Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64760

⸱

14 april 2023

 ,  , 
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een tijdspecifieke methode om kritische ontwikkelingspaden in de placenta van de muis in vivo effectief te manipuleren. Dit wordt uitgevoerd door de injectie en elektroporatie van CRISPR-plasmiden in de placenta's van zwangere moederdieren op embryonale dag 12.5.

Samenvatting

De placenta is een essentieel orgaan dat de ontwikkeling van zoogdieren in de baarmoeder reguleert en in stand houdt. De placenta is verantwoordelijk voor de overdracht van voedingsstoffen en afvalstoffen tussen moeder en foetus en de productie en afgifte van groeifactoren en hormonen. Placenta-genetische manipulaties bij muizen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de specifieke rol van de placenta in de prenatale ontwikkeling. Placenta-specifieke Cre-expressing transgene muizen hebben verschillende effectiviteit, en andere methoden voor placentale genmanipulatie kunnen nuttige alternatieven zijn. Dit artikel beschrijft een techniek om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-genmanipulatie, die kan worden gebruikt om de expressie van gerichte genen te wijzigen. Met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak ondergaan zwangere moederdieren een laparotomie op embryonale dag 12.5 (E12.5) en wordt een CRISPR-plasmide afgeleverd door een glazen micropipette in de individuele placenta's. Het plasmide wordt na elke injectie onmiddellijk geëlektropoeerd. Na damherstel kunnen de placenta's en embryo's zich verder ontwikkelen tot beoordeling op een later tijdstip. De evaluatie van de placenta en nakomelingen na het gebruik van deze techniek kan de rol van tijdspecifieke placentafunctie in de ontwikkeling bepalen. Dit type manipulatie zal een beter begrip mogelijk maken van hoe placentale genetica en functie de foetale groei en ontwikkeling in meerdere ziektecontexten beïnvloeden.

Inleiding

De placenta is een essentieel orgaan dat betrokken is bij de ontwikkeling van de foetus. De belangrijkste rol van de placenta is om essentiële factoren te bieden en de overdracht van voedingsstoffen en afval van en naar de foetus te reguleren. Zoogdier placenta's zijn samengesteld uit zowel foetaal als maternaal weefsel, die de foetale-maternale interface vormen, en dus de genetica van zowel de moeder als de foetus beïnvloeden functie1. Genetische afwijkingen of verminderde functie van de placenta kunnen de foetale ontwikkeling drastisch veranderen. Eerder werk heeft aangetoond dat placentale genetica en ontwikkeling geassocieerd zijn met de veranderde ontwikkeling van specifieke orgaansystemen bij de foetus. Met name afwijkingen in de placenta zijn gekoppeld aan veranderingen in de foetale hersenen, het hart en het vasculaire systeem 2,3,4,5.

Het transport van hormonen, groeifactoren en andere moleculen van de placenta naar de foetus speelt een belangrijke rol in de foetale ontwikkeling6. Het is aangetoond dat het veranderen van de placentaproductie van specifieke moleculen de neurologische ontwikkeling kan veranderen. Maternale ontsteking kan de productie van serotonine verhogen door de metabole genexpressie van tryptofaan (TRP) in de placenta te veranderen, wat vervolgens een accumulatie van serotonine in de foetale hersenen creëert7. Andere studies hebben placenta-afwijkingen gevonden naast hartafwijkingen. Afwijkingen in de placenta worden verondersteld bij te dragen aan aangeboren hartafwijkingen, de meest voorkomende geboorteafwijking bij mensen8. Een recente studie heeft verschillende genen geïdentificeerd die vergelijkbare cellulaire routes hebben in zowel de placenta als het hart. Indien verstoord, kunnen deze paden defecten in beide organen veroorzaken9. De defecten in de placenta kunnen aangeboren hartafwijkingen verergeren. De rol van placentale genetica en functie op de ontwikkeling van specifieke foetale orgaansystemen is een opkomend vakgebied.

Muizen hebben hemochoriale placenta's en andere kenmerken van menselijke placenta's, waardoor ze zeer nuttige modellen zijn voor het bestuderen van menselijke ziekten1. Ondanks het belang van de placenta is er momenteel een gebrek aan gerichte in vivo genetische manipulaties. Bovendien zijn er momenteel meer opties beschikbaar voor knock-outs of knockdowns dan overexpressie of gain-of-function-manipulaties in de placenta10. Er zijn verschillende transgene Cre-expressing lijnen voor placenta-specifieke manipulatie, elk in verschillende trofoblastlijnen op verschillende tijdstippen. Deze omvatten Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER en Gcm1-Cre 11,12,13,14. Hoewel deze Cre-transgenen efficiënt zijn, zijn ze mogelijk niet in staat om sommige genen op specifieke tijdstippen te manipuleren. Een andere veelgebruikte methode om placentale genexpressie uit te schakelen of te overexpresseren is het inbrengen van lentivirale vectoren in de blastocystcultuur, die een trofoblastspecifieke genetische manipulatie veroorzaakt15,16. Deze techniek zorgt voor een robuuste verandering in de placenta-genexpressie vroeg in de ontwikkeling. Het gebruik van RNA-interferentie in vivo is schaars gebruikt in de placenta. Het inbrengen van shRNA-plasmiden kan op dezelfde manier worden uitgevoerd als de CRIPSR-techniek die in dit artikel wordt beschreven. Dit is gedaan bij E13.5 om met succes de PlGF-expressie in de placenta te verminderen, met gevolgen voor de hersenvasculatuurvan nakomelingen 17.

Naast technieken die voornamelijk worden gebruikt voor knock-out of knockdown, wordt het induceren van overexpressie vaak uitgevoerd met adenovirussen of het inbrengen van een exogene eiwit. De technieken die worden gebruikt voor overexpressie hebben verschillende succespercentages en zijn meestal later in de zwangerschap uitgevoerd. Om de rol van insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) in de placentafunctie te onderzoeken, werd een adenoviraal-gemedieerde placentale genoverdracht uitgevoerd om de overexpressie van het IGF-1-gen 18,19 te induceren. Dit werd laat in de dracht van de muis uitgevoerd op E18,5 via directe placenta-injectie. Om extra opties te bieden en mogelijke mislukkingen van gevestigde placentale genetische manipulaties te omzeilen, zoals Cre-Lox-combinatiefouten, de mogelijke toxiciteit van adenovirussen en de off-target effecten van shRNA, kan in vivo directe CRISPR-manipulatie van de placenta worden gebruikt20,21,22. Dit model is ontwikkeld om het gebrek aan overexpressiemodellen aan te pakken en een model met flexibiliteit te creëren.

Deze techniek is gebaseerd op het werk van Lecuyer et al., waarin shRNA- en CRISPR-plasmiden in vivo direct op muis-placenta's werden gericht om de PlGF-expressie te veranderen17. Deze techniek kan worden gebruikt om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-manipulatie op meerdere tijdstippen; voor dit werk is gekozen voor E12.5. De placenta is op dit punt gerijpt en is groot genoeg om te manipuleren, waardoor een specifiek CRISPR-plasmide op E12.5 kan worden ingebracht, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op de foetale ontwikkeling van midden tot laat in de zwangerschap23,24. In tegenstelling tot transgene benaderingen, maar vergelijkbaar met virale inducties of RNA-interferentie, maakt deze techniek overexpressie of knock-out op bepaalde tijdstippen mogelijk met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak, waardoor mogelijke verminderde placentatie of embryonale letaliteit van eerdere veranderingen wordt vermeden. Omdat slechts enkele placenta's het experimentele of controleplasmide in een nest ontvangen, maakt de aanpak twee soorten interne controles mogelijk. Deze controles zijn die geïnjecteerd en geëlektropoeerd met het juiste controleplasmide en die geen directe manipulatie ontvangen. Deze techniek werd geoptimaliseerd om een overexpressie van het IGF-1-gen in de placenta van de muis te creëren via een synergetische activeringsmediator (SAM) CRISPR-plasmide. Het IGF-1-gen werd gekozen, omdat IGF-1 een essentieel groeihormoon is dat aan de foetus wordt afgegeven en dat voornamelijk vóór de geboorte in de placenta wordt geproduceerd25,26. Deze nieuwe placenta-gerichte CRISPR-techniek maakt directe manipulatie mogelijk om het verband tussen de placentafunctie en de foetale ontwikkeling te helpen definiëren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met en in overeenstemming met de federale regelgeving en het beleid van de Universiteit van Iowa en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Dieren en veehouderij

  1. Houd de dieren in een daglichtcyclus van 12 uur met voedsel en water ad libitum.
  2. Gebruik CD-1 vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-15 weken. Gebruik de aanwezigheid van een copulatorische plug om E0.5 te identificeren.
  3. Op E0.5, afzonderlijk huisvesten de zwangere moederdieren.

2. Kalibratie van de micropipette

OPMERKING: De kalibratie van de micropipette moet indien mogelijk vóór de operatie worden uitgevoerd.

  1. Voordat u de micropipet maakt en kalibreert, verdunt u alle plasmiden tot de aanbevolen concentratie (0,1 μg/μL) in DNasevrij water. Meng het plasmide met de juiste verdunde Fast Green-kleurstof (1 μg/μL in PBS) (uiteindelijke plasmideconcentratie: 0,06 μg/μL).
  2. Trek micropipettes met behulp van glazen haarvaten van 10 cm met een buitendiameter van 1,5 mm en een binnendiameter van 0,86 mm met een micropipettrekker.
  3. Breek de punt van een micropipette (2-3 mm) voorzichtig af met een steriele tang.
  4. Laad de micropipette in een microcapillaire punt die aan een micro-injector is bevestigd. Zorg ervoor dat de micro-injector is bevestigd aan de micro-injectiemachine en dat er voldoende stikstofniveaus zijn om de micropipet te kalibreren.
  5. Zodra de micropipette aan de micro-injector is bevestigd, laadt u deze met de Fast Green-kleurstofoplossing om de kalibratie uit te voeren (1 μg / μL in PBS). Kalibreer de micropipette om een volume van ongeveer 3,5 μl te injecteren. Leeg ("helder") de micropipette ter voorbereiding op het laden van de plasmide-oplossingen zoals hieronder.
    OPMERKING: Elke micropipette zal iets anders zijn. Om beschadiging van de placenta tijdens de injectie te voorkomen, moet de injectietijd worden ingesteld tussen 0,5-1,5 s. De druk moet worden ingesteld tussen 1-8,5 psi. Kalibreer elke micropipette afzonderlijk; Als de micropipette niet binnen deze parameters kan worden gekalibreerd, mag deze niet worden gebruikt.

3. Chirurgie (figuur 1A)

OPMERKING: Om zich voor te bereiden, reinigt u de oppervlakken van zowel het preparaat als de chirurgische gebieden met 70% ethanol. Plaats een absorberende onderlaag in de bereidingsruimte. Plaats in het operatiegebied een verwarmingskussen naar beneden en plaats hier vervolgens een absorberende onderlegger op. Steriliseer alle hulpmiddelen voorafgaand aan de operatie. De tijd dat de moeder onder narcose is, moet minder dan 1 uur zijn.

  1. Verdoving
    1. Dien 5 mg/kg NSAID (meloxicam) of een ander goedgekeurd analgeticum toe aan de zwangere moeder 30 minuten tot 1 uur vóór de operatie.
    2. Plaats de zwangere dam in een inductiekamer die is bevestigd aan een isofluraan vaporizer.
    3. Stel de vaporizer in op 4% isofluraan en 3,5 L/min zuurstof.
    4. Zodra de verdoving is bevestigd door het gebrek aan reactie op een teenknijp en een verminderde ademhalingssnelheid, verwijdert u de dam van de inductiekamer naar het voorbereidingsgebied.
  2. Voorbereiding van de operatie
    1. Plaats in het voorbereidingsgebied de damrug met een neuskegel.
    2. Verlaag de vaporizer tot 2% isofluraan en 3,5 L/min zuurstof terwijl de dam in de neuskegel zit.
    3. Scheer de buik van de moeder grondig en verwijder overtollige vacht. Breng de geschoren buik afwisselend driemaal met povidonoplossing en 70% ethanol met steriele applicatoren met katoenpunt. Breng de laatste laag povidon-oplossing aan. Om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen, plaatst u kunstmatige traangel over beide ogen van de dam (figuur 2A, B).
    4. Verplaats na de voorbereiding de dam met de neuskegel naar het aangewezen operatiegebied.
  3. Baarmoederlaparotomie
    OPMERKING: Gebruik steriele handschoenen tijdens de chirurgische ingreep. Vervang de handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak.
    1. Plaats in het operatiegebied de damrug en zet de neuskegel op zijn plaats met tape. Zet het verwarmingskussen onder het absorberende kussen op 45 °C.
    2. Maak met behulp van een tang en een schaar een incisie van ongeveer 2 cm middellijn door de huid. Gebruik een tang om de huid te tenten en maak een verticale incisie in de huid. Maak hierna nog een incisie van vergelijkbare grootte door het peritoneum om de baarmoederhoorns bloot te leggen. Gebruik een tang om het buikvlies te tenten terwijl u de verticale incisie maakt (figuur 2C, D).
      OPMERKING: Het niet goed tenten tijdens het insnijden van het buikvlies kan leiden tot een fatale incisie van de darmen.
    3. Masseer de baarmoederhoorns zachtjes door de incisie door op de zijkanten van de buik te drukken. Doe dit door de baarmoeder zorgvuldig te begeleiden zonder gereedschap, met alleen vingers om onbedoeld letsel te voorkomen. Plaats de blootgestelde baarmoeder bovenop een steriel chirurgisch gordijn dat de buik van de moeder bedekt en houd het vochtig tijdens de operatie met druppels steriele zoutoplossing, die vóór gebruik naar behoefte kunnen worden verwarmd tot 30 °C (figuur 2E, F).
      OPMERKING: De baarmoederhoorns kunnen worden geïdentificeerd zoals beschreven in Wang et al.27.
    4. Zodra de baarmoeder is blootgesteld, selecteert u drie paar placenta's voor manipulatie.
      OPMERKING: De placenta's kunnen worden geïdentificeerd zoals beschreven door Elmore et al.24. Om de overleving van de embryo's te maximaliseren, mogen niet meer dan 6 placenta's worden behandeld. Als er minder dan 12 embryo's aanwezig zijn, mogen niet meer dan 4 placenta's worden geïnjecteerd. Selecteer twee aangrenzende placenta's zodat de ene een controle-injectie krijgt en de andere het experimentele plasmide. Het gebruik van twee aangrenzende placenta's zorgt voor een betere vergelijking van placenta's op vergelijkbare locaties in de baarmoeder en maakt ook een verhoogde overlevingskans mogelijk. De geselecteerde placentaparen worden willekeurig gekozen en verdeeld over beide baarmoederhoorns (figuur 1B).
    5. Noteer de locatie van placentamanipulaties en organisatie van de embryo's in de baarmoederhoorns, zodat de embryo's en placenta's tijdens het verzamelen kunnen worden geïdentificeerd, omdat één moeder zowel controle- als experimenteel behandelde placenta's / embryo's zal dragen.
  4. Placenta-injectie en elektroporatie van het controleplasmide
    OPMERKING: Om een aseptische techniek te behouden, steriliseert u de elektroporatiepeddels en micro-injector vóór gebruik met een koud sterilismiddel. Vervang handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak.
    1. Laad met behulp van de gekalibreerde micropipet een voldoende hoeveelheid van het juiste controleplasmide voor drie injecties. Voer alle injecties uit op een diepte van ~ 0,5 mm zijdelings in de placenta tussen de decidua (wit) en de junctionele zone (donkerrood) (figuur 3A-F).
    2. Voer injecties uit in de drie controleplacenta's.
      OPMERKING: Voer alle controleplasmide-injecties uit voorafgaand aan de experimentele injecties om kruisbesmetting van de plasmiden met de micropipet te voorkomen. Hierdoor kan dezelfde micropipette worden gebruikt, omdat het veranderen van micropipetten en kalibratietijd de operatietijd drastisch verhoogt en de overleving van de moeder vermindert.
    3. Voer elektroporatie uit van de controleplasmide-geïnjecteerde placenta's binnen 2 minuten na de injectie.
    4. Gebruik voor elektroporatie een paar peddels van 3 mm die aan een elektroporatiemachine zijn bevestigd. Om de efficiëntie van CRISPR-opname en de levensvatbaarheid van embryo's te garanderen, gebruikt u de volgende elektroporatie-instellingen: 2 pulsen, 30 V, 30 ms puls, 970 ms puls uit, unipolair.
    5. Na injectie, maar onmiddellijk voorafgaand aan elektroporatie, bedek de plaatsen van contact met steriele zoutoplossing en breng de zoutoplossing precies aan op de drie plaatsen op de baarmoederwand en de peddels met een druppelaar of spuit.
    6. Druk zachtjes op de elektroporatiepeddels aan de zijkanten van de placenta. Plaats de anodepeddel over de injectieplaats en de kathode recht tegenover elkaar (figuur 4A-C).
    7. Druk op de puls op de elektroporatiemachine en wacht tot de twee pulsen zijn voltooid voordat u de elektroporatiepeddels verwijdert.
      OPMERKING: Een kleine hoeveelheid wit schuim wordt vaak gezien tussen de peddels en placenta tijdens pulsen. Als dit niet gebeurt, controleer dan de spanning van de peddels met een voltmeter voor verder gebruik. Als de aflezing op de voltmeter niet overeenkomt met de elektroporatiespanningsinstelling, zijn de peddels niet functioneel.
  5. Placenta-injectie en elektroporatie van het experimentele plasmide
    1. Volg dezelfde instructies uit stap 3.4.1. naar stap 3.4.2. met behulp van het experimentele plasmide in plaats van het controleplasmide.
    2. Voer elektroporatie uit van alle drie de experimentele geïnjecteerde placenta's binnen 2 minuten na de injectie. Dit moet op dezelfde manier worden uitgevoerd als voor degenen die met de controleplasmiden worden geïnjecteerd. Volg stap 3.4.4. naar stap 3.4.7.
  6. Voltooiing van de operatie
    1. Zodra de placentamanipulatie is voltooid, masseert u de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte met alleen vingers (figuur 5A).
    2. Voer eerst dubbelgeknoopte enkele hechtingen uit op de peritoneumlaag met behulp van gecoate en gevlochten oplosbare hechtingen die 45 cm lang zijn met een 13 mm 3/8c naaldlegering. Plaats de hechtingen 2-3 mm uit elkaar (figuur 5B).
    3. Na het hechten van de peritoneumlaag, hecht u de huid met oplosbare hechtingen. Drievoudige knoop de enkele hecht 2-3 mm uit elkaar om ervoor te zorgen dat de dam de hechting niet ongedaan kan maken (figuur 5C).
    4. Zodra het hechten is voltooid, stelt u de isofluraan in op 1% en de zuurstof op 3,5 l/min en brengt u weefsellijm aan op de hechtingen op de huid (figuur 5D).
      OPMERKING: Weefsellijm is optioneel, maar wordt aanbevolen om te voorkomen dat de incisie opnieuw wordt geopend als gevolg van damkauwen.
    5. Wanneer de weefsellijm is opgedroogd, schakelt u de verdamper uit en verwijdert u de dam uit het operatiegebied. Plaats de dam in een ondersteunende kooi op zijn rug.

4. Postoperatieve zorg en monitoring

  1. Laat de zwangere moeder herstellen in een schone kooi onder toezicht gedurende minimaal 30 minuten om ervoor te zorgen dat er geen onmiddellijke complicaties van de operatie optreden. Observeer totdat het volledig ambulant is en zonder hulp op zijn voeten kan draaien. Afzonderlijk huisvesten van de dam na de operatie.
  2. Volg de institutionele postoperatieve zorg en monitoring tot het verzamelen van embryo's. Noteer het damgewicht en controleer dagelijks de hechtingen en de incisieplaats.

5. E14.5 placentale verzameling

  1. Op E14.5, verdoof de dam diep met een ketamine / xylazine cocktail (1 mg / ml ketamine en 0, 1 mg / ml xylazine), en vervolgens cervisch ontwrichten van de dam.
  2. Maak een V-vormige incisie in de buik van de dam met een schaar en verwijder de baarmoeder. Plaats direct op een petrischaal van 5 cm op ijs. Verwijder met een tang voorzichtig het embryo en de bijbehorende placenta uit de baarmoeder.
    OPMERKING: Houd een register bij van de embryolocatie en de bijbehorende placenta in de baarmoederhoorns om te bepalen welke de directe manipulatie tijdens de operatie heeft ontvangen.
  3. Noteer de placentagewichten. Gebruik een RNAse-vrije tang en scheermesjes om de placenta in tweeën te snijden langs de middellijn. Doe de helft in 4% PFA bij 4 °C. Snijd de resterende helft opnieuw doormidden en bewaar de resterende twee kwarten bij −80 °C in twee buisjes, waarvan één met RNA-opslagreagens.
    OPMERKING: Embryo's en andere maternale weefsels kunnen uit de collectie worden bewaard bij −80 °C voor toekomstig gebruik.

6. Placenta-genexpressieanalyse

  1. Gebruik het kwart van de placenta dat is opgeslagen bij −80 °C in RNA-opslagreagens.
  2. Verwerk de placenta's voor qPCR zoals beschreven in Elser et al. met behulp van de Trizol-methode voor RNA-isolatie, een spectrofotometer voor RNA-concentratie, een cDNA-synthesekit en qPCR met SYBR Green Master Mix28. In plaats van de Turbo DNAfree-kit DNAse waarnaar wordt verwezen in Elser et al., gebruikt u een RNAcleanup-kit na de Trizol RNA-isolatie om ervoor te zorgen dat de monsters geen verontreinigingen bevatten28.
    OPMERKING: Lees het veiligheidsinformatieblad (MSDS) voor Trizol en gebruik het in een chemische zuurkast.
  3. Beoordeel de plasmide-insertie van het controleplasmide met GFP-primers en van het experimentele plasmide met BLAST-primers (primers vermeld in aanvullende tabel 1). Gebruik de CT-waarde om de aanwezigheid van het plasmide te bepalen.
    OPMERKING: CT-waarden boven 35 zijn vals-positieven en alleen die onder 35 moeten worden beschouwd als een positieve indicator dat het plasmide met succes is ingebracht.
  4. Beoordeel IGF-1 placenta-expressie genormaliseerd naar het huishoudgen 18s (primers vermeld in aanvullende tabel 1). Gebruik de ddCT-methode om de vouwverandering te berekenen en bereken vervolgens de genormaliseerde vouwverandering van de experimentele monsters naar de gemiddelde vouwverandering van de controlemonsters.

7. Analyse van het placenta-eiwitgehalte

  1. Gebruik het kwart van de placenta dat is bewaard bij −80 °C. Homogeniseer het weefsel in een bufferoplossing gemaakt van 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 en 10 mM proteaseremmer in diH2 O met een uiteindelijke pH van 7,4. Gebruik een draagbare homogenisator en stamper om het weefsel te breken.
    OPMERKING: Het monster mag niet groter zijn dan 10% van het volume van de buffer.
  2. Verdun de gehomogeniseerde monsters in de buffer op 1:12, zodat ze binnen het detecteerbare bereik van een bicinchoninic acid assay (BCA) kit liggen. Voer de BCA-test uit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer het totale eiwit met behulp van een plaatlezer.
  3. Na het uitvoeren van de BCA-test, normaliseer alle monsters tot dezelfde totale eiwitconcentratie van 2 mg / ml voor de IGF-1 ELISA, zoals gedaan in Gumusoglu et al.29.
  4. Voer de IGF-1 ELISA uit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer de IGF-1-eiwitniveaus met een plaatlezer met behulp van een standaardconcentratiecurve.

8. Ruimtelijke CRIPSR-verificatie met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie-etikettering

  1. Nadat de placentahelften gedurende 1-3 dagen op de juiste manier zijn gefixeerd in 4% PFA bij 4 °C, verplaatst u ze in 20% sucrose bij 4 °C voordat u ze invriest in een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding.
  2. Snijd de oct-ingebedde placentahelften in een cryostaat van −20 °C serieel in secties van 10 μm en plaats ze op dia's die moeten worden geëtiketteerd. Snijd de placentahelften zodat alle drie de subregio's zichtbaar zijn. Bewaar de dia's bij −80 °C tot gebruik voor in situ hybridisatie.
  3. Voer fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) etikettering uit volgens de protocollen van de fabrikant. Hybridiseer één dia met een dCas9-3xNLS-VP64 sonde en een tweede "zuster" dia van dezelfde placenta met een Prl8a8 sonde.
    OPMERKING: De dCas9-3xNLS-VP64 sonde detecteert de aanwezigheid van het overexpressieplasmide. De Prl8a8-sonde markeert spongiotrofoblasten van de junctionele zone, waardoor de subregio's van de placenta kunnen worden geïdentificeerd. Deze twee sondes zijn gelabeld op afzonderlijke "zuster" -dia's om interferentie van meerkanaalsfluorescentie met de groene autofluorescentie in de placenta's te voorkomen.
  4. Label beide sondes met de detectiekleurstof (Opal 620). Nadat u het protocol van de fabrikant voor FISH hebt voltooid, brengt u DAPI-montagemedium aan en plaatst u een afdekplaat op de dia. Sluit de coverslip af met doorzichtige nagellak.
  5. Beeld de dia's af op een rechtopstaande samengestelde fluorescentiemicroscoop en verwerk ze met behulp van een geschikte beeldverwerkingssoftware. Hier werd de CellSens software gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Algemene procedureresultaten (figuur 6)
In de studie waren er drie gemanipuleerde groepen. Deze omvatten placenta's geïnjecteerd met een algemeen CRISPR Cas9-controleplasmide (Cas9 Control), een activeringscontrole CRISPR-plasmide (Act Control) of een IGF-1 SAM-activeringsplasmide (Igf1-OE). De Cas9 Control is beter geschikt voor knock-out plasmiden en de activatiecontrole is beter geschikt voor overexpressie/activatie plasmiden. Om de levensvatb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De placenta is een primaire regulator van foetale groei en zoals eerder opgemerkt, kunnen veranderingen in de expressie of functie van placenta-genen de foetale ontwikkeling aanzienlijk beïnvloeden6. Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt om een gerichte in vivo CRISPR-manipulatie van de placenta van de muis uit te voeren met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak. Deze techniek zorgt voor een aanzienlijke opbrengst van levensvatbare embryo's en hun bijbehorend...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 en NIH T32GM145441. De auteurs bedanken Dr. Val Sheffield en Dr. Calvin Carter's laboratoria aan de Universiteit van Iowa voor het gebruik van hun operatiekamer en apparatuur, evenals Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan en Dr. Matthew Weber voor hun hulp bij microscopie. De auteurs bedanken ook Dr. Sara Maurer, Maya Evans en Sreelekha Kundu voor hun hulp bij de pilootoperaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 ml TubesUSA Scientific Inc1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBSThermo Fisher ScientificJ61899.AP
96 Well plateCornings3598For BCA kit
Absorbent UnderpadsFisher Scientific14-206-62
Activation Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-437275Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse TranscriptaseNew England BiolabsM0277LUse for cDNA synthesis
Anesthetic Gas VaporizorVetamacVAD-601TTVAD-compact vaporizer
Artifical Tear GelAkornNDC 59399-162-35
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227Protein quantification
BiovortexerBellco Glass, Inc.198050000Hand-held tissue homogenizer
CellSens SoftwareOlympusV4.1.1Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810EppendorfEP022628168Plate centrifuge
ChloroformThermo Fisher ScientificJ67241-APRNA isolation
Cotton Tipped ApplicatorsProAdvantage77100Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control PlasmidSanta Cruz Biotechnologysc-418922Dnase-free water provided for dilution
CryoStatLeicaCM1950
Dissection MicroscopeLeicaM125 CUsed for post-necroscopy imaging
Dissolvable SuturesMed Vet InternationalJ385H
Distilled WaterGibco15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Thermo fisher Scientific14190144(-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)BTX Harvard Apparatus45-0662Generator only
Electric RazorWahlCL9990Kent Scientific
Electroporation paddles/TweezertrodesBTX Harvard Apparatus45-04873 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PKGrainger21RK94Placenta embedding cassettes
EthanolThermo Fisher Scientific268280010
F-Air CanistersPenn Veterinary Supply IncBIC80120Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCFSigmaF7252-5GDissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader)Fisher Scientific14377576Can be used for BCA and ELISA
ForcepsVWR82027-386Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma AldrichHT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)Sutter InstrumentB150-86-10O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)Thermo Scientific1861281Protein homogenization buffer
Heating PadThermotechS766DDigitial Moist Heating Pad
HemostatsVWR10806-188Fully surrated jaw; curved
Hot Water BathFisher Scientific20253Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1)Santa Cruz Biotechnologysc-421056-ACTDnase-free water provided for dilution
Induction ChamberVetamac941443No specific liter size required
IsofluranePiramal Pharma LimitedNDC 66794-013-25
Isoproponal/2-ProponalFisher ScientificA451-4RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/mlAkornNDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum ChlorideSigma Aldrich63069-100ML1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeFisher Scientific4309849Barcoded plates not required
Microcapillary TipEppendorf5196082001Attached to BTX Microinjector
MicroinjectorBTX Harvard Apparatus45-0766Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine)BTX Harvard Apparatus45-0751MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97Sutter InstrumentP-97Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker)scilogex822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA KitR & D SystemsMG100
NeedlesBD - Becton, Dickson, and Company30510630 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen TankLinde7727-37-9Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)Norbrook Laboratories LimitedNDC 55529-040-10Analesgic such as Meloxicam
Nose ConeVetamac9216099-14 mm
Opal 620 detection dyeAkoya BiosciencesSKU FP1495001KTUsed for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) CompoundSakura4583
Oxygen TankLinde7782 - 44 - 7Medical grade oxygen
PestlesUSA Scientific Inc14155390
Povidone-Iodine Solution, 5%Avrio Health L.P.NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific4367659Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers)New England BiolabsS1330SUse for cDNA synthesis
Razor BladeGrainger26X080

Referenties

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236(2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632(2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Placentaire CRISPR manipulatiemuizenplacentain vivo genbewerkingplacentaire genexpressieelectroporatietechniekplasmidinjectieIGF 1 overexpressieembryonale ontwikkelingmaterno foetale interfaceqPCR analyse
Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.