Dit is een eenvoudig protocol van een gerstbladschedetest met minimale reagentia en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur (inclusief een basissmartphone). Het doel is om het vroege infectieproces van blastziekte in laboratoria te visualiseren zonder toegang tot geavanceerde microscopieapparatuur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van vroege infectieplaatsen van rijstontploffingsziekte (Magnaporthe oryzae) op gerst (Hordeum vulgare) met behulp van een basismicroscoop en een smartphone
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Begrijpen hoe planten en ziekteverwekkers op elkaar inwerken, en of die interactie culmineert in afweer of ziekte, is nodig om sterkere en duurzamere strategieën voor de gezondheid van planten te ontwikkelen. Vooruitgang in methoden die plantenpathogene monsters effectiever in beeld brengen tijdens infectie en kolonisatie heeft hulpmiddelen opgeleverd zoals de rijstbladschedetest, die nuttig is geweest bij het monitoren van infecties en vroege kolonisatiegebeurtenissen tussen rijst en de schimmelpathogeen, Magnaporthe oryzae. Deze hemi-biotrofe ziekteverwekker veroorzaakt ernstig ziekteverlies in rijst en gerelateerde eenzaadlobbigen, waaronder gierst, rogge, gerst en meer recent tarwe. De bladschedetest levert, indien correct uitgevoerd, een optisch helder plantengedeelte op, meerdere lagen dik, waardoor onderzoekers live-cell beeldvorming kunnen uitvoeren tijdens een pathogeenaanval of vaste monsters kunnen genereren die zijn gekleurd voor specifieke kenmerken. Gedetailleerd cellulair onderzoek naar de gerst-M. oryzae interactie is achtergebleven bij die van de rijstgastheer, ondanks het groeiende belang van dit graan als voedselbron voor dieren en mensen en als gefermenteerde dranken. Hier wordt de ontwikkeling van een gerstebladschedetest gemeld voor ingewikkelde studies van M. oryzae-interacties tijdens de eerste 48 uur na inenting. De bladschedetest, ongeacht welke soort wordt bestudeerd, is delicaat; Er is een protocol dat alles omvat, van gerstgroeiomstandigheden en het verkrijgen van een bladschede, tot inenting, incubatie en beeldvorming van de ziekteverwekker op plantenbladeren. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd voor high-throughput screening met behulp van zoiets eenvoudigs als een smartphone voor beeldvormingsdoeleinden.
Inleiding
Magnaporthe oryzae, de rijststraalschimmel, infecteert een assortiment graangewassen, waaronder gerst, tarwe en rijst1. Deze ziekteverwekker veroorzaakt verwoestende ziekten en vormt een wereldwijde bedreiging voor deze waardevolle gewassen, waardoor het gewas volledig verloren gaat als het niet wordt gecontroleerd. Veel laboratoria over de hele wereld richten zich op rijstblastziekte vanwege de wereldwijde dreiging en de kenmerken ervan als een uitstekend model voor plant-schimmelinteracties2. Het is volledig gesequenced en de genetica van de infectieuze cyclus, met name de vroege gebeurtenissen, zijn vastgesteld 3,4. De levenscyclus begint met een spore die ontkiemt op een bladoppervlak en de gespecialiseerde penetratiestructuur vormt die het appressorium wordt genoemd. Het appressorium dringt het bladweefsel binnen en de infectie gaat verder met de ontwikkeling van laesies die het proces van sporulatie starten en ziekte verspreiden4. Het voorkomen van een van deze vroege gebeurtenissen zou deze verwoestende ziekte drastisch remmen. Daarom is het meeste huidige onderzoek naar blastziekte gericht op de vroege infectiestappen, van de gekiemde conidia die een appressorium vormen tot de ontwikkeling van de invasieve schimmeldraden en het biotrofe interfaciale complex (BIC)5.
De enorme hoeveelheid onderzoek naar blastziekte is uitgevoerd in rijst, hoewel M. oryzae een belangrijke ziekteverwekker is voor een verscheidenheid aan gewassen, en nieuw geëvolueerde stammen opkomen als een wereldwijde bedreiging voor tarwe6. Terwijl rijst een van de top drie basisgewassen is die worden gebruikt om de bevolking te voeden, samen met tarwe en maïs, is gerst de vierde graankorrel in termen van veevoer en bierproductie7. Naarmate de ambachtelijke bierindustrie groeit, groeit ook de economische waarde van gerst. Er zijn duidelijke voordelen van het gebruik van M. oryzae en gerst als een pathosysteem om blastziekte te bestuderen. Ten eerste zijn er stammen van M. oryzae die alleen gerst infecteren, evenals stammen die meerdere grassoorten kunnen infecteren. 4091-5-8 infecteert bijvoorbeeld voornamelijk alleen gerst, terwijl Guy11 en 70-15 zowel gerst als rijst8 kunnen infecteren. Deze stammen zijn genetisch vergelijkbaar en het infectieproces is vergelijkbaar9. Ten tweede is gerst onder standaard laboratorium- en kasomstandigheden gemakkelijker te kweken, omdat het niet de gecompliceerde vereisten van rijst heeft (beknopte temperatuurregeling, hoge luchtvochtigheid, specifieke lichtspectra). Er zijn ook beeldvormingsuitdagingen met rijst vanwege de hydrofobiciteit van het bladoppervlak, die gerst niet vertoont10.
Dit protocol presenteert een eenvoudige methode voor het isoleren en effectief gebruiken van gerstbladscheden voor microscopische analyse van meerdere infectiestadia, met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumbenodigdheden en een smartphone voor gegevensverzameling. Deze methode voor de gerstbladschedetest is aanpasbaar voor laboratoria over de hele wereld, omdat het minimale voorraden vereist en toch een duidelijk beeld geeft van de microscopische interactie tussen de ziekteverwekker en de eerste paar cellen die het infecteert. Terwijl pathogeniciteitstests, zoals een spray of druppelinenting, een macrobeeld kunnen geven van het vermogen van de ziekteverwekker om laesies te vormen, stelt deze test de onderzoeker in staat om specifieke stappen van vroege infectie te visualiseren, van pre-penetratiegebeurtenissen tot kolonisatie van epidermale cellen. Verder kunnen onderzoekers infectie met de wild-type schimmel gemakkelijk vergelijken met infectie met een mutant verminderd in virulentie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van experimenteel materiaal
- Bereid havermoutagar (OMA) door havermout te mengen tot het een fijn poeder is. Voeg 25 g havermoutpoeder en 15 g agar toe aan 500 ml ddH2O en autoclaaf op mediacyclus (als alternatief breng het 20 minuten aan de kook). Giet de media in steriele petrischaaltjes van 60 mm.
OPMERKING: Andere mediatypen die sporulatie induceren, zoals V8-agar, zijn acceptabel voor dit protocol. - Plaat M. oryzae filtert voorraden rechtstreeks op de OMA-platen met behulp van een steriele tang en laat ze de hele plaat bedekken (9-12 dagen). Plaats de platen in een groei-incubator bij 25 °C met 12:12 uur dag:nacht cycli om sporulatie te helpen induceren.
OPMERKING: Sommige mutanten groeien langzamer en hebben extra zorg nodig (bijv. eerst volledige media, dan een overdracht naar de OMA), en kunnen een extra week duren om voldoende conidia te produceren. - Plant gerst (Hordeum vulgare Lacey) zaden direct in een vochtig groeimedium (bijv. Grondloze potgrond) met 10-15 zaden per 6 inch pot. Plaats de potten in bakjes met 1-2 in water.
- Stel de omstandigheden van de gerstgroeikamer in op 22 °C gedurende 12 uur (daglicht) en 19 °C gedurende 12 uur (donker) bij 60% relatieve vochtigheid. Blijf water geven vanaf de bodem om de zaden niet te verstoren.
- Laat de gerst groeien tot het tweede bladstadium, ongeveer gedurende 14 dagen. Knip met een steriele schaar de gerstplant net boven de grondlijn. Snijd met een tang en een scheermes/scalpel voorzichtig de bladschede van het eerste blad dat in de lengterichting open is en verwijder deze met behulp van de tang van de basis van het tweede blad.
OPMERKING: Reinig de gereedschappen (tang, scalpel, enz.) voor gebruik met 75% -80% ethanol. De schede is de dunne opperhuidlaag die zorgt voor de aanhechting van het eerste naar het tweede blad (tweede tot derde blad, enz.; zie figuur 1). - Leg het eerste blad plat in een steriele petrischaal van 60 mm, met daarin een nat keukenpapier om de luchtvochtigheid in de plaat te behouden. Snijd met behulp van het scalpel het grootste deel van het eerste blad weg van de schede, waardoor slechts 0,5 in het bladweefsel overblijft voor montage.
- Plak het bladweefsel vast aan de onderkant van de petriplaat.
OPMERKING: De schede krult, maar dit is acceptabel omdat een gekrulde schede de conidiale druppel gemakkelijker vasthoudt. - Verzamel 9-12 dagen oude M. oryzae-platen en voeg 0,5-2 ml steriel water toe aan de platen. Schraap met behulp van een steriele inentingslus voorzichtig de mycelia om de aangehechte conidia vrij te maken. Pipetteer de conidiale suspensie voorzichtig in een microcentrifugebuis met een klein stukje kaasdoek om grote stukken mycelium uit de conidiale suspensie te filteren.
OPMERKING: Sporen kunnen al na 7 dagen worden verzameld, als groei en sporulatie voldoende zijn om de gewenste sporenconcentratie te bereiken. Verzameling kan niet langer dan 14 dagen worden uitgesteld als u werkt met een langzaam groeiende genetische mutant - De gewenste sporenconcentratie is 5 x 10 4 sporen per ml, maar een bereik (1 x 10 4-1 x 10 5) is acceptabel. Een te hoge concentratie maakt het in beeld brengen van individuele infectieplaatsen een uitdaging; verdun de sporenconcentratie indien nodig met steriel water.
- Pipetteer voorzichtig de conidiale suspensie in de opgerolde bladschede. Begin met 25 μL (de druppelgrootte kan worden vergroot afhankelijk van de grootte van de schede, tot 50 μL).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om drie tot vijf replicaties van elke gemuteerde stam of gerstlijn uit te voeren. Het is gebruikelijk dat er schade optreedt tijdens het kleuringsproces, daarom worden extra schedereplicaties aanbevolen. - Vul vier of vijf bekers van 500 ml met ddH2O en verwarm tot het stomen is (met behulp van een magnetron of kookplaat). Wees voorzichtig bij het verplaatsen van de heetwaterbekers. Houd het deksel van de petrischaal boven een van de dampende bekers om vocht in de plaat op te vangen.
- Stapel de geïnfecteerde bladschedeplaten en omring ze met de resterende hete bekers. Dit creëert een vochtige, vochtige omgeving, die nodig is om de sporen te laten ontkiemen.
OPMERKING: Wees voorzichtig bij het stomen van de deksels om ervoor te zorgen dat er geen heet water of stoom de omhulsels raakt. - Bescherm de bladmantels tegen licht, dek af met een effen gekleurde (zwarte voorkeur) rubberen of plastic doos en laat 48 uur zitten of het gewenste tijdstip voor beeldvorming.
OPMERKING: Een kartonnen doos is niet geschikt omdat deze het vocht/vocht niet vasthoudt en de stoom uit de heetwaterbekers absorbeert. Een afsluitende, plastic kuip werkt goed voor het vasthouden van de vochtigheid en kan worden bedekt met zwarte stof of een grotere donkere container om het licht te blokkeren.
2. Kleuringsproces
- Bereid de vlek als volgt voor: bereid een verse verdunning van 45% azijnzuur en voeg 0,1% v/v trypan blauw toe. Aliquot 1 ml van de kleurstofoplossing in microcentrifugebuizen. Stel een warmteblok of waterbad in op 40 °C.
- Knip voorzichtig, met behulp van een scheermes of scalpel, de bladschede weg van de tape. Plaats de schede met een tang in de microcentrifugebuis en zorg ervoor dat deze volledig wordt ondergedompeld in de kleurstofoplossing. Laat 2 uur de kleurstof in het blad dringen. Verwarm de monsters op 40 °C tijdens het kleuringsproces in een warmteblok of waterbad om de penetratie van de kleurstof te vergroten.
OPMERKING: De omhulsels proberen te drijven in de microcentrifugebuis; Om onbevlekte zakken bladweefsel te voorkomen, vult u de buizen, dompelt u de omhulsels onder en sluit u de buis. Plaats niet meerdere omhulsels in dezelfde microcentrifugebuis. - Spoel de bladmantels voorzichtig af in 60% glycerol om de extra kleurstof te verwijderen. Drie spoelingen (elk in verse glycerol) zijn over het algemeen voldoende. Houd de schede in glycerol totdat u klaar bent om op dia's te monteren.
3. Montage- en beeldvormingsproces
- Leg de schede op een schone glazen plaat en voeg een paar druppels 60% glycerol toe. Gebruik een ontleedmicroscoop en twee paar tangen om de schede voorzichtig uit te rollen, waarbij het geënte midden naar boven gericht blijft. Houd de schede open met de tang en plaats de dekplaat bovenop om te voorkomen dat de schede krult en de infectieplaats blokkeert.
OPMERKING: De bladmantel is erg kwetsbaar en deze stappen moeten met zorg worden uitgevoerd om schade aan de schede te voorkomen. - Verzegel de coverslip met nagellak voor langdurige opslag of tape voor opslag op korte termijn. Observeer de dia's onder een samengestelde lichtmicroscoop.
- Maak basisfoto's met een microscoop en een mobiele telefoon. Hier zijn beelden gemaakt met een gsm-adapterhouder en een smartphone. Voor Android-apparaten past u de cameratoepassing aan de volgende instellingen aan: flitsen uit, Top Shot uitschakelen, automatische aanpassing van helderheid en schaduwen uitschakelen en de fotoresolutie op volledig instellen.
OPMERKING: Het gebruik van de camera-applicatie op de telefoon vermindert de levensduur van de batterij sneller dan normaal, dus het is aan te raden om externe voeding te hebben. - Zodra de mobiele telefoon op de microscoop is gemonteerd, maakt u een afbeelding van een schaalmicrometer met het doel dat zal worden gebruikt om de gegevens te verkrijgen. De gegevens in deze studie werden verkregen bij een 40x 0,65 NA-luchtobjectief en de telefoonadapter was gemonteerd op een 10x oculair. Pas de zoom van de telefoon aan tot 2,5x en houd deze consistent om een constante pixelgrootte te behouden.
- Het midden van de schede herbergt de grootste concentratie sporen en infecterende appressoria; Streef daarom naar 9-12 afbeeldingen van elke schede om significante aantallen te verkrijgen voor statistische analyse. Het aantal sporen en appressoria varieert op basis van de concentratie van de toegepaste sporen.
4. Beeldbeoordeling en tellen met behulp van ImageJ (FIJI)
- Breng de afbeeldingen over naar een computer waarop ImageJ (FIJI) wordt uitgevoerd. Als u de afbeeldingen wilt openen, sleept u de bestanden naar de ImageJ-balk.
- Stel de schaal van de afbeeldingen in door de afbeelding van de podiummicrometer te laden en een rechte lijn te tekenen tussen twee markeringen voor de schaal. Open Set Scale, typ de bekende afstand voor de gemeten lijn en typ de eenheid voor de schaal. Op de micrometer was in dit voorbeeld de kleinste lijn 10 μm. Vink het vakje Globaal instellen aan en druk op OK. Alle volgende afbeeldingen die worden geladen, hebben dezelfde schaal.
- Als u appressoria, sporen of andere objecten wilt tellen, selecteert u het gereedschap Punt . Open vervolgens de ROI Manager. Klik op de T-toets op het toetsenbord om punten aan de lijst toe te voegen. Deze interessante regio's kunnen indien nodig worden opgeslagen en opnieuw worden geladen op dezelfde afbeelding.
- Afhankelijk van de experimentele doelen, voert u aanvullende metingen uit, zoals sporenlengte, appressoria-grootte en kiembuislengte.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een weergave van de initiële workflow voor deze techniek wordt weergegeven in figuur 1. De omhulsels werden geoogst van 14 dagen oude vatbare "Lacey" gerstplanten (H. vulgare). De conidia werden geoogst van 10 dagen oude sporende M. oryzae OMA-platen, met een conidiale suspensie bereid met steriele ddH2O voor een eindconcentratie van 5 x 104 sporen per ml. De entsuspensie werd direct aangebracht op de bladmantels, die werden bevestigd aan steriele petr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn veel veelgebruikte assays beschikbaar om M. oryzae-stammen te testen die een macroscopisch beeld geven van een compatibele of incompatibele infectierespons, zoals spray- of druppelinentingen, en het gebruik van beoordelingssystemen om laesiegroottes13,14 te kwantificeren. Een andere veel voorkomende test voor M. oryzae is het testen van het vermogen van de ziekteverwekker om zijn gespecialiseerde penetratiestructuur, het apppressorium
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen financiering van de USDA-NIFA award 2016-67013-24816.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Azijnzuur | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Mobiele telefoon | Pixel 4A | Elke smartphone met een camera aan de achterkant die in een houder kan worden gemonteerd, is voldoende. | |
| Microscoopadapter voor mobiele telefoon | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscoop | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinoculaire rechtopstaande epi-fluorescentiemicroscoop |
| Oude mode havermout | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rechthoekige dekglas | Corning | CLS2975245 | |
| Microscoopglaasjes | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Micrometer voor het microscoop | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm en 0.01 mm Microscope kalibratieplaatje |
| Trypanblauw | Sigma-Aldrich | T6146 |
Referenties
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996(2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84(2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
