In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het proces van myelinisatie is essentieel om een snelle en voldoende signaaltransductie in het zenuwstelsel mogelijk te maken. In het perifere zenuwstelsel gaan neuronen en Schwann-cellen een complexe interactie aan om de myelinisatie van axonen te beheersen. Verstoringen van deze interactie en afbraak van de myelineschede zijn kenmerken van inflammatoire neuropathieën en komen secundair voor bij neurodegeneratieve aandoeningen. Hier presenteren we een cocultuurmodel van dorsale wortelganglionexplantaten en Schwann-cellen, dat een robuuste myelinisatie van perifere axonen ontwikkelt om het proces van myelinisatie in het perifere zenuwstelsel te onderzoeken, axon-Schwann-celinteracties te bestuderen en de potentiële effecten van therapeutische middelen op elk celtype afzonderlijk te evalueren. Methodologisch werden dorsale wortelganglions van embryonale ratten (E13.5) geoogst, gedissocieerd van hun omringende weefsel en gedurende 3 dagen als volledige explantaten gekweekt. Schwann-cellen werden geïsoleerd van 3 weken oude volwassen ratten en ischiaszenuwen werden enzymatisch verteerd. De resulterende Schwann-cellen werden gezuiverd door magnetisch geactiveerde celsortering en gekweekt onder neureguline- en forskoline-verrijkte omstandigheden. Na 3 dagen dorsale wortel ganglion explantatiecultuur werden 30.000 Schwann-cellen toegevoegd aan één dorsale wortelganglionexplant in een medium dat ascorbinezuur bevat. De eerste tekenen van myelinisatie werden gedetecteerd op dag 10 van cocultuur, door verspreide signalen voor myeline basisch eiwit in immunocytochemische kleuring. Vanaf dag 14 werden myelineschedes gevormd en verspreid langs de axonen. Myelinisatie kan worden gekwantificeerd door myeline basiseiwitkleuring als een verhouding van het myelinisatiegebied en het axongebied, om rekening te houden met de verschillen in axonale dichtheid. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om verschillende aspecten van perifere myelinisatie in vitro te bestuderen, wat cruciaal is voor het begrijpen van de pathologie van en mogelijke behandelingsmogelijkheden voor demyelinisatie en neurodegeneratie bij inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten van het perifere zenuwstelsel.
Inleiding
In het perifere zenuwstelsel (PNS) wordt snelle informatietransductie gemedieerd door met myeline omwikkelde axonen. De myelinisatie van axonen is essentieel om de snelle voortplanting van elektrische impulsen mogelijk te maken, omdat de geleidingssnelheid van de zenuwvezels correleert met de axondiameter en myelinedikte1. Sensorische signalering van de periferie naar het centrale zenuwstelsel (CZS) is afhankelijk van de activering van sensorische neuronen van de eerste orde die zich bevinden in vergrotingen van de dorsale wortel, genaamd dorsale wortelganglia (DRG). Voor de vorming en het onderhoud van myeline is continue communicatie tussen a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Schwann celkweek
- Coating voor Schwann celkweek
- Bedek de celkweekschalen onder steriele omstandigheden. Breng 2 ml 0,01% poly-L-lysine (PLL) aan op twee weefselkweekschalen (TC) van 60 mm en incubeer een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de PLL, was de TC-vaat 2x met gedestilleerd water en incubeer met 2 ml 1 μg/cm2 laminine een nacht op 4 °C. Was de TC vaat 2x met aqua dest, en laat de borden aan de lucht drogen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Myelinisatie in de cocultuur werd beoordeeld op dag 10, 12, 14, 16, 18 en 20. De DRG-explantaten en Schwann-cellen werden gekleurd voor MBP, βIII-tubuline en DAPI. Het axonale netwerk in de cocultuur was dicht en veranderde niet zichtbaar in het tijdsverloop van de waarneming. De eerste tekenen van myeline, in de vorm van kleine fragmenten, waren detecteerbaar op dag 10 en namen toe op dag 12 (figuur 2). De MBP-positieve gebieden namen in de loop van de tijd toe tot dag 20 van cultuur. De my.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier presenteren we een snel en gemakkelijk protocol voor het genereren van in vitro myelinisatie door twee afzonderlijke celtypeculturen, Schwann-cellen en dorsale wortelganglionexplantaten, samen te voegen.
Een cruciale stap van het protocol is de teelt van DRG-explantaten, vooral in de eerste dagen van de teelt. DRG zijn zeer kwetsbaar voordat een sterk axonaal netwerk wordt gebouwd en moeten zeer voorzichtig worden behandeld, bijvoorbeeld wanneer ze uit de incubator worden gehaald.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Prof. Dr. Ralf Gold en PD Dr. Gisa Ellrichmann voor hun advies en steun.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, konijn | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ßIII-tubulin, muis | Biolegend, San Diego, USA | 657402 | |
| Ascorbinezuur | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | A4403-100MG | |
| B27-supplement | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 17504-044 | |
| Biosphere Filter Tip, 100 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland | 70760212 | |
| Biosphere Filter Tip, 1250 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland | 701186210 | |
| Biosphere Filter Tip, 20 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland | 701114210 | |
| Biosphere Filter Tip, 300 µL | Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland | 70765210 | |
| Bovine serum albumin | Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland | 8076.4 | |
| Celzevener, 100 µM | BD Bioscience, Heidelberg, Duitsland | 352360 | |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland | 5811000015 | |
| CO2 Incubator Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Duitsland | 51017865 | |
| Dekglasjes 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland | P231.1 | |
| Gebogene fijne pincetten | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Duitsland | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | 4942078001 | |
| Gedestilleerd water (Water Purification System) | Millipore, Molsheim, Frankrijk | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 31331093 | |
| DPBS (geen Ca2+ en geen Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | D8537-6X500ML | |
| Ethanol | VWR, Radnor, VS | 1009862500 | |
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | F7524 | FCS moet getest zijn voor Schwann cel cultuur |
| Fijne pincetten (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland | 11252-20 | |
| Pincetten | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | F6886-10MG | |
| Gelatine | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | G1393-20ML | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 5710064 | |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | A11036 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | A11001 | |
| HBSS (geen Ca2+ en geen Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 14170138 | |
| HERAcell Incubator | Heraeus Instruments, Hanau, Duitsland | 51017865 | |
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 51029882 | |
| Paarden serum | Pan-Biotech, Aidenbach, Duitsland | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, VS | ||
| Laminine | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | L2020-1MG | |
| Leibovitz´s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 11415064 | |
| L-Glutamine 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 25030024 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland | 130042303 | |
| Microschaar | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland | 15000-08 | |
| Microscoop | Motic, Wetzlar, Duitsland | Motic BA 400 | |
| Microscoop Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Duitsland | 491917-0001-000 | |
| Microscoopglas | VWR, Radnor, VS | 630-1985 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland | 130091632 | |
| MS kolommen | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland | 130-042-201 | |
| Neubauer telkamer | Assistant, Erlangen, Duitsland | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, VS | 100-03 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 21103049 | |
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | N1408 | |
| Normaal geitenserum | Biozol, Eching, Duitsland | S-1000 | |
| Nunclon Δ multidishes, 4 wel | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland | D6789 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics, New Jersey, VS | 10342243 | |
| Penicilline/Streptomycine | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Duits |
Referenties
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
