Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

Summary

Multiplexed barcoding beeldanalyse heeft onlangs de karakterisering van de tumormicro-omgeving verbeterd, waardoor uitgebreide studies van celsamenstelling, functionele toestand en cel-celinteracties mogelijk zijn. Hierin beschrijven we een kleurings- en beeldvormingsprotocol met behulp van de barcodering van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen en cyclusbeeldvorming, waardoor het gebruik van een hoogdimensionale beeldanalysetechniek mogelijk is.

Abstract

Multiplexed imaging-technologie met behulp van antilichaam barcoding met oligonucleotiden, die sequentieel meerdere epitopen in dezelfde weefselsectie detecteert, is een effectieve methodologie voor tumorevaluatie die het begrip van de tumormicro-omgeving verbetert. De visualisatie van eiwitexpressie in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefsels wordt bereikt wanneer een specifieke fluorofoor wordt gegloeid tot een antilichaamgebonden barcode via complementaire oligonucleotiden en vervolgens monsterbeeldvorming wordt uitgevoerd; Inderdaad, deze methode maakt het gebruik van aanpasbare panelen van meer dan 40 antilichamen in een enkele weefselkleuringsreactie mogelijk. Deze methode is compatibel met vers bevroren weefsel, formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed weefsel, gekweekte cellen en perifere bloed mononucleaire cellen, wat betekent dat onderzoekers deze technologie kunnen gebruiken om een verscheidenheid aan monstertypen te bekijken met een eencellige resolutie. Deze methode begint met een handmatig kleurings- en fixatieprotocol en alle barcodes van antilichamen worden aangebracht met behulp van een antilichaamcocktail. Het kleuringsvloeistofinstrument is volledig geautomatiseerd en voert iteratieve cycli uit van etikettering, beeldvorming en het verwijderen van spectraal verschillende fluoroforen totdat alle biomarkers zijn afgebeeld met behulp van een standaard fluorescentiemicroscoop. De beelden worden vervolgens verzameld en gecompileerd over alle beeldvormingscycli om een eencellige resolutie voor alle markers te bereiken. De eenstapskleuring en zachte fluorofoorverwijdering maken niet alleen een sterk gemultiplexte biomarkeranalyse mogelijk, maar behouden ook het monster voor aanvullende downstream-analyse indien gewenst (bijv. Hematoxyline- en eosinekleuring). Bovendien maakt de beeldanalysesoftware beeldverwerking mogelijk - driftcompensatie, achtergrondaftrekking, celsegmentatie en clustering - evenals de visualisatie en analyse van de afbeeldingen en celfenotypen voor het genereren van ruimtelijke netwerkkaarten. Samenvattend maakt deze technologie gebruik van een gecomputeriseerd microfluïdicasysteem en fluorescentiemicroscoop om iteratief gelabelde DNA-sondes te hybridiseren, in beeld te brengen en te strippen die complementair zijn aan weefselgebonden, oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen.

Introduction

De tumormicro-omgeving (TME) is extreem heterogeen, bestaande uit tumorcellen, tumorstromale cellen, immuuncellen, niet-cellulaire componenten van de extracellulaire matrix en talrijke overvloedige moleculen geproduceerd en vrijgegeven door tumor-, stromale en immuuncellen ^1,2. Accumulerend bewijs toont aan dat de TME een cruciale rol speelt bij het herprogrammeren van tumordifferentiatie, groei, invasie, metastase en respons op therapieën³.

Begrijpen hoe verschillende celtypen in de TME interageren en met elkaar communiceren via signaleringsnetwerken is essentieel voor het verbeteren van de diagnose van kanker, het optimaliseren van immunotherapie en het ontwikkelen van nieuwe behandelingen⁴. Traditionele weefselmicroscopietechnieken, waaronder immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF), worden al tientallen jaren gebruikt om de celtypen, overvloed en communicatie in tumormonsters te bestuderen. Helaas kunnen deze technieken meestal slechts één of twee eiwitmarkers in een weefselsectie evalueren en kunnen ze de complexe ruimtelijke en structurele relaties tussen deze cellen niet onthullen ^5,8,7.

In de afgelopen twee decennia zijn verschillende multiplexed imaging-technologieën ontwikkeld⁸. Deze technologieën bieden veel betere weergaven van de samenstelling, functie en locatie van immuuncellen binnen de TME, wat leidt tot snelle vooruitgang in het vermogen om complexe TME's te identificeren en ruimtelijk te profileren op het niveau van één cel ^9,10. De ruimtelijke en structurele relaties van verschillende tumor- en immuuncellen in de TME staan nu in de voorhoede van biologische en klinische studies met behulp van deze multiplexed imaging-technologieën^11,12.

De recent ontwikkelde multiplexed imaging technologie met behulp van oligonucleotide-geconjugeerde antilichaam barcoding is een invloedrijk eencellig biologisch onderzoeksplatform gebaseerd op de detectie van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen in formaline-gefixeerde, paraffine-embedded (FFPE) monsters^13,14. Momenteel maakt deze multiplexed imaging-technologie de gelijktijdige beeldvorming van meer dan 100 markers in een enkele weefselsectie¹⁵ mogelijk, waardoor het aantal celtypen dat in situ te onderscheiden is, is toegenomen. Dit maakt een niveau van ruimtelijke analyse van tumor- en immuuncellen mogelijk dat niet mogelijk is met behulp van traditionele immunofenotyperingsbenaderingen¹⁶.

Hierin beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor het conjugeren van gezuiverde antilichamen tegen oligonucleotiden en het valideren van deze conjugatie met behulp van het multiplexed imaging platform en een multicycle imaging procedure met FFPE weefsel. Daarnaast beschrijven we de basisprocedures voor beeldverwerking en gegevensanalyse die met deze technologie worden gebruikt.

Protocol

Deze retrospectieve studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de University of Texas MD Anderson Cancer Center. De FFPE-weefselmonsters werden verzameld van patiënten bij MD Anderson als onderdeel van routinematige standaardzorg. Er werden geen diagnostische of therapeutische interventies uitgevoerd. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten voor het gebruik van de verzamelde monsters voor onderzoek en publicatie.

1. Antilichaambronnen die worden gebruikt voor het ontwerp van het antilichaampaneel

1. Maak een antilichaampaneel voor gemultiplexte beeldvorming na zorgvuldige overweging van de kwaliteit van de weefsels en eiwitten van belang. Drie bronnen van antilichamen worden overwogen voor het ontwerp van het antilichaampanel: 1) volledig commercieel gevalideerde antilichamen, 2) gescreende antilichamen met gemultiplexte beeldvormingstechnologie en 3) door de eindgebruiker gedeelde antilichamen.
   OPMERKING: Multiplexed imaging technology-gescreende antilichamen hebben aangetoond dat ze werken en zijn verkrijgbaar bij leveranciers. Deze gescreende antilichamen kunnen worden toegepast op multiplex beeldkleuring na oligonucleotideconjugatie door de gebruiker.
2. Als een interessant eiwit niet kan worden gevonden in de hierboven genoemde bronnen, gebruik dan de antilichaamklonen waarvan bekend is dat ze met IHC werken. Bovendien worden IgG-isotypen in plaats van IgM-klonen aanbevolen voor deze multiplexed imaging-technologie vanwege het hogere uitvalpercentage met IgM dan met IgG-klonen.

2. Vóór antilichaamconjugatie

1. Bij het identificeren van antilichaamklonen voor conjugatie met behulp van gemultiplexte beeldvormende barcodes, overweeg dan om dragervrije antilichamen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of een vergelijkbare buffer te kopen. Van dragereiwitten, waaronder BSA, gluten, glycerol en andere eiwitadditieven, is bekend dat ze de conjugatiecapaciteit verminderen.
2. Selecteer de meest geschikte antilichaamkloon en optimaliseer altijd de kleuringsomstandigheden (d.w.z. het ophalen en titreren van antigeen) vóór conjugatie. Doe dit door een niet-geconjugeerde antilichaamkloon toe te passen op positief en negatief weefsel voor dit antilichaam met behulp van standaard IF of IHC.
   OPMERKING: Als een gezuiverd antilichaam niet in de handel verkrijgbaar is, moet vóór conjugatie een antilichaamzuiveringsproces worden uitgevoerd. De zuiveringsprocedure die wordt gebruikt met antilichaamzuiveringskits wordt hierin niet besproken.

3. Antilichaam conjugatie

1. Verkrijg de antilichaamconjugatiereagentia. In de handel verkrijgbare conjugatiekits bevatten een filterblokkeringsoplossing, reductieoplossing 2, conjugatieoplossing, zuiveringsoplossing, antilichaamopslagoplossing (alle opgeslagen bij 4 °C) en reductieoplossing 1 (bewaard bij −20 °C).
2. Vervoeging
   OPMERKING: Een gezuiverd antilichaam wordt behandeld met een reductiemiddel, waardoor de gereduceerde delen van het antilichaam kunnen reageren met de gemultiplexte beeldvormende barcode die met deze technologie wordt gebruikt en zo een covalente binding vormen. Dit proces duurt ongeveer 4,5 uur en resulteert in ongeveer 120 μL geconjugeerd antilichaam, dat 1 jaar levensvatbaar is. Alle spin-down wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT) en de doorstroming wordt weggegooid, behalve in de allerlaatste stap (3.2.9), waarin een verzamelbuis het geconjugeerde antilichaam bevat.
   1. Zuig en breng 500 μL van de filterblokkerende oplossing aan met behulp van een pipet op de 50 kDa moleculaire gewicht afsnijfilterkolommen en draai gedurende 2 minuten bij 12.000 x g om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren.
      OPMERKING: Als de resterende oplossing aan de bovenkant van de kolom merkbaar is, keert u het filter in de opvangbuis om en draait u gedurende 2 minuten met 3.000 x g naar beneden.
   2. Pipetteer 50 μg van het antilichaam in een 100 μL volume oplossing voor de filterkolom en draai gedurende 8 minuten bij 12.000 x g naar beneden.
      OPMERKING: Gebruik een spectrofotometer om de concentratie van het gezuiverde antilichaam te meten en om het volume van de oplossing te berekenen dat overeenkomt met 50 μg van het antilichaam. Als het volume van de antilichaamoplossing kleiner is dan 100 μl, stelt u het volume in op 100 μl door 1x PBS toe te voegen. Houd 1 μg ongeconjugeerd antilichaam vast voor conjugatiebevestiging (stap 4.4).
   3. Pipetteer 260 μL reductiebasismengsel (20 μL reductieoplossing 1 gemengd met 825 μL reductieoplossing 2, wat voldoende is voor drie antilichaamconjugatiereacties) op elke filterkolom. Draai de mastermix voorzichtig gedurende 2-3 s, of pipetteer op en neer om de oplossing met het antilichaam te mengen. Incubeer bij RT gedurende 30 min.
   4. Draai na incubatie de filterkolommen gedurende 8 minuten op 12.000 x g naar beneden. Voeg 450 μL conjugatieoplossing toe aan de filterkolommen en draai gedurende 8 minuten terug bij 12.000 x g .
   5. Resuspendeer de gewenste barcode in 10 μL nucleasevrij water en 210 μL conjugatieoplossing.
      OPMERKING: Bereid onmiddellijk voor gebruik een antilichaamlabel voor op de kleuring. Gebruik antilichaam barcode aliquots niet opnieuw.
   6. Na voltooiing van de spin-down in stap 3.2.4 voegt u de geresuspendeerde antilichaamtag (ongeveer 220 μl) toe aan elke overeenkomstige filterkolom. Pipetteer het mengsel voorzichtig op en neer om de reagentia te mengen. Sluit de deksels van de filterkolom en incubeer de conjugatiereactie bij RT gedurende 2 uur. Draai na 2 uur de filterkolommen gedurende 8 minuten op 12.000 x g naar beneden.
      OPMERKING: Voor het bevestigingsprotocol wordt aanbevolen 5 μL van de geconjugeerde oplossing in een polymerasekettingreactiebuis opzij te zetten en bij 4 °C te bewaren (zie hieronder).
   7. Pipetteer 450 μL van de zuiveringsoplossing in elke filterkolom en draai gedurende 8 minuten bij 12.000 x g naar beneden. Herhaal dit drie keer.
   8. Pipetteer 100 μL van de opslagoplossing in de filterkolommen. Pietteer het mengsel voorzichtig meer dan 10 keer op en neer en was voorzichtig de zijkanten van de filters in de kolom.
      OPMERKING: Los 50 μg antilichaam op in 100 μL van de bewaaroplossing. Als de conjugatiereactie wordt gestart met meer dan 50 μg antilichaam, voeg dan meer opslagoplossing toe in deze verhouding.
   9. Keer de filterkolommen om in een verse opvangbuis. Draai 2 minuten terug op 3.000 x g bij RT. Bewaar de verzamelde oplossing. Pipetteer de geconjugeerde antilichaamoplossing in steriele schroeftopbuizen en bewaar deze maximaal 1 jaar bij 4 °C.
      OPMERKING: Een geconjugeerd antilichaam moet na 2 dagen worden getest met de multiplexed imaging-technologie. Testen voorafgaand hieraan kunnen resulteren in nucleaire kleuring op de hoge achtergrond.

4. Bevestiging van vervoeging

OPMERKING: Alvorens kleuringsexperimenten uit te voeren met een door de gebruiker geconjugeerd antilichaam met behulp van de multiplexed imaging-technologie, moet de conjugatie worden bevestigd met behulp van gelelektroforese met 5 μL van het geconjugeerde antilichaam (zie stap 3.2.6) samen met 1 μg van een niet-geconjugeerd antilichaam (meestal in 2 μL van het mengsel) als controle. Een succesvolle antilichaamconjugatie zal worden aangetoond door een toename van het molecuulgewicht van het antilichaam. Dit bevestigingsprotocol beoordeelt echter alleen het succes van de chemische reactie voor conjugatie en gaat niet in op de antilichaamvalidatie die wordt gebruikt voor gemultiplexte beeldvorming.

1. Pipetteer respectievelijk 8 μl en 11 μl nucleasevrij water in het gereserveerde geconjugeerde antilichaam en controle op niet-geconjugeerd antilichaam om een eindvolume van 13 μl te verkrijgen.
2. Pipetteer 5 μL LDS (of een ander natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforesesysteem) monsterbuffer en 2 μL monsterreducerend middel in elk monster van het gereserveerde geconjugeerde antilichaam en denatureer de monsters in een droogbad van 95 °C gedurende 10 minuten.
3. Terwijl de monsters denatureren, verdunt u 40 ml MOPS SDS-loopbuffer in 760 ml ultrapuur water, plaatst u een gel in de tank van een elektroforesesysteem en giet u de verdunde lopende buffer over de gel.
4. Zodra de denaturisatieperiode van 10 minuten is voltooid, laadt u één put van de gel met een vooraf gekleurde eiwitstandaard, één met het niet-geconjugeerde antilichaam (uit stap 3.2.2) en de resterende putjes met de geconjugeerde antilichaammonsters. Laat de gel vervolgens op 150 V lopen totdat de eiwitstandaard aan het einde van de gel verschijnt.
   OPMERKING: De gel hecht gemakkelijk aan magnetronveilige containers en kan dus scheuren, dus de gel moet in de volgende stappen voorzichtig worden behandeld.
5. Nadat de run is voltooid, brengt u de gel over naar een magnetronveilige container die vooraf is gevuld met ultrapuur water en verwarmt u deze in een magnetron totdat de eerste bel in het water wordt gevisualiseerd.
   OPMERKING: De tijd dat bubbels zich vormen, varieert sterk, afhankelijk van de gebruikte magnetron.
6. Giet het water uit de container, giet ongeveer 250 ml Coomassie G-250-vlek over de gel en verwarm de gel in een magnetron totdat de eerste bel wordt gevisualiseerd. Verwijder daarna de container met de gel en de Coomassie G-250-vlek uit de magnetron en plaats deze gedurende 10 minuten op een shaker.
7. Na het schudden, laat de vlek voorzichtig leeglopen, vervang deze door ongeveer 200 ml ultrapuur water en plaats vervolgens de container op de shaker om de gel te wassen.
8. Giet het ultrazuivere water af en vervang het vijf keer door nieuw ultrapuur water of totdat de restanten van de vlek niet zichtbaar zijn in het waterbad. Laat de gel een nacht op de shaker wassen totdat er banden zichtbaar zijn, indien nodig, voordat u de gel fotografeert (figuur 1).
   OPMERKING: De antilichamen die worden gebruikt in multiplexbeeldvorming moeten kleuringspatronen hebben die vergelijkbaar zijn met die van kleurstof-geconjugeerde antilichamen. Weefselsecties met bekende antigenen die positief zijn voor geconjugeerde antilichamen kunnen worden gekleurd met oligonucleotide-geconjugeerde en kleurstof-geconjugeerde antilichamen. In dit werk waren in elk geval de weefselmorfologieën voor beide antilichaamtypen gelijkwaardig en met elkaar geharmoniseerd, evenals de verwachte celverdeling, gebaseerd op de biologie van de eiwitten van belang en de testweefselmonsters. Dit resultaat toont de effectiviteit aan van het gebruik van oligonucleotide-geconjugeerde antilichaammoieties voor op weefselkleuring gebaseerde benaderingen met behulp van FFPE-weefsel.

5. Oligonucleotide-geconjugeerde antilichaamkleuring

1. Bereid coverslips voor op het plaatsen van weefsel.
   1. Week de coverslips in een 0,1% poly-L-lysine-oplossing gedurende 24 uur bij RT om de weefselhechting te verbeteren.
   2. Giet na het weken de poly-L-lysine-oplossing af en was de afdekstroken gedurende 30 s met ultrapuur water. Herhaal het wassen vier tot zes keer. Verwijder de dekzeilen uit het ultrazuivere water dat wordt gebruikt voor het wassen en leg ze op een pluisvrije handdoek om 's nachts te drogen.
      OPMERKING: Een histoloog moet het geselecteerde weefsel in secties snijden die 5 μm dik zijn, ze op het midden van een poly-L-lysine-geladen coverslip plaatsen en ze een nacht laten drogen. Na het drogen moeten de afdekstroken met de weefselsecties niet langer dan 6 maanden bij 4 °C worden bewaard. Het kleurpaneel in dit protocol bevatte 26 markers. Het weefsel dat in dit protocol werd gebruikt, was normaal menselijk amandelweefsel. De afdekslip mag niet langer zijn dan 1 week. Poly-L-lysine-gecoate coverslips kunnen worden opgeslagen bij RT en moeten binnen 2 maanden na bereiding worden gebruikt.
2. Plaats de afdekplaathouder de dag voor het beitsen een nacht in een oven van 60 °C.
3. Plaats het afdekslipmonster de volgende dag in een voorverwarmde deksliphouder in een oven van 60 °C. Controleer na 30 minuten bakken of de paraffine uit het weefsel is gesmolten.
4. Plaats de deksliphouder/het monster snel in de volgende oplossingsreeks: twee rondes wasmiddel gedurende elk 6 minuten; twee rondes van 100% ethanol gedurende elk 5 minuten; één ronde van 90% ethanol gedurende 5 minuten; één ronde van 70% ethanol gedurende 5 minuten; één ronde van 50% ethanol gedurende 5 minuten; één ronde van 30% ethanol gedurende 5 minuten; en twee rondes met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld ultrapuur water gedurende elk 5 minuten.
   OPMERKING: Alle verdunningen van ethanol worden bereid met met DEPC behandeld ultrapuur water. Als xyleen wordt gebruikt voor het ontwassen, moet het in een kap worden gebruikt.
5. Ga als volgt te werk terwijl u de afdeksliphouder/het monster onderwerpt aan de oplossingsreeks:
   1. Bereid een vochtkamer voor door een lege pipetpuntdoos met een in water gedrenkte papieren handdoek aan de onderkant te plaatsen.
   2. Vul een snelkookpan met voldoende water om een bekerglas van 50 ml halverwege af te dekken.
   3. Breng 5 ml methanol per monster bij 4 °C in het bekerglas.
   4. Verdun de AR9-buffer met DEPC-behandeld ultrapuur water tot 1x; ongeveer 50 ml van de verdunde buffer is nodig per deksliphouder.
6. Nadat de oplossingsserie is voltooid, vult u een glazen bekerglas van 50 ml met ongeveer 40 ml 1x AR9-buffer, dompelt u de afdeksliphouder / monster onder in het bekerglas en bedekt u de beker / afdekplaathouder volledig met aluminiumfolie.
   1. Plaats het met aluminiumfolie bedekte bekerglas/coversliphouder in de met water gevulde snelkookpan en kook op hoge druk (ongeveer 15 psi) gedurende 20 minuten.
   2. Verwijder na het koken de beker-/coversliphouder, pak de aluminiumfolie voorzichtig uit en laat de beker-/coversliphouder ongeveer 10 minuten afkoelen bij RT.
   3. Verwijder de coversliphouder/het monster uit de 1x AR9-buffer en dompel deze onder in twee rondes met DEPC behandeld ultrapuur water, waarbij u de monsters in beide rondes gedurende 2 minuten elk incubeert.
   4. Haal tijdens de incubatie de hydratatiebuffer, de blokkerende N, blokkerende G, blokkerende J- en blokkerende S-oplossingen en het antilichaamverdunningsmiddel / blok uit de multiplexed imaging staining kit. Etiketteer voor twee coverslipmonsters 6-putplaten voor de oplossingen met behulp van de configuraties die in figuur 2 zijn weergegeven.
   5. Plaats het afdekslipmonster in twee rondes van 5 ml van de hydratatiebuffer gedurende elk 2 minuten.
   6. Na beide plaatsingsrondes in de hydratatiebuffer, plaatst u het dekslipmonster in 5 ml van het multiplexed imaging antilichaamverdunningsmiddel / blok en incubeert u gedurende 20-30 minuten bij RT (niet langer dan 30 minuten).
   7. Bereid tijdens de incubatie een antilichaamcocktail door een mastermix van 200 μL te maken van multiplexed imaging antilichaamverdunningsmiddel / blok, N-blokker, G-blokker, J-blokker en S-blokkeroplossingen.
      OPMERKING: Bereken de totale hoeveelheid antilichamen op basis van het aantal markers en de gevalideerde titratie van elke marker en trek de totale hoeveelheid antilichamen af van de mastermix. Bijvoorbeeld, voor zes markers, elk met een 1:200 titratie, zou de vergelijking 200 μL mastermix zijn − 6 μL antilichaamcocktail = 194 μL mastermix.
7. Plaats na incubatie in het verdunningsmiddel/blok van het antilichaamverdunning de dekslip in de in stap 5.5.1 bereide vochtigheidskamer, pipetteer 190 μL van de antilichaamcocktail op het dekslipmonster en incuber het dekslipmonster bij RT gedurende 3 uur.
   1. Was na incubatie het coverslipmonster in twee rondes met 5 ml van het multiplexed imaging antilichaamverdunningsmiddel / blok gedurende elk 2 minuten.
   2. Om de gebonden antilichamen tegen het weefsel op de deklaag te fixeren, voert u de stappen 5.7.3-5.7.5 uit in de vochtigheidskamer.
   3. Incubeer de coverslips gedurende 10 minuten met 16% formaldehyde verdund tot 1,6% met opslagoplossing en was de coverslips vervolgens drie keer met 1x PBS.
   4. Incubeer de coverslips gedurende 5 min met 4 °C methanol en was de coverslips vervolgens drie keer met 1x PBS.
   5. Incubeer de coverslips gedurende 20 minuten met 5 ml van het fixerende reagens verdund met 1x PBS en was de coverslips vervolgens drie keer met 1x PBS.
   6. Bewaar de bevlekte dekslipmonsters in de opslagbuffer bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken

6. Multiplexed imaging reporter plaat

OPMERKING: Een plaat met 96 putten, aangeduid als een reporterplaat, met fluoroforen met streepjescode in individuele putten, wordt bereid volgens op maat ontworpen multiplex-beeldvormingsexperimenten en correleert met elk gekleurd dekslipmonster. De volgende stappen zijn voor de voorbereiding van de reporterplaat.

1. Bereid een reporter master mix door 4.880 μL nucleasevrij water, 600 μL 10x multiplexed imaging buffer, 500 μL van een assay reagens en 20 μL nucleaire vlekoplossing te combineren. Dit is genoeg voor 20 cycli van alle putten.
2. Vul in elke cyclus van het op maat ontworpen multiplexed imaging-experiment een put met 245 μL van een oplossing die de reporter-mastermix en de specifieke fluoroforen met streepjescode voor die cyclus bevat.
   OPMERKING: Zie figuur 3 voor de reporterplaatconfiguratie die in dit protocol wordt gebruikt voor een carcinoompaneel.
3. Om de fluoroforen met streepjescode te beschermen, plakt u een folieplaatdeksel over de reporterplaat en plaatst u de plaat in het gemultiplexte beeldvormingsinstrument.
4. Bewaar de reporterplaat in een donkere doos bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.

7. Kalibreren en uitvoeren van de multiplexed imaging machine

OPMERKING: De hoge resolutie beeldfluorescentiemicroscoop vangt vier verschillende fluorescentiekanalen in elke gemultiplexte beeldvormingscyclus op 20x, 100% excitatielicht en met lage fotobleaching.

1. Kalibreer de focus van de beeldvorming met behulp van het DAPI-kanaal door een monsterafdekkingsslip op het microscoopstadium te plaatsen en handmatig 700 μL van een 1:1.500 titratie van nucleaire kleuroplossing op het weefsel te pipetteren.
   OPMERKING: De dekplaat wordt tijdens het wassen en beeldvorming van het monster op het microscoopstadium gehouden.
2. Om het multiplexed imaging instrument voor te bereiden, verdunt u 10x multiplexed imaging buffer tot 1x met behulp van DEPC-behandeld ultrapuur water en vult u reagensflessen met geschikte oplossingen/oplosmiddelen, inclusief de verdunde 1x multiplexed imaging buffer, DEPC-behandeld ultrapuur water en dimethylsulfoxide (DMSO).
3. Zodra de reagensflessen op de juiste manier zijn gevuld, voert u het experimentele ontwerp in de multiplexed imaging instrument manager-software in; wijs de juiste cyclus, putnummers, z-stackplaatsen, markeringsnaam, klasse en belichtingstijd voor elke cyclus aan (figuur 4); stel alle microscoopparameters in; en selecteer de interessegebieden op de voorbeeldafdekkingsstrook die u wilt afbeelden.
   1. Klik op de knop Experiment in de besturingssoftware (figuur 4A). Klik in het venster Experiment instellen en beheren op de knop Nieuwe sjabloon (Afbeelding 4B).
   2. Typ de projectnaam in de ruimte naast de knop Project (afbeelding 4C). Typ of selecteer het totale aantal cycli (Figuur 4D).
   3. Klik op de knop Kanaaltoewijzing , typ de informatie voor elke cyclus in de kolommen (Afbeelding 4E) en klik op de knop Sjabloon opslaan . Start het experiment door op de knop Experiment starten te klikken.
      OPMERKING: Tijdens een multiplexed beeldvormingsexperiment haalt het instrument de fluoroforen met streepjescode uit één put van de reporterplaat (maximaal vier fluoroforen per put, inclusief DAPI), doseert ze rechtstreeks op de monsterafdekkingsbrief en brengt de interessante gebieden voor elk fluorescentiekanaal in beeld. Na alle beeldvorming voor die cyclus wast het instrument de fluoroforen met streepjescode af en geeft het de volgende cyclus van verslaggevers af (van de volgende put op de reporterplaat). Beeldvorming gaat door totdat alle cycli met 26 markers zijn voltooid.

8. Beeldverzameling

OPMERKING: Multiplexbeelden kunnen worden verzameld met behulp van elke aangepaste omgekeerde fluorescentiemicroscoop geconfigureerd met vier fluorescentiekanalen (DAPI, Cy3, Cy5 en Cy7) en uitgerust met een Plan Fluor 20x-lens. Het afbeelden en wassen van de coverslipmonsters wordt iteratief automatisch uitgevoerd met behulp van een speciaal ontwikkelde fluidics-opstelling. De beelden worden verkregen met behulp van processorsoftware (v1.8.0.7) in QPTIFF-indeling.

1. Klik in het processorvenster op de knop Invoer en selecteer de naam van het experiment.
2. Selecteer en vink in de sectie Verwerkingsopties Achtergrondaftrekking, Deconvolutie, Uitgebreide scherptediepte en Arceringscorrectie aan. Klik op de knop Start .

9. Beeldanalyse

OPMERKING: De verkregen afbeeldingen kunnen worden geüpload naar een gepatenteerde geautomatiseerde beeldanalysesoftware of een open-source softwareprogramma (figuur 5) voor downstream-analyse.

1. Klik op het QuPath-pictogram op de computer en open de software. Sleep het QPTIFF-bestand naar het Viewer-venster .
2. Klik op de knop Helderheid & Contrast, waarmee het venster Helderheid & Contrast wordt geopend. Schakel de markering in de kolom Geselecteerd in of uit om het markeringssignaal weer te geven of te sluiten.
3. Klik op de knop Zoom to fit om in of uit te zoomen op het interessegebied.
   OPMERKING: Multiplexed beeldgegevensvisualisatie biedt de gebruiker een diepe blik in de micro-omgeving van het weefsel. Individuele markers in FFPE-monsters kunnen worden gevisualiseerd in fluorescentieformaat (figuur 6 en figuur 7) of in pathologieweergave. Verschillende computationele platforms kunnen worden gebruikt om de samengestelde beelden te verwerken en de gemultiplexte weefselbeeldgegevens te analyseren. Met behulp van deze software kan ruimtelijke fenotypering, evenals zeldzame celontdekking en celbuurtberekening, worden bereikt met hele diabeelden van ultrahoog gemultiplext weefsel dat wordt gegenereerd via de multiplexed imaging-technologie. Zie figuur 6 voor de 26 antilichamen in het carcinoompaneel en het amandelmonster (aanvullende figuur 1).

Results

We gebruikten FFPE-amandelmonsters om een 26-marker immuunoncologiepaneel te ontwikkelen om de immuunstatus van FFPE-weefsel te illustreren met behulp van een barcoding-beeldanalysesysteem. In totaal worden momenteel 19 antilichamen gebruikt in andere multiplexed imaging-studies in ons laboratorium. Alle markers zijn getest met FFPE-weefsel met chromogene IHC. Alle antilichamen werden geconjugeerd tot unieke DNA-oligonucleotiden. Bij het instellen van de coverslips met behulp van de webgebaseerde instrumentmanager (figuur 4) voor deze barcoding-beeldanalysetechnologie, moet worden opgemerkt dat de eerste en laatste cycli altijd "leeg" zijn (figuur 2 en figuur 4), waardoor de achtergrondfluorescentiesignalen moeten worden afgetrokken van de specifieke signalen van de antilichamen. Nadat beelden in QPTIFF-formaat zijn verzameld met de fluorescentiemicroscoop, kunnen ze worden gevisualiseerd met behulp van verschillende gepatenteerde geautomatiseerde beeldanalysesoftware of open-source softwareprogramma's. Samengestelde afbeeldingen kunnen alle markeringen of geselecteerde markeringen weergeven voor een beter zicht op de signalen (figuur 5). Bovendien kan elk antilichaam visueel worden geëvalueerd op nucleaire, cytoplasmatische of vliezige lokalisatie. Immuun-, tumor- en stromale cellen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Vervolgens kan beeldanalyse informatie geven over de signaalintensiteit, het dynamisch bereik en de ruimtelijke verdeling van alle markers (figuur 6). Met deze techniek konden we alle 26 markers op subcellulair niveau in een enkele weefselsectie analyseren (figuur 7). Door de co-lokalisatie van de markers te analyseren, konden we de cellulaire fenotypen identificeren, de ruimtelijke celpositie lokaliseren, de afstand tussen cellen berekenen en de verdeling van de cellen vinden. De cruciale impact van deze technologie is de presentatie van een robuust 26-markerpaneel gericht op de immuunstatus van de weefselmicro-omgeving.

Figuur 1: Afbeelding van op maat geconjugeerde antilichaamvalidatie met behulp van een Bis-Tris-eiwitgel. Baan 1 van de gel toont de eiwitstandaard. Baan 2 en Baan 4 tonen barcode-geconjugeerde antilichamen (pijlen). Baan 3 en Baan 5 tonen de zware en lichte kettingbanden van een ongeconjugeerd antilichaam (pijlpunten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Kleurplaat configuratiekaart voor twee coverslipmonsters. Afkortingen: HB = hydratatiebuffer; B = antilichaamverdunningsmiddel/blok; PSFS = fixatieve oplossing na kleuring; PBS = fosfaat gebufferde zoutoplossing; MeOH = methanol; S = opslagoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Configuratie van de reporterplaat. Elk geconjugeerd antilichaam heeft een streepjescode die complementair is aan een specifieke verslaggever. Om de meldersplaat in te stellen, moet elk geconjugeerd antilichaam en de bijbehorende melder worden vermeld. Vervolgens krijgt elk antilichaam een cyclusnummer toegewezen. De prestaties van twee blancocycli (C1 en C18) worden gebruikt om het niveau van autofluorescentie in de drie fluorescentiekanalen te evalueren en voor achtergrondaftrek na beeldvorming met behulp van de beeldacquisitiebesturingssoftware. Een softwarewizard controleert het instrument in dit stadium om er zeker van te zijn dat alle instellingen correct zijn (figuur 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 4: Beeldacquisitie met behulp van de besturingssoftware voor de experimentopstelling. (A) Selecteer het tabblad Experiment in de linkerbenedenhoek van de besturingssoftware om de installatie voor te bereiden en te starten. (B,C) Selecteer Nieuwe sjabloon om de experimentele instellingen in te voeren met een nieuwe project- en experimentnaam. (D) Wijzig de startcyclus goed en het aantal cycli om de locatie van de verslaggever in de 96-well reporterplaat weer te geven. (E) Wijs de juiste fluorescentiekanalen toe aan de vier kanalen die zijn aangewezen voor de experimentele run. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Beeldvisualisatie met behulp van webgebaseerde software (QuPath). Het kijkvenster toont 26 markers in het gekleurde amandelweefsel FFPE-sectie. In het venster Helderheid en contrast worden de markeringen met de vinkjes weergegeven. Ten slotte toont het viewervenster het FFPE-voorbeeld met de geselecteerde markeringen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Beeldvisualisatie met behulp van webgebaseerde software. (A) Amandelweefselsecties werden gekleurd voor de 26 markers en de afbeeldingen van de secties in QPTIFF-formaat werden gevisualiseerd met behulp van commerciële digitale diaviewersoftware of open-source software (QuPath) voor annotatie en beoordeling. (B-F) Zes markeringen werden weergegeven in dezelfde annotatie voor een beter zicht op de signalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Weergaven van de 26 individuele markers die worden gebruikt met webgebaseerde software. De markerexpressie in het amandelweefsel wordt getoond via immunofluorescentiekleuring met een immuunoncologiepaneel (linksboven). Individuele markeringen in twee kleine gebieden (rode rechthoeken) worden weergegeven. De ingezoomde insert toont cellen die positief zijn voor deze markeringen (witte pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Samenvatting van de workflow voor het verkrijgen van gemultiplexte afbeeldingen. FFPE-weefselsecties werden gekleurd met behulp van het 26-antilichaampaneel gevolgd door een multicyclusreactie. Onbewerkte beelden van de gekleurde secties werden computationeel verwerkt en een celdichtheid en ruimtelijke analyse werd uitgevoerd met behulp van de samengestelde afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: IHC-validatie in amandelweefsel. FFPE-weefselsecties werden gekleurd met behulp van een individueel antilichaam. De markerexpressie in het amandelweefsel wordt weergegeven bij een lage vergroting en de ingezoomde insert toont cellen die positief zijn voor de marker (rode rechthoeken). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De TME speelt een essentiële rol in de ontwikkeling, progressie en behandelingsreacties van kanker. Bovendien kan de dichtheid van specifieke tumor-infiltrerende lymfocytensubsets in de TME dienen als een prognostische biomarker voor bepaalde soorten kanker. Opmerkelijk is dat, naast de cellulaire samenstelling van de TME, de ruimtelijke kenmerken van een tumor een overzicht kunnen bieden voor het begrijpen van de biologie van de tumor en het identificeren van potentiële prognostische biomarkers^12,17.

Aangezien talrijke immuuncelpopulaties betrokken zijn bij prokanker- of antikankerresponsen, zal een beter begrip van deze cellen en hun ruimtelijke relaties met elkaar en met kankercellen helpen bij het identificeren van nieuwe immunotherapeutische strategieën. Eerdere studies hebben de locatie en ruimtelijke verdeling van TME-cellen gestratificeerd op basis van de weefselstructuur in de intratumorale en peritumorale gebieden en de invasieve marges van de tumorcellen^18,19. In de afgelopen 15 jaar hebben technologische ontwikkelingen de fenotypische analyse van individuele cellen op basis van hun ruimtelijke verspreiding tot een nieuw, invloedrijk hulpmiddel gemaakt voor het bestuderen van de TME en het categoriseren van potentiële biomarkers voor tumorimmunotherapie. Multiplex IF histochemie kan tegelijkertijd meerdere biologische markers schatten²⁰.

Vergelijkbaar met de oligonucleotide-geconjugeerde antilichaamstrategie, worden vier soorten op eiwitten gebaseerde multiplexplatforms gebruikt om de TME te bestuderen: chromogeen-, fluorescentie-, DNA-barcode- en metaalisotoop-gelabelde antilichaamdetectiesystemen. De kosteneffectieve chromogene IHC-platforms maken visualisatie van de hele dia en pathologische beoordeling mogelijk met behulp van conventionele helderveldmicroscopie. In gemultiplexte IF en IHC worden antilichamen geconjugeerd met fluoroforen gebruikt. Het multiplex IF/IHC-platform detecteert antilichamen met een hoge specificiteit en kan gerichte antilichamen kwantificeren, zelfs op subcellulair niveau ^6,21. Bovendien kan, vanwege de aard van chromogenen en fluoroforen, het gebruik van één antilichaampaneel de expressie van maximaal 10 biomarkers op een enkele dia vastleggen. Op metaalisotoopgebaseerde platforms worden antilichamen met metaallabels gebruikt om multiplexbeeldvorming uit te voeren met eencellige en ruimtelijke resolutie en een hoge gevoeligheid voor individuele weefselsecties²². Theoretisch maken deze metaal-geconjugeerde antilichaambenaderingen de gelijktijdige detectie van meer dan 100 biomarkers op een enkele weefselsectie mogelijk. Een uitdaging van de isotoop-etiketteringstechniek is isobare interferentie, die voorkomt dat 100% zuiverheid van verrijking wordt bereikt²³. Bovendien neemt de interferentie toe naarmate het aantal markers toeneemt. DNA-geconjugeerde antilichaamdetectieplatforms herkennen antilichamen die zijn gelabeld met unieke DNA-streepjescodes. Meer dan 40 biomarkers kunnen tegelijkertijd met hoge specificiteit op deze platforms worden vastgelegd⁶.

Multiplexed imaging is een in de handel verkrijgbaar DNA-barcode-gelabeld antilichaamdetectieplatform voor het aanbrengen van DNA-geconjugeerde antilichamen op een enkele weefselglaasje in één stap (figuur 8). Voor de weefselvoorbereidingsfase vereist het multiplexed ion beam imaging platform, dat het gebruik van met goud gecoate dia's van fabrikanten vereist, alleen reguliere coverslips of dia's bedekt met 0,1% poly-L-lysine om het weefsel te helpen zich eraan te hechten en weefsel intact te houden tijdens het kleurings- en beeldvormingsproces. Het gebruik van weefselsecties op coverslips binnen 4 weken na sectie wordt aanbevolen, omdat de langdurige opslag van niet-gekleurde dia's resulteert in vermindering van de antigeniciteit. Een gekleurd dekslipmonster kan tot 2 weken in de opslagbuffer bij 4 °C worden gehouden zonder het kleuringssignaal te verliezen. Er is geen speciale apparatuur nodig voor de opslag van de dekslipmonsters. Het multiplexed imaging-systeem is geüpgraded om gewone dia's te gebruiken in plaats van coverslips, wat het kleuren van grotere weefsels en eenvoudige bediening mogelijk maakt. Bij gebruik van een reductieoplossing voor antilichaamconjugatie (stap 3.2.3) moet de reactie worden beperkt tot maximaal 30 minuten om schade aan antilichamen te voorkomen. De blokkeringsbuffers in stap 5.6.6 moeten vers worden voorbereid en de blokkeringsbuffers mogen niet opnieuw worden gebruikt.

Vergeleken met chromogeen-, fluorescentie- en metaalisotoop-gelabelde multiplex antilichaamdetectieplatforms, heeft de multiplexed imaging-technologie bepaalde voordelen. Er zijn bijvoorbeeld meer dan 60 vooraf ontworpen antilichaampanelen voor multiplexbeeldvorming in de handel verkrijgbaar, wat helpt tijd en kosten te besparen bij de conjugatie en validatie van antilichamen, en het aantal vooraf ontworpen antilichaampanelen groeit. Deze antilichamen, waaronder de carcinoommarker pan-cytokeratine, de melanoommarker SOX10, de vasculaire marker CD31, de stromale marker SMA en talrijke immuuncelmarkers, zijn gevalideerd en klaar voor experimenten. Voor antilichamen die niet vooraf zijn ontworpen, is de in de handel verkrijgbare conjugatiekit die is ontworpen voor gebruik met multiplexbeeldvorming eenvoudig en gebruiksvriendelijk. Door de klant geconjugeerde antilichamen zijn goed voor 1 jaar wanneer ze worden bewaard bij 4 °C. Bovendien is het opwarmen van de machine niet vereist voor het vastleggen van de beelden. In deze multiplexed imaging-technologie resulteren de iteratieve was-, hybridisatie- en strippingstappen in de beeldacquisitie zelden in een verminderde markerintensiteit of afgebroken weefselmorfologie 5,24,25. Bovendien worden samengestelde beelden vastgelegd in QPTIFF-formaat met een eenvoudige driekleurige fluorescentiemicroscoop en kunnen ze worden geüpload en geanalyseerd met behulp van digitale analysesoftware van derden. De kleuringsmarkers kunnen worden gevisualiseerd met een eencellige resolutie en celfenotypen kunnen worden gekarakteriseerd via de co-lokalisatie van de markers (figuur 6 en figuur 7). De uitgebreide analyse van een gemultiplext beeld onthult verder de weefselcompartimenten, eencellige markerkwantificering en gegevens over de dichtstbijzijnde buren en nabijheid (figuur 8).

Een uitdaging bij multiplexed beeldanalyse is celtype-identificatie. Meestal, wanneer meer classificaties voor één object op een afbeelding worden toegepast, worden meer ongewone fenotypen geannoteerd. Daarom wordt aanbevolen bekende markers te gebruiken die niet in dezelfde classificator tot expressie zijn gebracht en alleen de fenotype-gerelateerde classificator toe te passen op de annotatie van afzonderlijke cellen. Variaties in celtype-annotatie zullen resulteren in substantieel verschillende ruimtelijke resultaten, zoals verschillen in celruimteverdeling en cellulaire buurtanalyse^26,27.

Multiplexed beeldanalyse heeft bewezen succesvol te zijn in het kleuren en afbeelden van vele soorten monsters, waaronder FFPE-weefsel, vers bevroren weefsel, gearchiveerde hele dia's en weefselmicroarrays. Gemultiplexte beelden van borst-, hersen-, long-, milt-, nier-, lymfeklier- en huidweefselsecties kunnen worden verkregen met diepe eencellige ruimtelijke fenotyperingsgegevens 5,16,25,28.

In de toekomst worden meer vooraf ontworpen antilichamen voor gemultiplexte beeldvorming verwacht. Daarnaast is de ontwikkeling van specifieke software voor multiplexed beeldanalyse hard nodig. Momenteel bestaan er veel commercieel beschikbare en open-source softwareprogramma's voor Hi-Plex-beeldanalyse²⁹, maar wetenschappers hebben nog steeds hulp nodig bij het maken van een standaardworkflow voor deze analyses^30,31. Hoewel de samengestelde afbeeldingen die met dit protocol zijn vastgelegd, compatibel zijn met software van derden, kan dit extra kosten voor de gebruiker met zich meebrengen. Een ander nadeel van de multiplexed imaging-technologie is de signaalreductie in nucleaire eiwitdetectie na iteratief wassen, hybridisatie en strippen met grote panelen antilichamen. Gelukkig kan dit worden geminimaliseerd door de fluoroforen met streepjescode in vroege cycli op te halen bij het ontwerpen van de reporterplaten. Onlangs is dit platform geüpgraded met een nieuw snel scansysteem, waardoor de tijd om samengestelde afbeeldingen te verkrijgen drastisch is verkort³². Bovendien is een nieuwe strategie met behulp van tyramide-geconjugeerde barcodes gemeld om de oligonucleotide-geconjugeerde antilichaam barcoding-gebaseerde beeldvorming te verbeteren. Deze technologie is gericht op het versterken van kleuringssignalen waarvoor barcode-geconjugeerde antilichamen moeilijk te verkrijgen zijn³³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x AR9 Buffer	Akoya Biosciences	AR900250ML
10x Buffer	Akoya Biosciences	7000001
16% paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28906
1X Antibody Diluent/Block	Akoya Biosciences	ARD1001EA
Antibody Conjugation Kit	Akoya Biosciences	7000009	Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution
Assay Reagent	Akoya Biosciences	7000002
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	40718-25ML
Dimethyl sulfoxide	Avantor/VWR	BDH1115-4LP
Ethanol, 200 proof
G Blocker V2	Akoya Biosciences	240199
Histoclear	Thermo Fisher Scientific	50-329-50
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Milli-Q Integral 10	Millipore	ZRXQ010WW
Niknon Fluorescence microscope	Keyence Corp. of America	BZ-X810
Nuclear Stain	Akoya Biosciences	7000003
Nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	AM9938
NuPAGE	Thermo Fisher Scientific	NP0008
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190136
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination	Akoya Biosciences	5450004 (BX025/RX025)
		5450003 (BX022/RX022)
		5450023 (BX002/RX002)
		5250002 (BX020/RX020)
		2520003 (BX023/RX023)
		5250005 (BX029/RX029)
		5250007 (BX035/RX035)
		5250012 (BX052/RX052)
		5550012 (BX030/RX030)
		5550015 (BX042/RX042)
		5550014 (BX036/RX036)
QuPath	Open-Source	https://qupath.github.io/
SimplyBlue SafeStain	Thermo Fisher Scientific	LC6065
Staining Kit	(Akoya Biosciences	7000008	Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer