeinen in contact met andere organellen dus niet onderscheiden van hun interactie binnen het wijd verspreide ER-netwerk.

Hier beschrijven we een protocol om PLA-interacties te detecteren tussen eiwitten die zich in het membraan van hetzelfde organel bevinden en om hun nabijheid tot het membraan van het partnerorganel in het MCS te analyseren. Dit protocol is ontwikkeld op basis van twee premissen: 1) eerdere studies die aantonen dat, in overexpressieomstandigheden, de ER-lipideoverdrachtseiwitten ORP5 en ORP8 co-lokaliseren en interageren op ER-mitochondriën en ER-PM MCSs 12,13,14,15 en dat ORP5 lokaliseert bij ER-LD-contacten 16,17; 2) bestaande technologieën, waaronder PLA, confocale microscopie, organeletikettering en 3D-beeldvormingsanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mitochondriale kleuring en proximity ligation assay (PLA)

  1. Plaat 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-cellen, onderhouden in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren bij 37 °C met 5% CO2, in 13 mm glazen afdekplaten in1,5 in 24-putplaten met een verdunning die 75% -90% celsamenvloeiing op de dag van de procedure mogelijk maakt.
    OPMERKING: Van belang is dat HeLa-cellen kunnen worden onderworpen aan aanvullende behandelingen, zoals siRNA-behandeling en / of DNA-plasmidetransfectie, vóór mitochondriale kleuring en PLA.
  2. Mitochondriale kleuring
    1. Was de cellen eenmaal in een serumvrij medium dat is voorverwarmd op 37 °C. Incubeer de cellen met voorverwarmd serumvrij medium gedurende 10 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
    2. Bereid 1 μM rode mitochondriale marker in voorverwarmd serumvrij medium.
    3. Incubeer de cellen met 500 μL mitochondriale markeroplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2. Houd tijdens de mitochondriale markerbehandeling en de volgende stappen van het protocol de cellen op coverslips zoveel mogelijk beschermd tegen licht.
    4. Na de incubatie was u de cellen 1x in voorverwarmd serumvrij medium en 2x in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voer deze stap zo snel mogelijk uit, omdat lange wasstappen vóór fixatie de mitochondriale morfologie kunnen beïnvloeden.
    5. Verwijder de 1x PBS van de afdekstroken en bevestig de cellen door ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (in het donker) onder de chemische kap te incuberen in vers bereide 4% PFA (in 1x PBS). Was 3x gedurende 2 minuten in 500 μL of 1x PBS (met behulp van wegwerppipetten of een vacuümsysteem aangesloten op een pomp).
    6. Verwijder de 1x PBS en incuber de coverslips met 500 μL van 50mM NH4Cl gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (in het donker). Was 1x gedurende 2 minuten in 500 μL of 1x PSB met behulp van een vacuümsysteem.
    7. Was 3x gedurende 2 min in 500 μL blokkeringsbuffer 1 (BB1, 1%BSA, 0,1% saponine in 1x PBS) voor de ORP5-ORP8 PLA of blokkeringsbuffer 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% normaal geitenserum, 0,1 saponine in 1x PBS) voor de ORP8-PTPIP51 PLA.
    8. Breng de afdekstroken van de 24-putplaat over in een vochtigheidskamer. Voeg na het overbrengen van de coverslips in de kamer 100 μL BB (BB1 of BB2, afhankelijk van de gebruikte antilichamenparen) toe om uitdroging te voorkomen.
      OPMERKING: Een vochtkamer beschermd tegen licht kan gemakkelijk en snel worden verkregen door een petrischaal (plastic of glas) in aluminiumfolie te wikkelen en enkele stukken nat keukenpapier toe te voegen aan de periferie van de petrischaal.
  3. Nabijheidsligatietest (PLA)
    OPMERKING: Het PLA-protocol volgt de instructies van de fabrikant met kleine wijzigingen.
    1. Incubatie van primaire antilichamen
      1. Bereid de primaire antilichaamwerkoplossing voor. Verdun konijn anti-ORP5 (1:150) plus muis anti-ORP8 (1:200) in BB1, muis anti-ORP8 (1:200) plus konijn anti-PTPIP51 (1:200) in BB2, en konijn anti-ORP5 (1:150) plus muis anti-PTPIP51 (1:200) in BB1. Bereid (ten minste) 40 μL primaire antilichaamoplossing per coverslip (bijv. 0,27 μL konijn anti-ORP5, 0,2 μL muis anti-ORP8, 39,53 μL BB1).
      2. Verwijder de BB uit de vorige wasbeurt (stap 1.2.8) met behulp van een vacuümsysteem en voeg 40 μL primaire antilichaamoplossing toe aan de dekzeilen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtigheidskamer beschermd tegen licht.
    2. Was coverslips 3x gedurende 5 min met 100 μL van de bijbehorende BB met behulp van het vacuümsysteem.
    3. PLA sonde incubatie
      1. Bereid de werkoplossing van de PLA-sondes voor. Verdun konijn PLUS (1:5) en muis MINUS (1:5) PLA sondes in BB, en meng. Bereid voor elke coverslip (ten minste) 40 μL PLA-sondeoplossing (bijv. 8 μL rabbit PLUS PLA-sonde, 8 μL muis MINUS PLA-sonde, 24 μL BB). Laat de PLA-sondeoplossing voor gebruik 20 minuten op kamertemperatuur staan.
      2. Verwijder de BB van de afdekstroken (uit stap 1.3.2) met behulp van een vacuümsysteem en voeg 40 μL PLA-sondeoplossing toe aan de afdekplaten. Incubeer gedurende 1 uur bij 37°C in een vochtigheidskamer beschermd tegen het licht.
    4. Was de coverslips 2x gedurende 5 min in 100 μL of 1x wasbuffer A op kamertemperatuur.
    5. Afbinding
      1. Verdun 5x ligatiebuffer tot 1:5 in ultrazuiver water en meng. Bereid voor elke deklaag (ten minste) 40 μL ligatieoplossing (8 μL 5x ligatiebuffer, 31 μL ultrazuiver water).
      2. Voeg het ligase (1 U/μL, meegeleverd in de PLA-kit) toe aan 1x ligatiebuffer bereid in de vorige stap bij een verdunning van 1:40 en meng.
      3. Verwijder 1x wasbuffer A van de afdekstroken (vanaf stap 1.3.4) met behulp van een vacuümsysteem, voeg 40 μL ligase-oplossing toe aan de afdekstroken en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een vochtigheidskamer die beschermd is tegen het licht.
    6. Was de coverslips 2x gedurende 2 min in 100 μL of 1x wasbuffer A op kamertemperatuur met behulp van het vacuümsysteem.
    7. Polymerisatie
      1. Verdun 5x versterkingsbuffer 1:5 in ultrazuiver water en meng. Bereid voor elke coverslip (ten minste) 40 μL amplificatieoplossing (8 μL 5x versterkingsbuffer, 31,5 μL ultrazuiver water).
      2. Voeg het polymerase (10 U/μL, meegeleverd in de PLA-kit) toe aan de 1x polymerisatiebuffer die in de vorige stap is bereid bij een verdunning van 1:80 en meng.
      3. Verwijder 1x wasbuffer A van de afdekstroken (vanaf stap 1.3.6) met behulp van een vacuümsysteem, voeg 40 μL polymeraseoplossing toe aan de afdekstroken en incubeer gedurende 1 uur en 40 minuten bij 37 °C in een vochtigheidskamer die beschermd is tegen het licht.
    8. Verwijder de polymerase-oplossing uit de afdekstroken en was 2x gedurende 10 minuten in 100 μL 1x wasbuffer B op kamertemperatuur in een vochtigheidskamer beschermd tegen het licht.
    9. Was de coverslips 1x gedurende 1 min in 100 μL of 0,001x wasbuffer B op kamertemperatuur in een vochtkamer beschermd tegen het licht.
    10. Monteer de coverslips op glasplaten voor microscopie met behulp van montagemedium met DAPI (concentratie tussen 1,6-0,4 μg/ml). Sluit af met nagellak.

2. Beeldacquisitie

  1. Bekijk de PLA-resultaten en verkrijg beelden met behulp van fluorescentie confocale microscopie met een 63x olie-onderdompelingsobjectief met behulp van de bijbehorende software.
  2. Stel de fluorescentie-excitatie in met behulp van een 405 nm laserdiode of een witlichtlaser en verzamel de spectrale vensters met GaAsP PMT's of hybride detectoren. Op elk brandpuntsvlak (verspreid over 300 nm) verwerven de fluorescentiesignalen voor PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) en mitochondriën (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Beeldverwerking en beoordeling van PLA-vlekken geassocieerd met mitochondriën

  1. Verwerk de confocale beelden met behulp van een software voor beeldanalyse die afstandskaarten tussen de cellulaire componenten genereert. Volg de onderstaande stappen om 3D-reconstituties van PLA-spots en het mitochondriale netwerk te genereren en toegang te krijgen tot de afstand tussen hen met behulp van celbeeldvormingssoftware (figuur 1).
  2. Installatie van de 3D-afstandskaartuitbreiding
    1. Installeer zowel het celanalysesoftwarepakket met de XT-optie als de MATLAB-software of alleen een MATLAB-compilerruntime (MRC), die gratis kan worden gedownload van de website.
    2. Stel de celanalysesoftware in om MATLAB te starten wanneer een XTension als volgt wordt gestart: selecteer in de optie Imaris (Mac OS X) of het menu Bewerken (Windows) Voorkeuren, ga naar het deelvenster Aangepaste hulpmiddelen en stel vervolgens het pad in:
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe voor Windows of/Programma's/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab voor Mac OS X.
  3. Importeer de afbeeldingen in de software
    1. Converteer de confocale stapelafbeeldingen naar een . IMS-bestand, rechtstreeks via de Arena-sectie of met behulp van de zelfstandige bestandsconverter die batchconversie mogelijk maakt.
    2. Controleer na het importeren of de afbeeldingen goed gekalibreerd blijven. Klik op Edit > Image Properties > Image Geometry en controleer of de voxelgrootte in X en Y overeenkomt met de verwachte pixelgrootte voor de werkelijke afbeelding (zie beeldkalibratie in de acquisitiesoftware) en of de voxelgrootte in Z overeenkomt met de stap die door de microscoop wordt toegepast om de Z-stack te genereren. Als de waarden niet correct zijn, wijzigt u ze om een juiste schatting van de afstanden in de volgende stappen te garanderen.
    3. Pas het contrast van de verschillende kanalen in het menu Beeldschermaanpassing aan door op Bewerken > Weergaveaanpassing weergeven te klikken. Pas elk kanaal afzonderlijk aan om de weergave van elke kleur te optimaliseren. Deze stap heeft geen directe invloed op de afbeeldingswaarden, maar is essentieel om nauwkeurige drempelwaarden in te stellen of zwakke objecten te detecteren.
    4. Beperk de analyse tot één cel door de afbeelding bij te snijden met de opties Bewerken > 3D bijsnijden. Als u een andere cel in hetzelfde gezichtsveld wilt analyseren, opent u dezelfde afbeelding opnieuw en snijdt u deze anders bij.
  4. ORP5-ORP8 spot detectie
    1. Detecteer de PLA-signalen die worden gegenereerd op de locatie van ORP5- en ORP8-interactie door op de optie Nieuwe vlekken toevoegen te klikken, waarmee een nieuwe set objecten wordt gemaakt en de wizard voor spotdetectie wordt geopend.
    2. Selecteer het kanaal waarop de spotdetectie moet worden uitgevoerd.
    3. Pas de geschatte XY-diameter aan (het bereik moet worden aangepast als de objectgrootte verschilt) om het spotdetectiealgoritme te helpen de interessante objecten te vinden. Houd er rekening mee dat als de gekozen waarde te hoog is, de objecten in de buurt zullen samensmelten. Als de waarde te klein is, kan één signaal als meerdere objecten worden beschouwd of kunnen afwijkende signalen worden gedetecteerd.
    4. Klik op Achtergrondaftrek om de achtergrond van de afbeelding te verwijderen voordat u de spotdetectie uitvoert om het lokale contrast rond de interessante objecten te verbeteren.
    5. Pas de spotdetectiedrempel aan door de kwaliteit (intensiteit in het objectmidden) te behouden als de drempelparameter en de automatische drempel van de software, of wijzig deze waarde enigszins om alle objecten te detecteren. Zodra de spotdetectie is voltooid, slaat u de detectieparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken.
  5. Mitochondriale netwerkdetectie
    1. Detecteer het mitochondriale netwerk om een oppervlakteweergave te genereren door op Nieuwe oppervlakken toevoegen te klikken om een nieuw object te maken en de wizard voor oppervlaktedetectie te openen.
    2. Selecteer het kanaal waarop het maken van het oppervlak moet worden uitgevoerd.
    3. Pas een Gauss-filter toe om een gladder oppervlak te verkrijgen door op het selectievakje Vloeiend te klikken en een drempelwaarde in te stellen die de kleinste details aangeeft die op het oppervlak waarneembaar zijn.
    4. Voer een achtergrondaftrek uit om de lokale contrasten te verbeteren en te helpen bij de drempelstap.
    5. Pas de drempel aan om het mitochondriale netwerk te detecteren op basis van de intensiteit van het signaal. Als het moeilijk is om de drempel goed in te stellen, is het raadzaam om terug te gaan naar de vorige stap om de mate van vloeiendheid en achtergrondaftrek aan te passen.
    6. Breng indien nodig een filter aan op het oppervlak om kleine resten als gevolg van de drempel te verwijderen. Om dit te doen, selecteert u het filter Aantal Voxels in het venster Classificeren oppervlak en speelt u met de bovenste en onderste drempels om alleen de objecten van belang te behouden. Zodra het maken van het oppervlak is voltooid, slaat u de aanmaakparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken.
  6. Generatie van de 3D-afstandskaart rond de mitochondriën
    1. Genereer een afstandskaart buiten het mitochondriale oppervlak die eerder als volgt is gemaakt. Selecteer het mitochondriale oppervlak in de scèneboomdoos. Klik op Beeldverwerking > Surfaces Function > Distance Transformation. Dit wordt een Matlab XTension genoemd die de gebruiker vraagt om te kiezen of de kaart buiten of binnen het objectoppervlak moet worden berekend.
    2. Selecteer Object aan buitenoppervlak om de afstand tussen de PLA-vlekken en het oppervlak van de mitochondriën te meten. Eenmaal gegenereerd, wordt de afstandskaart weergegeven als een nieuw kanaal in het weergave-aanpassingsvenster. In dit kanaal heeft elke pixel een waarde die overeenkomt met de afstand tot de dichtstbijzijnde mitochondriën.
  7. Extractie van de afstanden van de objecten tot het dichtstbijzijnde mitochondrion
    1. Om de afstand van elk punt tot het dichtstbijzijnde mitochondrion te meten en de dichtstbijzijnde te identificeren en te visualiseren, selecteert u de vlekken die eerder zijn gegenereerd in de scèneboomvak.
    2. Selecteer in de statistieken en het gedetailleerde logboek Specifieke waarden (om één meting voor elke plek te verkrijgen). Selecteer Center Intensity Ch=X (waarbij X overeenkomt met het nummer van het afstandskaartkanaal). Dit meet de waarde van elk spotcentrum, dat overeenkomt met de afstand tot het dichtstbijzijnde mitochondrion, in de afstandskaart.
    3. Exporteer de gegevens als een .csv bestand door op het diskettepictogram linksonder in het venster te klikken.
    4. Als u een subpopulatie van vlekken wilt extraheren op basis van hun afstanden tot mitochondriën, selecteert u de vlekken in de scènestructuur en klikt u op het tabblad Filters .
    5. Voeg in dit venster een nieuw filter toe dat opnieuw is gebaseerd op de Center Intensity Ch=X en haal de vlekken op minder dan 380 nm afstand van mitochondriën door de onderste drempel in te stellen op 0 μm en de bovenste drempel op 0,380 μm.
      OPMERKING: De drempel van 380 nm werd geschat op basis van een PLA-reactie inclusief de associatie tussen de primaire en secundaire antilichamen (30 nm) plus de helft van de volledige breedte bij de helft van het maximum (FWHM) van de PLA-amplificatiesignalen (350 nm).
    6. Als u zich wilt concentreren op de geselecteerde vlekken en ze bijvoorbeeld een duidelijke kleur wilt geven, voert u een duplicatiestap uit door op de knop Selectie dupliceren naar nieuwe vlekken te drukken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het hierboven beschreven protocol detecteerden we de interactieplaatsen van twee ER-verankerde lipideoverdrachtseiwitten, ORP5 en ORP8, en beoordeelden we hun voorkomen bij ER-membraansubdomeinen in contact met andere organellen, in het bijzonder met de mitochondriën. Daarvoor werd het mitochondriale netwerk in HeLa-cellen gekleurd met een rode mitochondriale marker en werden ORP5-ORP8 PLA-groene vlekken gedetecteerd na fixatie met behulp van de primaire antilichamen anti-ORP5 en anti-ORP8, waarvan de spec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is ontworpen om inter-organel eiwit PLA interacties bij MCS'en, in het bijzonder bij MERCSs, te identificeren en te kwantificeren. De nieuwigheid van het protocol is dat het PLA combineert met de etikettering van meerdere organellen, confocale microscopie en 3D-beeldanalyse om PLA-interacties tussen twee eiwitten in hetzelfde membraan te lokaliseren en te kwantificeren, in dit geval binnen het ER-membraan in de nabijheid van het membraan van mitochondriën (MAM) of met de MAM en LDs tegelijkertijd. Dit protoc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), het ATIP-Avenir Program, de Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), en de Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plantenwetenschappen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)Gibco14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)VWR21236.291
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos red MitoTrackerInvitrogenM7512rode mitochondriale marker
Confocal inverted microscope SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well PlatesMerckCLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green SigmaDUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI SigmaDUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS SigmaDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigmaDUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Gibco51985026serumvrij medium
Imaris software v 9.3BitplaneN/Acelbeeldvorming software
Incubator UINCU-line IL10VWR390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) Knittel Glass
mouse anti-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
rabbit anti-ORP5 SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase freeInvitrogen10977-035

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
  3. Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
  4. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  5. Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
  6. Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443(2021).
  7. Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
  8. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899(2016).
  9. Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074(2021).
  10. Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
  11. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
  12. Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  13. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  14. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757(2017).
  15. Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364(2022).
  16. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162(2020).
  17. Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107(2022).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Proximity Ligation AssayMembraancontactplaatsenKwantificering van Prote ne interactiesOrganelkleuring3D beeldsegmentatieMitochondri le Geassocieerde MembranenConfocale BeeldvormingORP5 ORP8 interactieIntracellulaire Communicatie

Gerelateerde artikelen