Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

Samenvatting

We beschrijven een methode om retinaal pigmentepitheel (RPE) efficiënt te scheiden van het netvlies in menselijke ogen en hele RPE / choroïde flatmounts te genereren voor histologische en morfometrische analyses van de RPE.

Samenvatting

Het retinale pigmentepitheel (RPE) en het netvlies zijn functioneel en structureel verbonden weefsels die samenwerken om lichtperceptie en zicht te reguleren. Eiwitten op het RPE apicale oppervlak zijn nauw geassocieerd met eiwitten op het buitenste segmentoppervlak van de fotoreceptor, waardoor het moeilijk is om de RPE consistent te scheiden van de fotoreceptoren / netvlies. We hebben een methode ontwikkeld om het netvlies efficiënt te scheiden van de RPE van menselijke ogen om complete RPE / choroïde en retina flatmounts te genereren voor afzonderlijke cellulaire analyse van de fotoreceptoren en RPE-cellen. Een intravitreale injectie van een oplossing met hoge osmolariteit van D-mannitol, een suiker die niet door de RPE wordt getransporteerd, veroorzaakte de scheiding van de RPE en het netvlies over de gehele achterste kamer zonder schade aan de RPE-celverbindingen te veroorzaken. Er werden geen RPE-pleisters waargenomen die aan het netvlies waren bevestigd. Phalloidine-etikettering van actine toonde RPE-vormbehoud en maakte morfometrische analyse van het gehele epitheel mogelijk. Een op kunstmatige intelligentie (AI) gebaseerde software is ontwikkeld om de RPE-celranden nauwkeurig te herkennen en te segmenteren en 30 verschillende vormstatistieken te kwantificeren. Deze dissectiemethode is zeer reproduceerbaar en kan eenvoudig worden uitgebreid naar andere diermodellen.

Inleiding

Het retinale pigmentepitheel (RPE) en het neurale netvlies zijn sterk met elkaar verbonden vanwege de sterke fysiologische afhankelijkheid van de fotoreceptoren van de RPE. Tijdens dissectie veroorzaakt de mechanische scheiding van het neurale netvlies van de RPE scheuren van de RPE-cellen, waarbij de apicale delen van de RPE vast blijven zitten aan de buitenste segmenten van de retinale fotoreceptoren. De mate van RPE-retinale adhesie is zo groot dat de hoeveelheid pigment die na scheiding op het netvlies achterblijft, wordt gebruikt om de sterkte van retinale adhesie te kwantificeren¹. Met name RPE tight junctions en de actinestructuur die ze verbindt, die zich aan de apicale kant bevinden, breken af tijdens mechanische scheiding. Daarom resulteert het kleuren van RPE flatmounts voor celranden in een fragmentarische monolaag waarin veel cellen ontbrekende randen hebben. Dit effect wordt verergerd wanneer het weefsel vóór dissectie wordt gefixeerd met paraformaldehyde (PFA), omdat de eiwitten verknoopt raken.

Studies naar intravitreale medicijnafgifte hebben aangetoond dat injecties van hyperosmotische oplossingen in de achterste kamer netvliesloslating induceren ^2,3. In deze experimenten veroorzaakte 50 μL van verschillende oplossingen, variërend van 1.000 mOsm tot 2.400 mOsm, geïnjecteerd in het midden-glasvocht retinale loslating binnen enkele minuten. Opmerkelijk is dat zelfs na lange blootstellingen aan oplossingen met een hoge osmolariteit, de RPE-tight junctions intact leken in de transmissie-elektronenmicroscopische beelden van zowel konijnen- als apenogen³. Volgens een vergelijkbare strategie injecteerden we in het midden-glasvocht een hyperosmotische oplossing van D-mannitol om een efficiënte netvliesloslating te induceren voordat RPE-dissectie werd uitgevoerd. Omdat D-mannitol niet wordt getransporteerd door de RPE⁴, wordt een hoge intravitreale concentratie gehandhaafd, waardoor een osmotische gradiënt wordt gegenereerd. De efficiënte scheiding van de RPE en het netvlies over de gehele achterste kamer garandeert het behoud van de RPE cellulaire juncties en maakt de studie van RPE-morfometrie op de gehele flatmount mogelijk. Daarnaast hebben we een op kunstmatige intelligentie (AI) gebaseerde software ontwikkeld die fluorescerend gelabelde RPE-celranden herkent en segmenteert, 30 verschillende vormstatistieken kwantificeert en heatmaps van elke metriek produceert voor visualisatie ^5,6.

Protocol

Kadaver menselijke globes werden verkregen van het Advanced Sight Network (Birmingham, AL). Werk uitgevoerd op kadaverweefsel is door de NIH Institutional Review Board vrijgesteld van de ethische commissie voor onderzoek.

1. Eye globe verzending

1. Na enucleatie verschepen we verse oogbollen in een container gevuld met ijskoude DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺.
   OPMERKING: Het is beter om het oog binnen 24 uur na enucleatie te ontleden. De RPE-morfologie wordt tijdens dit tijdvenster niet gewijzigd.

2. Siliconen schimmel voorbereiding

1. Snijd de onderste 20 mm van een ronde bodembuis met een diameter van 25 mm. Plaats het aan de voet van een vierkante weegboot (81 mm x 81 mm x 25 mm).
2. Meng de twee componenten van de Silicon Elastomer Kit in een verhouding van 10: 1, waarbij je er rekening mee houdt dat lucht niet wordt ingesloten. Giet het mengsel in de weegboot met daarin het bolvormige stuk van de buis met ronde bodem.
3. Laat de siliconen een nacht op kamertemperatuur uitharden. Verwijder de weegboot en de buis met ronde bodem uit de uitgeharde siliconen mal.

3. RPE-dissectie

1. Reinig de sclera van de frisse oogbol van spieren en bindweefsel. Bevestig het oog aan de siliconen mal met behulp van 27 G naalden die door de sclera zijn geregen. Vul de holte van de mal met DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺.
   OPMERKING: Let op dat u de oogkamer niet doorbreekt. De naalden mogen alleen door de sclera.
2. Gebruik een spuit van 1 ml en een naald van 21 g om ~ 400 μL van 1.700 mOsm D-mannitol-oplossing in het glasvocht te injecteren. Steek de naald door de pars plana om te voorkomen dat de voorste kamer van het oog wordt doorboord. Laat het oog ~45 min op kamertemperatuur staan.
3. Knip de voorste kamer ter hoogte van de pars plana open met een fijne schaar en tang. Vul de achterste oogkamer met DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺. Onder de stereomicroscoop lokaliseer je de macula (de gele vlek op het netvlies).
4. Als er een chirurgische glasvochtsnijder beschikbaar is, verwijder dan het glasvocht en vervang het door DPBS 1x door Ca²⁺ en Mg²⁺. U kunt ook proberen het glasvocht met een tang op te tillen en met een fijne schaar te knippen.
5. Let op het behoud van het maculagebied en snijd het oog in kwadranten: nasaal, temporal, superieur en inferieur. Verwijder de naalden als ze in de weg zitten.
6. Breng de boterzachte achterste oogkamer over in een petrischaaltje van 100 mm met DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺. Voordat u het netvlies verwijdert, markeert u het bloemblad dat de macula bevat door een kleine snede (V-vormig) in de ciliaire marge te maken. Til en snijd al het glasvocht dat op het netvlies ligt.
7. Til het netvlies voorzichtig van meerdere kanten op met een gebogen spatel of een tang om te controleren of het netvlies is losgemaakt van de RPE en om wat vloeistof tussen de twee lagen te laten circuleren.
   OPMERKING: Het netvlies zal nog steeds aan de periferie (ciliaire marges) en aan de oogzenuw worden bevestigd.
8. Snijd het netvlies van de ciliaire marges in alle bloemblaadjes en zorg ervoor dat u de RPE niet bekrast. Plaats het weefsel in 4% PFA en incubeer gedurende ~ 1 uur. Was 3x met DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺. Breng het weefsel over in een container gevuld met DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺ en bewaar het bij 4 °C.
   OPMERKING: Op dit punt is het netvlies alleen bevestigd aan de oogzenuw. Dit is een pauzepunt in dit experiment.
9. Breng het monster over in een petrischaaltje van 100 mm met DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺. Pons de oogzenuwkop uit met een biopsiestoot van 1,5 mm en verzamel het netvlies. Bewaar het neurale netvlies in DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺ bij 4 °C.
   OPMERKING: Voordat u de oogzenuwkop uitslaat, moet u ervoor zorgen dat u de oogzenuw zoveel mogelijk aan de sclerale kant snijdt. Dit zal de precisie van de pons verhogen. Het uitstoten van de oogzenuw nadat de flatmount is gefixeerd in 4% PFA vermindert de schade aan de RPE-cellen rond de oogzenuw.
10. Verwijder de sclera uit het RPE/vaatvlies door de RPE/vaatvlieslaag voorzichtig uit de periferie op te tillen en de vaatvliesvaten en het bindweefsel tussen de sclera en de RPE door te snijden met een Vannas-veerschaar. Zodra het RPE/vaatvlies volledig gescheiden is van de sclera, verzamel je de RPE/vaatvormige laag. Breng het weefsel over in een container gevuld met DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺ en bewaar het bij 4°C.
    OPMERKING: Op dit moment kan het experiment worden onderbroken.

4. Vlekken

1. Breng het RPE/vaatvlies over in een putje van een 6-well plaat. Blok en permeabiliseer het monster in DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺ met 1% runderserumalbumine (BSA), 0,5% Tween 20 en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
2. Incubeer het monster met falloidine geconjugeerd met een fluorofoor van 647 bij een verdunning van 1:250 in DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺ met 1% BSA, 0,5% Tween 20 en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was 3x in DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺.
3. Breng het RPE/vaatvliesmonster over op een glasplaat van 50 mm x 75 mm en druk het plat. Snijd elk "bloemblad" in tweeën om het monster platter te maken. Let op de macula. Teken een contour van de flatmount met een hydrofobe pen.
4. Om de lipofuscine-autofluorescentie te doven, voegt u 500 μL van de tot 1:20 verdunde autofluorescentie-oplossing toe aan 70% ethanol en incubeert u gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
5. Was grondig (minstens 3x) in DPBS 1x met Ca²⁺ en Mg²⁺. Verwijder de DPBS en voeg het montagemedium toe. Leg een coverglas op de flatmount en sluit af met nagellak.
6. Beeld de flatmount af met een fluorescentiemicroscoop (bij voorkeur met een 10x of 20x objectief).

5. REShAPE analyse

OPMERKING: Aangezien het op REShAPE AI gebaseerde algoritme is getraind op 10x- en 20x-afbeeldingen, wordt het daarom ten zeerste aanbevolen om een 10x- of 20x-objectief te gebruiken bij het in beeld brengen. Zo niet, dan moeten de afbeeldingen dienovereenkomstig worden aangepast.

1. Als de beelden met meer dan één fluorescerend kanaal worden verkregen, isoleert u het kanaal dat wordt gebruikt om de celranden te verkrijgen. Exporteer de afbeeldingen als 16-bits grijswaarden TIF-bestanden.
   OPMERKING: Afbeeldingen die zijn verkregen met de bestandsextensie .czi hoeven niet te worden geëxporteerd als TIF-bestanden, maar het kanaal met de celranden moet nog steeds worden geïsoleerd.
2. Installeer de software op Windows x64- of Linux-platforms (Centos 7).
   OPMERKING: De software en de instructies voor de installatie zijn te vinden op https://github.com/nih-nei/REShAPE.
3. Open de software (figuur 1).
4. Selecteer op het tabblad Mappen de invoer- en uitvoermappen. Selecteer in de invoermap de map die de afbeeldingen bevat. Laat de software in de uitvoermap het pad automatisch wijzigen in "invoermap /Verwerkt". U kunt ook de uitvoermap handmatig wijzigen.
   OPMERKING: De software itereert door alle afbeeldingen in de invoermap.
5. Kies op het tabblad NN-segmentatieopties de volgende instellingen voor afbeeldingssegmentatie:
   1. Batchgrootte: typ een waarde van 20 in het tekstvak als een goed startpunt, maar verlaag deze als het systeem geen GPU's (Graphics Processing Units) meer heeft.
      OPMERKING: De oorspronkelijke afbeelding wordt opgesplitst in kleinere tegels voor verwerking. De batchgrootte geeft aan hoeveel tegels tegelijk kunnen worden verwerkt.
   2. GPU gebruiken?: Als het systeem niet genoeg GPU-bronnen heeft, vinkt u het selectievakje Nee aan.
   3. Interne schaal: wijzig met behulp van het vervolgkeuzemenu de interne schaling van Geen in gevallen waarin de afbeeldingen niet zijn verkregen met een doelstelling van 10x of 20x. Schaal bijvoorbeeld 40x afbeeldingen naar de helft van de grootte met behulp van de 1/2-knop . De schaalaanpassingsopties die beschikbaar zijn in het vervolgkeuzemenu zijn als volgt: 5x, 2x, Geen, 1/2, 1/5.
      OPMERKING: De machine learning is getraind met 10x en 20x images. Het is mogelijk dat celranden niet worden herkend van afbeeldingen die bij andere vergrotingen zijn gemaakt. In dit geval verschijnen binaire afbeeldingen volledig zwart.
   4. Arti-filter: gebruik het artefactfiltertabblad om zeer heldere deeltjes (puin of kleine delen van het netvlies of bindweefsel rond de oogzenuw) te verwijderen die in de afbeelding aanwezig kunnen zijn en de segmentatie van de celrand kunnen verstoren. Er wordt standaard geen filter gebruikt. De kunstmatige filteropties in het vervolgkeuzemenu zijn als volgt: Normaal, Sterk en Zwak.
6. Voeg op het tabblad Optie voor tegelafbeelding een waarde in het tekstvak in om de hoeveelheid overlap tussen de afbeeldingstegels op te geven door de parameter Padtegels per aan te passen. Een overlap van 100 pixels werkt meestal goed.
7. Stem op het tabblad Opties voor uitvoerafbeelding de instellingen voor het genereren van heatmaps af:
   1. Tegelbeelden reconstrueren?: als het systeem niet over voldoende middelen beschikt voor de analyse van grote afbeeldingen, vink dan het vakje Nee aan om de software toe te staan de analyse te voltooien door afzonderlijke tegels op te slaan zonder de hele afbeelding te reconstrueren.
   2. Kleurenafbeeldingen maken: Als u heatmaps wilt genereren, selecteert u Alles in het vervolgkeuzemenu.
   3. Kies voor Kleuren een van de verschillende kleurenpaletten die beschikbaar zijn in het vervolgkeuzemenu: Thermisch, Groen, Mpl-magma, Fase, Vuur, Jet, Cyaan heet.
   4. Sla de afbeeldingen bij Afbeeldingsindeling op als TIF of PNG door een van de opties op het tabblad te selecteren.
   5. Met betrekking tot de functie Handmatige limieten gebruiken? vinkt u het selectievakje Nee aan om de software de minimum- en maximumwaarden te laten gebruiken die in elke afbeelding zijn gedetecteerd. Vink het selectievakje Ja aan om het bereik van waarden voor elke vorm metrische heatmap handmatig aan te passen en klik op de knop Limieten instellen om bereiken voor de afzonderlijke parameters te kiezen door waarden in de tekstvakken in te voegen. Nadat u de interessante waarden hebt gewijzigd, klikt u op Opslaan. Klik op Standaardwaarden laden om alle limieten opnieuw in te stellen.
      OPMERKING: Gebruik handmatige limieten als heatmaps van meerdere afbeeldingen moeten worden vergeleken, bijvoorbeeld bij het vergelijken van de effecten van verschillende verbindingen op de celvorm. Op deze manier wordt hetzelfde waardenbereik gebruikt. De set waarden die handmatig moet worden ingevoerd, varieert afhankelijk van het type monster. Het wordt aanbevolen om een paar iteraties uit te voeren om het optimale bereik te kiezen.
8. Selecteer op het tabblad Beperkingen voor celgrootte voor analyse een drempelwaarde voor celgrootte voor de analyse:
   1. Voeg in Onder celgrootte in het tekstvak de grootte in van de kleinste cel die in de analyse moet worden opgenomen.
   2. Voeg in Bovenste celgrootte in het tekstvak de grootte in van de grootste cel die in de analyse moet worden opgenomen.
      OPMERKING: De eenheid van celgrootte verandert van pixels in micrometers in het kwadraat, afhankelijk van de optie die is gekozen op het tabblad Geautomatiseerde eenheidsconversie .
9. Kies op het tabblad Geautomatiseerde eenheidsconversie de voorkeurseenheid voor de analyse:
   1. Schakel in Pixels converteren naar echte eenheden? het selectievakje Nee in om de analyse in pixeleenheden uit te voeren. Schakel het selectievakje Ja in om de analyse in micrometers uit te voeren.
   2. Voer bij Lengte van schaalbalk (Pixels) de pixelwaarde in het tekstvak in.
   3. Voer bij Lengte van schaalbalk (Micron) in het tekstvak de overeenkomstige afstand in micrometers in.
10. Om de analyse te starten, drukt u op Go For It.
    OPMERKING: De software kan ook de levensvatbaarheid van cellen meten wanneer de cellen zijn gekleurd met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en propidiumjodide (tabblad CZI-opties ), maar dit is niet van toepassing op RPE flatmounts.

Figuur 1: REShAPE grafische gebruikersinterface. De GUI heeft verschillende tabbladen voor het selecteren van de werkmappen (tabblad Mappen ), het wijzigen van de segmentatieopties (tabblad NN-segmentatieopties en betegelde afbeeldingsopties ), het opgeven van de parameters voor analyse (tabbladen Celgroottebeperkingen voor analyse en geautomatiseerde eenheidsconversie ) en voor het genereren van heatmaps (tabblad Opties voor uitvoerafbeeldingen ). Afkorting: GUI = grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Dit protocol resulteert in een single-plane afbeelding van een flatmount, waarbij de cellocatie en 30 vormstatistieken worden gemeten voor elke correct geïdentificeerde RPE-cel (figuur 2). Een map met de naam "Verwerkt" wordt automatisch gegenereerd in de invoermap. Deze map bevat vier submappen, genaamd 'Analyse', 'Kleurgecodeerd', 'Gecombineerde bestanden' en 'Gesegmenteerde afbeeldingen', en enkele tijdelijke bestanden die tijdens de analyse zijn gegenereerd. De map "Gecombineerde bestanden" bevat een spreadsheet met alle vormmetingen en een spreadsheet met de frequenties van het aantal celburen van alle gecombineerde bestanden. De map "Analyse" bevat een spreadsheet met alle vormmetingen en een spreadsheet met de frequenties van de celbuurmantellingen voor elke afbeelding afzonderlijk. De map "Gesegmenteerde afbeeldingen" bevat de laatste binaire maskers van de RPE-celranden; het kan worden gebruikt om de kwaliteit van de segmentatie te evalueren. De map "Kleurgecodeerd" bevat heatmaps voor elke vormmeting om de vormpatronen in elke afbeelding te visualiseren. De metrische definities en afkortingen van vorm zijn te vinden in tabel 1.

Soms kunnen RPE flatmounts resterende stukjes netvlies bevatten die niet netjes zijn verwijderd, vooral rond de oogzenuw. Falloidinekleuring van het monster resulteert in een sterk signaal afkomstig van het netvlies, en dit kan problemen veroorzaken voor RPE-celrandsegmentatie. Sommige tegels zien er volledig zwart uit, terwijl de omliggende tegels een normale segmentatie vertonen. Andere heldere objecten die in de afbeelding aanwezig kunnen zijn, veroorzaken ook het genereren van zwarte tegels (figuur 3). Als u in deze gevallen een van de filteropties (Zwak, Normaal, Sterk) kiest die beschikbaar zijn in het vervolgkeuzemenu Arti-filter , wordt de vorming van zwarte tegels voorkomen.

REShAPE neemt 8-bits of 16-bits grijswaardenafbeeldingen als invoer, maar geen RGB-afbeeldingen. Het gebruik van RGB-afbeeldingen voor de REShAPE-analyse produceert volledig zwarte binaire afbeeldingen. Als dit gebeurt, worden de RGB-afbeeldingen geconverteerd naar grijswaarden correct gesegmenteerde binaire afbeeldingen opgeleverd (figuur 4). In sommige gevallen waarin de RPE-randen niet correct worden herkend, bijvoorbeeld als de kleuring niet optimaal is of als het monster wordt beschadigd door een kras (figuur 5A), kunnen grote klonten cellen worden geïdentificeerd als een enkele zeer grote cel (figuur 5B). In dit geval kunnen grote objecten worden uitgesloten van de analyse door de drempel voor celgrootte te verlagen (figuur 5C). Dit kan worden bereikt door een lagere waarde in te voegen in het tekstvak Grootte van bovenste cel. Dit zal echter resulteren in een verandering in het bereik van de heatmap. Als een onderzoeker ervoor kiest om dit te doen, is het ook mogelijk om het oorspronkelijke heatmapbereik (figuur 5D) te behouden door het selectievakje Ja aan te vinken in de functie Handmatige limieten gebruiken? . Vervolgens moet de onderzoeker met de linkermuisknop op de knop Limieten instellen klikken en de gewenste waarden in de tekstvakken invoegen om de handmatige limieten op te geven.

Figuur 2: Volledige morfometrische analyse van een volledige menselijke RPE-monolaag. (A) Een lage vergrotingsweergave van een volledige menselijke RPE/choroïde flatmount (magenta: falloidine). (B) Een ingezoomd beeld van met falloidine gekleurde RPE-cellen. (C) REShAPE-gegenereerde segmentatie van de RPE-celranden voor een volledige menselijke RPE/choroid flatmount en (D) de overeenkomstige ingezoomde weergave. (E) Een software-gegenereerde heatmap die het celgebied van de individuele RPE-cellen in de gehele menselijke flatmount illustreert. De thermische schaal in de linkerbovenhoek toont het gebruikte waardenbereik. (F) De overeenkomstige ingezoomde weergave met afzonderlijke RPE-cellen die per gebied zijn gekleurd. Schaalstaven = (B,D,F) 50 μm, (A,C,E) 5 mm. Afkorting: RPE = retinaal pigmentepitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Filteren van heldere artefacten. (A) Een menselijke RPE-flatmount gekleurd voor celranden (magenta: falloidine) kan heldere gebieden (groene rechthoeken) presenteren die segmentatie verstoren. (B) De RPE-celrandsegmentatie van de gehele flatmount bevat drie volledig zwarte tegels (groene pijlen) die overeenkomen met heldere fluorescentiegebieden. (C,E) Twee van de zwarte tegels komen overeen met gebieden met heldere stippen, die mogelijk wat puin zijn. (D) Een van de zwarte tegels werd gegenereerd door een stuk neuraal netvlies rond de oogzenuw dat niet correct werd verwijderd. De stukjes neuraal netvlies zijn aanzienlijk helderder dan de RPE-laag en belemmeren celsegmentatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Invoerafbeelding vereist. De RPE-cellen die zijn gekleurd voor celranden zijn opgeslagen als (A) RGB of als (B) grijswaarden 16-bits afbeeldingen voor REShAPE-analyse. (C) De uitvoer van de RBG-beeldanalyse is een zwart binair beeld, (D), terwijl de analyse van het grijswaardenbeeld een correct gesegmenteerd binair van de celranden oplevert. REShAPE kan alleen 8-bits of 16-bits grijswaardenafbeeldingen analyseren. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Suboptimale resultaten. (A) Een afbeelding van een deel van de RPE-monolaag waar de cellen gekleurd met falloïdine per ongeluk werden bekrast. (B) Een heatmap van RPE-cellen gekleurd door de dimensie van het celgebied. Een grote drempel voor de bovenste celgrootte omvat grote objecten in de analyse. (C) Een celgebied heatmap waarin een kleinere bovenste celgroottedrempel werd gekozen om grote objecten uit te sluiten van de analyse. (D) Een warmtekaart voor het celgebied waarin een kleinere drempel voor de bovenste celgrootte werd gekozen en handmatige limieten werden ingesteld om het oorspronkelijk gebruikte heatmapbereik te behouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: REShAPE-parameters. De tabel bevat de definitie van elke parameter en de afkortingen die worden gebruikt in de onbewerkte spreadsheets ("_Data.csv" -bestanden) en voor de heatmaps. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

De consistente en efficiënte scheiding van menselijke RPE en netvliezen kan worden bereikt met behulp van dit protocol. Deze methode maakt het mogelijk om regionale verschillen in RPE-vorm over hele menselijke netvliezen te^{bestuderen 5}. Een cruciale stap in het protocol is de fysieke scheiding van de RPE en het netvlies. Als de twee weefsels in sommige gebieden niet volledig zijn losgemaakt, moet men het netvlies voorzichtig optillen en ervoor zorgen dat de weefsels niet worden gebroken. De REShAPE-analyse van grote flatmounts kan het gebruik van systemen met aanzienlijke RAM-bronnen vereisen. In dit geval kan het opnieuw samenstellen van de volledige afbeelding worden uitgeschakeld om de software in staat te stellen de analyse met succes af te ronden ondanks een gebrek aan verwerkingsbronnen.

De belangrijkste beperking van het gebruik van REShAPE om menselijke RPE flatmounts te segmenteren, is dat het AI-algoritme meestal werd getraind op beelden van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide RPE. Als gevolg hiervan is de segmentatie van menselijke RPE flatmounts minder nauwkeurig. RPE-cellen van oudere donoren bevatten een grote hoeveelheid lipofuscine⁷ en het brede spectrum van de autofluorescentie interfereert met celrandsegmentatie. In de toekomst zullen meer afbeeldingen van RPE flatmounts worden gebruikt om de celrandsegmentatie in dit soort monsters te verbeteren. Ondanks deze beperking is REShAPE specifiek getraind om RPE-celranden te herkennen en te segmenteren en presteert het beter dan andere bestaande methoden, zoals Voronoi⁸ en CellProfiler^{9-segmentatie} van RPE-cellen.

Bovendien biedt REShAPE in vergelijking met handmatige segmentatie¹⁰ het voordeel dat grote afbeeldingen snel worden geanalyseerd (~ 130.000 pixels x 130.000 pixels werden getest). Kortom, deze dissectiemethode is zeer reproduceerbaar en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar andere diermodellen. Daarnaast kan de software worden gebruikt om de RPE-vorm in oogflatmounts of in celkweekmodellen te bestuderen om het effect van bepaalde behandelingen te onderzoeken. Ten slotte maakt de veelzijdigheid van REShAPE het breed toepasbaar voor de analyse van andere soorten epitheelcellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biopsy punch 1.5 mm	Acuderm Inc.	P1525
Bovine albumin	MP Biomedicals	160069
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 dikte	Brain Research Laboratories	5075-1.5D
Gebogene spatel	Katena	K3-6600
D-Mannitol	Sigma	M9546
DPBS 1x met Ca2+ en Mg2+	Gibco	14040-133
Fijne schaar	Fine Science Tools	14558-11
Fluormount-G	Southern Biotech	0100-01
Pincet - Dumont #5	Fine Science Tools	11252-23
Microscoopglaasjes 50 x 75 x 1.2 mm	Brain Research Laboratories	5075
Naald 21 G x 1-1/2" hypodermisch	Becton Dickinson (BD)	305167
Naald 27 G x 1-1/4" hypodermisch	Becton Dickinson (BD)	305136
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Petrischaal 100 mm	Corning	430167
Phalloidin-iFluor 647	Abcam	ab176759
Scheermessen	PAL (Personna)	62-0177
Rondbodembuizen 50 mL	Newegg	9SIA4SR9M88854
Silicon Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	4019862
Vierkante weegboot (81 mm x 81 mm x 25 mm)	Sigma	W2876
Chirurgisch vitrectomiesysteem	BD Visitrec	585100	optioneel
Spuit 1 mL	Becton Dickinson (BD)	309659
Triton X-100	Sigma	T9284
TrueBlack	Biotium	23007	autofluorescentieknelder
Tween 20	Affymetrix	20605
Vannas-veer schaar - 3 mm snijrand	Fine Science Tools	15000-10