Hier beschrijven we een tijdspecifieke methode om kritische ontwikkelingspaden in de placenta van de muis in vivo effectief te manipuleren. Dit wordt uitgevoerd door de injectie en elektroporatie van CRISPR-plasmiden in de placenta's van zwangere moederdieren op embryonale dag 12.5.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De placenta is een essentieel orgaan dat de ontwikkeling van zoogdieren in de baarmoeder reguleert en in stand houdt. De placenta is verantwoordelijk voor de overdracht van voedingsstoffen en afvalstoffen tussen moeder en foetus en de productie en afgifte van groeifactoren en hormonen. Placenta-genetische manipulaties bij muizen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de specifieke rol van de placenta in de prenatale ontwikkeling. Placenta-specifieke Cre-expressing transgene muizen hebben verschillende effectiviteit, en andere methoden voor placentale genmanipulatie kunnen nuttige alternatieven zijn. Dit artikel beschrijft een techniek om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-genmanipulatie, die kan worden gebruikt om de expressie van gerichte genen te wijzigen. Met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak ondergaan zwangere moederdieren een laparotomie op embryonale dag 12.5 (E12.5) en wordt een CRISPR-plasmide afgeleverd door een glazen micropipette in de individuele placenta's. Het plasmide wordt na elke injectie onmiddellijk geëlektropoeerd. Na damherstel kunnen de placenta's en embryo's zich verder ontwikkelen tot beoordeling op een later tijdstip. De evaluatie van de placenta en nakomelingen na het gebruik van deze techniek kan de rol van tijdspecifieke placentafunctie in de ontwikkeling bepalen. Dit type manipulatie zal een beter begrip mogelijk maken van hoe placentale genetica en functie de foetale groei en ontwikkeling in meerdere ziektecontexten beïnvloeden.
Inleiding
De placenta is een essentieel orgaan dat betrokken is bij de ontwikkeling van de foetus. De belangrijkste rol van de placenta is om essentiële factoren te bieden en de overdracht van voedingsstoffen en afval van en naar de foetus te reguleren. Zoogdier placenta's zijn samengesteld uit zowel foetaal als maternaal weefsel, die de foetale-maternale interface vormen, en dus de genetica van zowel de moeder als de foetus beïnvloeden functie1. Genetische afwijkingen of verminderde functie van de placenta kunnen de foetale ontwikkeling drastisch veranderen. Eerder werk heeft aangetoond dat placentale genetica en ontwikkeling geassocieerd zijn met de ve....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met en in overeenstemming met de federale regelgeving en het beleid van de Universiteit van Iowa en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dieren en veehouderij
- Houd de dieren in een daglichtcyclus van 12 uur met voedsel en water ad libitum.
- Gebruik CD-1 vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-15 weken. Gebruik de aanwezigheid van een copulatorische plug om E0.5 te identificeren.
- Op E0.5, afzonderlijk huisvesten de zwangere moederdieren.
2. Kalibratie van de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Algemene procedureresultaten (figuur 6)
In de studie waren er drie gemanipuleerde groepen. Deze omvatten placenta's geïnjecteerd met een algemeen CRISPR Cas9-controleplasmide (Cas9 Control), een activeringscontrole CRISPR-plasmide (Act Control) of een IGF-1 SAM-activeringsplasmide (Igf1-OE). De Cas9 Control is beter geschikt voor knock-out plasmiden en de activatiecontrole is beter geschikt voor overexpressie/activatie plasmiden. Om de levensvatb.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De placenta is een primaire regulator van foetale groei en zoals eerder opgemerkt, kunnen veranderingen in de expressie of functie van placenta-genen de foetale ontwikkeling aanzienlijk beïnvloeden6. Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt om een gerichte in vivo CRISPR-manipulatie van de placenta van de muis uit te voeren met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak. Deze techniek zorgt voor een aanzienlijke opbrengst van levensvatbare embryo's en hun bijbehorend.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 en NIH T32GM145441. De auteurs bedanken Dr. Val Sheffield en Dr. Calvin Carter's laboratoria aan de Universiteit van Iowa voor het gebruik van hun operatiekamer en apparatuur, evenals Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan en Dr. Matthew Weber voor hun hulp bij microscopie. De auteurs bedanken ook Dr. Sara Maurer, Maya Evans en Sreelekha Kundu voor hun hulp bij de pilootoperaties.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 |
Referenties
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
