Methodenartikel

Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden

DOI:

10.3791/64804

⸱

2 juni 2023

 ,  ,  , 
1Division of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 2Division of Pediatric Surgery, UPMC Children’s Hospital of Pittsburgh, 3Department of Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een protocol dat de isolatie van murine coloncrypten beschrijft voor de ontwikkeling van 3-dimensionale colonoïden. De gevestigde colonoïden kunnen vervolgens terminaal worden gedifferentieerd om de cellulaire samenstelling van het gastheerepitheel weer te geven voordat ze een ontstekingsuitdaging krijgen of worden gericht op het vaststellen van een epitheliale monolaag.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het darmepitheel speelt een essentiële rol in de menselijke gezondheid en vormt een barrière tussen de gastheer en de externe omgeving. Deze zeer dynamische cellaag vormt de eerste verdedigingslinie tussen microbiële en immuunpopulaties en helpt de intestinale immuunrespons te moduleren. Verstoring van de epitheliale barrière is een kenmerk van inflammatoire darmziekte (IBD) en is van belang voor therapeutische targeting. Het 3-dimensionale colonoïde cultuursysteem is een uiterst nuttig in vitro model voor het bestuderen van intestinale stamceldynamica en epitheelcelfysiologie in IBD-pathogenese. Idealiter zou het vestigen van colonoïden uit het ontstoken epitheelweefsel van dieren het meest gunstig zijn bij het beoordelen van de genetische en moleculaire invloeden op ziekten. We hebben echter aangetoond dat in vivo epitheliale veranderingen niet noodzakelijkerwijs worden behouden in colonoïden die zijn vastgesteld bij muizen met acute ontsteking. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een protocol ontwikkeld om colonoïden te behandelen met een cocktail van ontstekingsmediatoren die meestal verhoogd zijn tijdens IBD. Hoewel dit systeem alomtegenwoordig kan worden toegepast op verschillende kweekomstandigheden, benadrukt dit protocol de behandeling van zowel gedifferentieerde colonoïden als 2-dimensionale monolagen afgeleid van gevestigde colonoïden. In een traditionele kweekomgeving worden colonoïden verrijkt met darmstamcellen, wat een ideale omgeving biedt om de stamcelniche te bestuderen. Dit systeem laat echter geen analyse toe van de kenmerken van de darmfysiologie, zoals de barrièrefunctie. Verder bieden traditionele colonoïden niet de mogelijkheid om de cellulaire respons van terminaal gedifferentieerde epitheelcellen op pro-inflammatoire stimuli te bestuderen. De hier gepresenteerde methoden bieden een alternatief experimenteel kader om deze beperkingen aan te pakken. Het 2-dimensionale monolaagse kweeksysteem biedt ook de mogelijkheid voor therapeutische geneesmiddelenscreening ex vivo. Deze gepolariseerde laag cellen kan worden behandeld met ontstekingsmediatoren aan de basale kant van de cel en gelijktijdig met vermeende therapieën apisch om hun nut bij IBD-behandeling te bepalen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inflammatoire darmziekte (IBD) is een chronische, remitterende en recidiverende ziekte die wordt gekenmerkt door episodes van ontsteking en klinische rust. De etiologie van IBD is multifactorieel, maar belangrijke kenmerkende kenmerken van de ziekte zijn een defecte barrièrefunctie en verhoogde permeabiliteit van het darmepitheel, naast pro-inflammatoire signaalcascades geactiveerd in het epitheelcompartiment 1,2. Verschillende in vitro en in vivo modellen zijn gebruikt om de epitheliale respons tijdens IBD samen te vatten, waaronder celkweek en muizenmodellen van ontsteking3. Al deze systemen hebben echter belangrijke tekortkomingen die hun vermogen beperken om de epitheliale veranderingen tijdens IBD4 samen te vatten. De meeste cellijnen die worden gebruikt om IBD te bestuderen, zijn getransformeerd, hebben het vermogen om een monolaag te vormen en kunnen3 onderscheiden, maar zich intrinsiek anders voortplanten dan niet-getransformeerde darmepitheelcellen in de gastheer. Verschillende muizenmodellen van ontsteking worden gebruikt om IBD te bestuderen, waarvan sommige knock-outmodellen, infectieuze modellen, chemische ontstekingsmodellen en T-celoverdrachtsmodellen 5,6,7,8 omvatten. Hoewel elk bepaalde etiologische aspecten van IBD kan bestuderen, zoals genetische aanleg, barrièredisfunctie, immuunderegulatie en het microbioom, zijn ze beperkt in hun vermogen om de multifactoriële aard van de ziekte te bestuderen.

Intestinale organoïden, waaronder enteroïden en colonoïden, zijn het afgelopen decennium vastgesteld als een nuttig in vitro model voor het bestuderen van niet alleen de dynamiek van intestinale stamcellen, maar ook hun rol de barrière-integriteit en functie van het darmepitheel spelen in intestinale homeostase en ziekte. Deze entiteiten hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van de pathogenese van IBD9 en hebben nieuwe mogelijkheden geopend voor gepersonaliseerde geneeskunde. Colonoïden, of stamcel-afgeleide, zelforganiserende weefselculturen uit de dikke darm, zijn ontwikkeld uit zowel murine als menselijk weefsel in een proces dat stamcellen in darmcrypten in staat stelt zich te verspreiden en voor onbepaalde tijd te worden onderhouden10. De stamcelniche in vivo is afhankelijk van extracellulaire factoren om de groei ervan te ondersteunen, met name de canonieke Wnt-signalering en botmorfogene eiwitsignaleringsroutes11. De toevoeging van deze factoren bevordert de gezondheid en levensduur van colonoïden, maar drijft de cultuur ook naar een stamcelachtige toestand die geen weerspiegeling is van de in vivo epitheliale cellulaire architectuur, die bestaat uit zowel zelfvernieuwende als terminaal gedifferentieerde cellen12,13. Hoewel de functionaliteit van het darmepitheel afhankelijk is van de voortdurende overspraak tussen het stamcelcompartiment en gedifferentieerde cellen, is het vermogen om beide in een colonoïde kweeksysteem te hebben vrij beperkt. Ondanks deze beperkingen blijft het organoïde cultuursysteem de gouden standaard om de intrinsieke eigenschappen van het epitheel ex vivo te bestuderen. Niettemin moeten alternatieve cultuurstrategieën mogelijk worden overwogen om de wetenschappelijke vraag te beantwoorden.

Het is aangetoond dat muizen op een continu 7-daags regime van dextransonnatriumsulfaat (DSS) zowel epitheliale ontsteking als barrièredisfunctie ontwikkelen14. Bovendien zijn mitochondriaal biogenesefalen en metabole herprogrammering binnen het darmepitheel, waarvan is aangetoond dat ze duidelijk zijn bij menselijke IBD, ook vastgelegd in dit DSS-model van colitis15. Onze voorlopige gegevens tonen echter aan dat de kenmerken van mitochondriaal biogenesefalen niet behouden blijven in colonoïden die zijn afgeleid van de crypten van met DSS behandelde dieren (aanvullende figuur 1). Daarom moeten alternatieve kweekmethoden worden gebruikt bij het onderzoeken hoe ontsteking epitheliale veranderingen veroorzaakt tijdens muriene darmontsteking. Hier schetsen we een protocol dat we hebben ontwikkeld dat beschrijft 1) hoe crypten te isoleren van heel colonweefsel voor de oprichting van muriene colonoïden, 2) hoe deze celpopulatie terminaal te differentiëren om de celpopulatie weer te geven zoals deze in vivo staat, en 3) hoe ontsteking te induceren in dit in vitro model. Om geneesmiddelinteracties binnen het ontstoken epitheel te bestuderen, hebben we een protocol ontwikkeld om 2-dimensonale (2D) monolagen van murine colonoïden vast te stellen die basaal kunnen worden behandeld met ontstekingsmediatoren en apisch kunnen worden behandeld met medicamenteuze therapieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten met muizenweefsels die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Pittsburgh en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Research and Care Committee van de University of Pittsburgh en UPMC.

1. Voorbereiding op cultuur

OPMERKING: Alle reagentia zijn opgenomen in de sectie Materiaaltabel en alle samenstellingen van de oplossing zijn te vinden in de tabel met de samenstelling van de oplossing (tabel 1).

  1. Bereid het wasmedium voor muizen zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 2 maanden.
  2. Bereid crypte-isolatiebuffer 1 (CIB1) voor zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 2 maanden.
    LET OP: Dithiothreitol (DTT) wordt door de OSHA Hazard Communication Standard als gevaarlijk beschouwd vanwege de potentiële acute toxiciteit bij inname en huid- en oogbeschadiging als die gebieden eraan worden blootgesteld. Beschermende handschoenen, oogbescherming en gezichtsbescherming moeten worden gebruikt bij het hanteren van deze chemische stof.
  3. Bereid cryptisolatiebuffer 2 (CIB2) voor zoals beschreven in tabel 1. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 2 maanden.
  4. Bereid L-WRN-geconditioneerd medium volgens een eerder gepubliceerd protocol16.
  5. Bereid volledig colonoïde medium zoals beschreven in tabel 1. Compleet colonoïde groeimedium kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.
  6. Bereid het differentiatiemedium voor zoals beschreven in tabel 1. Dit protocol is aangepast ten opzichte van een eerder gepubliceerd artikel17. Het differentiatiemedium kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.
  7. Bereid het ontstekingsmediatormedium voor zoals beschreven in tabel 1. Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerd artikel18. Het ontstekingsmediatormedium kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.
  8. Bereid het murine monolayer medium voor. Laat Y-27632 weg bij het uitdagen van de monolagen met ontstekingsfactoren en/of geneesmiddel(en). Het murine monolayer medium kan tot 5 dagen bewaard worden bij 4°C zonder verlies van activiteit.
  9. Bereid het monolaagse medium van de ontstekingsmediator voor. Het monolaagse medium van de ontstekingsmediator kan tot 5 dagen bij 4°C worden bewaard zonder verlies van activiteit.

2. Crypte isolatie van murine colonweefsel

OPMERKING: Breng het weefsel over op ijs. Haal de juiste hoeveelheid keldermembraanmatrix uit de opslag van −20 °C en ontdooi op ijs. Elke 24-put is verguld met 15 μL keldermembraanmatrix. Bereid CIB1, CIB2 en volledig colonoïde groeimedium voor zoals beschreven in rubriek 1.

  1. Euthanaseer een C57BL / 6J-muis (6-8 weken oud) volgens het door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde protocol en extraheer het distale uiteinde (ongeveer 5-7 cm) van de dikke darm met een schoon pincet en een schaar.
    OPMERKING: In deze studie werden de proefpersonen geëuthanaseerd met behulp van koolstofdioxidekamerincubatie gedurende 2-3 minuten gevolgd door cervicale dislocatie.
    1. Plaats hiervoor de muis op zijn rug, maak een horizontale incisie net onder de ribbenkast en vervolgens een verticale incisie vanuit het midden van de horizontale incisie naar de basis van de staart om de buikholte bloot te leggen.
    2. Beweeg met een pincet de dunne darm uit het veld, identificeer de dikke darm en volg deze tot aan de basis van de staart. Breek het bekken met een schaar om de distale dikke darm indien nodig volledig bloot te leggen. Gebruik de schaar om de meest distale 5-7 cm van de dikke darm te knippen.
  2. Plaats het darmweefsel op een schoon oppervlak. Verwijder het overtollige serosaalvet dat de dikke darm omringt. Verwijder de fecale materie door de luminale inhoud van de dikke darm te spoelen met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met behulp van een spuit bevestigd aan een 18 G 1 1/2 naald. Plaats vervolgens de dikke darm in een conische buis van 50 ml met 10 ml ijskoude DPBS en plaats deze op ijs.
    OPMERKING: Als u de dikke darm van meer dan één dier isoleert, plaatst u het weefsel op ijs voordat u doorgaat naar het volgende dier.
  3. Breng het darmweefsel over in een petrischaal met 10 ml ijskoude DPBS en irrigeer het lumen tweemaal met DPBS met behulp van een P1.000-pipet.
  4. Open de dikke darm in de lengterichting met een schaar en schud voorzichtig met een pincet gedurende ~ 30 s in de DPBS om de resterende fecale inhoud te verwijderen.
  5. Breng het weefsel over in een nieuwe petrischaal met 10 ml ijskoude DPBS en schud opnieuw voorzichtig met een pincet voordat u de dikke darm in stukken van 2 cm snijdt met een schaar en deze in een conische buis van 50 ml plaatst met 7 ml ijskoude CIB1. Incubeer het weefsel in CIB1 op ijs gedurende 20 minuten.
    OPMERKING: De overige stappen worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
  6. Breng het weefsel met een pincet over in een voorverwarmde conische buis van 50 ml met 7 ml CIB2 en incubeer gedurende 5 minuten in een waterbad bij 37 °C.
  7. Verwijder de CIB2 uit de 50 ml conische buis door het weefsel op de bodem van de conische buis te laten bezinken en vervolgens de CIB2 af te pipetteren. Voeg vervolgens 10 ml ijskoud wasmedium voor muizen toe aan dezelfde conische buis.
  8. Verkrijg een nieuwe conische buis van 50 ml en plaats een filter van 70 μm bovenop de open buis.
  9. Terwijl u de buis met de inhoud van de dikke darm vasthoudt, draait u de hand ongeveer 45°. Schud de buis op een schommelende en krachtige manier gedurende 45 s om de crypten vrij te geven. Giet vervolgens de cryptuspensie door de 70 μm celzeef in een nieuwe conische buis van 50 ml.
  10. Plaats met een pincet het darmweefsel terug in de lege conische buis van 50 ml en voeg 10 ml ijskoud wasmedium toe. Verkrijg een nieuwe 70 μm celzeef en plaats deze op de conische buis van 50 ml met de vorige gefilterde oplossing.
  11. Nogmaals, pak de buis van 50 ml met de cryptefragmenten en schud deze op dezelfde manier als in stap 2.9. Filter het medium door de 70 μm celzeef in de 50 ml conische buis om te combineren met de eerder gefilterde crypten.
    OPMERKING: Als de crypteopbrengst laag is, schud het darmweefsel dan een extra keer door het weefsel in een lege conische buis van 50 ml met 10 ml muiswasmedium te plaatsen. Schud het weefsel gedurende 45-50 s om de crypten vrij te geven. Als de opbrengst van de crypte laag is, verhoog dan de kracht van het schudden. Ten slotte, als de totale crypteopbrengst laag is, kunnen zowel de pipetten als de buizen worden bedekt met foetaal runderserum (FBS) om de hechting van het weefsel aan het plastic te voorkomen.
  12. Centrifugeer de 50 ml conische buis met de gefilterde crypten op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Een pellet moet worden waargenomen aan de onderkant van de 50 ml conische buis.
  13. Decanteer het medium door pipetteren, resuspensie van de crypten door op en neer te pipetteren met 10 ml ijskoud muizenwasmedium en breng het over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4°C.
  14. Om een schonere bereiding te verkrijgen, wast u de crypten met een extra 10 ml muizenwasmiddel. Decanteer het vorige medium en resuspensie van de crypten door op en neer te pipetteren in 10 ml wasmedium voor muizen. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4°C met behulp van een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Voorzichtigheid is geboden bij het pipetteren van het medium, omdat de pellet soms niet strak wordt gecentrifugeerd. Als de pellet niet strak is, pipetteer dan het grootste deel van het medium, waardoor 500 μL tot 1 ml overblijft. Breng vervolgens de pellet terug door te pipetteren in 10 ml wasmedium voor muizen en breng de oplossing over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeren in een kleinere conische buis kan de dichtheid van de pellet verbeteren.
  15. Decanteer het medium en resuspenseer de crypten door op en neer te pipetteren met 10 ml ijskoud wasmedium voor muizen. Eenmaal geresuspeerd, tel de crypten onder een helderveldmicroscoop door onmiddellijk 10 μL van het medium op een glasplaat te pipetteren.
    1. Plaats twee druppels van 10 μL op afzonderlijke uiteinden van de dia en tel het aantal crypten in elke druppel. Gemiddelde van de getallen tussen de twee druppels om het aantal crypten per 10 μL te bepalen. Vermenigvuldig dit aantal met 100 om het aantal crypten in 1 ml te krijgen.
      OPMERKING: Voor een nauwkeurige telling moet 10 μL van de cryptensuspensie onmiddellijk na resuspensie worden verwijderd. Zo niet, dan vallen de crypten op de bodem van de buis, wat resulteert in een onnauwkeurige telling.
  16. Met als doel om 300-500 crypten per put te platen, brengt u het juiste volume crypten geresuspendeerd in het wasmedium van de muis over naar een nieuwe conische buis van 15 ml en brengt u deze op 10 ml met ijskoud muiswasmedium. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4°C. Een kleine pellet moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis.
  17. Verwijder het supernatant met een powerpipet. Gebruik een P200-pipet om voorzichtig restmedium te verwijderen, waardoor alleen de pellet overblijft.
  18. Resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid ijskoude keldermembraanmatrix door langzaam op en neer te pipetteren. Zorg ervoor dat u geen bubbels introduceert bij het opnieuw ophangen van de cryptekorrel. Plaat 300-500 crypten/15 μL keldermembraanmatrix in elke put van een plaat. Keer na het plateren de weefselkweekplaat om en plaats deze gedurende 10-20 minuten in een incubator van 37 °C.
  19. Draai de plaat terug en voeg 500 μL van het volledige muiscolonoïde medium toe aan elke put. Verander het medium om de dag totdat ze klaar zijn om te passeren. Passeer de colonoïden om de 3-5 dagen.

3. Het passeren van de colonoïden

OPMERKING: Elke put kan over het algemeen 1:4 tot 1:6 worden gepasseerd, afhankelijk van de dichtheid van de oorspronkelijke put. Neem de juiste hoeveelheid keldermembraanmatrix uit −20°C en plaats deze op ijs om te ontdooien. Colonoïden kunnen na twee passages worden gebruikt voor experimenten. Bij het passeren van colonoïden worden de stappen uitgevoerd in een biologische veiligheidskast om besmetting te voorkomen.

  1. Verwijder het medium uit de te passeren putten.
    1. Als er puin in de keldermembraanmatrix zit, wat kan gebeuren tijdens de eerste isolatie, kan het volgende protocol worden gebruikt om het puin op te ruimen:
      1. Voeg 1 ml ijskoude 0,1% runderserumalbumine (BSA) in DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+ toe aan elk putje. Laat het 5 minuten staan in de biologische veiligheidskast.
      2. Pipetteer drie tot zeven keer op en neer met behulp van een P1000-pipet om de keldermembraanmatrix te verstoren en verzamel de inhoud van de putten in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de colonoïden in een totaal van 5-10 ml 0,1% BSA in DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+. Vul aan tot het juiste volume met 0,1% BSA.
      3. Centrifugeer op 150 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de colonoïden te pelleteren, maar niet het puin.
      4. Decanteer de DPBS door pipetteren, waardoor de pellet achterblijft. Voeg 1 ml enzymatisch dissociatiereagens op kamertemperatuur (RT) toe en pipetteer drie tot vijf keer.
      5. Plaats de 15 ml conische buis met het enzymatische dissociatiereagens en verstoorde colonoïden gedurende 3-4 minuten in een waterbad van 37 °C.
      6. Verwijder de buis uit het waterbad, pipetteer 3-5 keer en breng vervolgens op 10 ml met muiswasmedium. Ga verder met stap 3.6.
  2. Plaats 500 μL RT enzymatisch dissociatiereagens in elk putje en laat het ongeveer 1 minuut zitten voordat het drie tot zeven keer op en neer pipeteert om de keldermembraanmatrix te verstoren.
  3. Plaats de plaat in een incubator van 37°C gedurende 3-4 minuten.
  4. Verwijder de plaat uit de couveuse en pipetteer drie tot zeven keer op en neer met behulp van een P1000-pipet om de colonoïden te dissociëren.
  5. Breng de inhoud over in een conische buis van 15 ml en vul aan tot 10 ml met ijskoud wasmedium voor muizen.
  6. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 4°C op 300 x g .
  7. Verwijder het medium indien nodig met behulp van een powerpipet en een P200-pipet, zodat er alleen een pellet overblijft in de conische buis.
  8. Resuspendeer in een geschikte hoeveelheid ijskoude keldermembraanmatrix door voorzichtig op en neer te pipetteren volgens het aantal putten dat moet worden verguld. Introduceer geen bubbels bij het pipetteren. Plaats de colonoïde fragmenten in 15 μL keldermembraanmatrixdruppels per put.
  9. Plaats de crypten, keer de weefselkweekplaat om en plaats de plaat vervolgens gedurende 10-20 minuten in een incubator van 37 °C.
  10. Draai ten slotte de plaat om en voeg 500 μL volledig muiscolonoïde medium toe aan elke put. Verander het medium om de dag totdat ze groot genoeg zijn geworden om binnen ongeveer 3-5 dagen opnieuw te worden doorgelaten.

4. Terminaal differentiëren van de colonoïde cellen

  1. Passeer de colonoïden zoals hierboven en voeg 500 μL van het volledige muiscolonoïde medium toe aan elke put.
  2. Verwijder ten minste 48 uur na het passeren het volledige colonoïde medium van de muis en voeg 500 μL van het differentiërende medium toe aan elke put (zie rubriek 1).
  3. Incubeer de colonoïden met differentiatiemedia gedurende 48 uur, waarna ze kunnen worden gebruikt in experimenten, waaronder het verzamelen van RNA en eiwit.
    OPMERKING: Colonoïden kunnen worden beoordeeld voor differentiatie door RNA te verzamelen en de expressie van Lgr5 en Ki67, respectievelijk een stamcelmarker en celproliferatiemarker, te beoordelen via kwantitatieve reverse transcriptase-polymerasekettingreactie (qPCR). Terminaal gedifferentieerde cellen moeten een relatief lage expressie van Lgr5 en Ki67 hebben in vergelijking met colonoïden gekweekt in traditioneel colonoïde medium, waar de cellen meer stamachtig zijn. De tijdsduur die de colonoïden nodig hebben om in het differentiatiemedium te incuberen, moet mogelijk voor elk individueel laboratorium worden geoptimaliseerd. Zie aanvullende tabel 1 voor de lijst van primers.

5. Het induceren van ontsteking in gedifferentieerde colonoïden met ontstekingsmediatoren

  1. Nadat de colonoïden gedurende 2-3 dagen zijn geïncubeerd met het differentiatiemedium, verwijdert u het bestaande medium en voegt u 500 μL van het ontstekingsmediatormedium toe aan elk putje.
  2. Laat de putjes 24-72 uur incuberen voordat u het RNA en eiwit verzamelt (of andere stroomafwaartse parameters beoordeelt). Verander het medium elke dag.

6. Intestinale epitheliale monolagen afgeleid van gevestigde murine colonoïden

OPMERKING: Murine intestinale epitheliale monolagen zijn afgeleid van murine colonoïden die minimaal twee keer zijn gepasseerd. Om een succesvolle monolaagvorming in 3-5 dagen mogelijk te maken, is het noodzakelijk om de colonoïden niet in afzonderlijke cellen te scheiden. Gefragmenteerde organoïden die enzymatisch zijn gedissocieerd in cellulaire clusters zijn ideaal voor groei.

  1. Bereid alle reagentia voor voordat u met het experiment begint. Ontdooi de keldermembraanmatrix op ijs. Bereid het muizenmonolaagmedium voor zoals beschreven in rubriek 1 . Verdun het ontdooide keldermembraan 1:20 met het koude murine monolayer medium. Blijf op ijs.
  2. Gebruik een steriele tang om een transparante celkweekinzet van 0,4 μm in een enkele put van een 24-well weefselkweekplaat te plaatsen (Table of Materials). Pak een hoekpin van het inzetstuk en breng het over in de put. Herhaal dit totdat het juiste aantal celkweekinzetstukken beschikbaar is voor kweek.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u een extra controleput alleen met de keldermembraanmatrix bedekt. Deze celkweekinzet zal worden gebruikt om de achtergrondweerstand van de celkweekinzet zonder aanwezige cellen te meten, zoals beschreven in de volgende stap (stap 6.3).
  3. Bedek met behulp van een P200-pipet het apicale (bovenste) oppervlak van elke celkweekinzet met 150 μL verdunde keldermembraanmatrix. Plaats de pipetpunt in het midden van de insert zonder het membraan van de insert aan te raken en verwijder de oplossing voorzichtig. Plaats de plaat in een steriele 37°C incubator met 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur.
  4. Verwijder de keldermembraanmatrix voorzichtig voor gebruik en laat de celkweekinzetstukken minimaal 10 minuten drogen in een biologische veiligheidskast.
    1. Om de keldermembraanmatrix te verwijderen, draait u de 24-putplaat in een hoek van 45°. Plaats een enkele vinger op de hoek van de pin om de insert te stabiliseren en plaats met behulp van een P200-pipet voorzichtig de pipetpunt langs de onderkant van de insert en verwijder de matrix.
    2. Verwijder overtollige resten door elke celkweekinzet te wassen met 150 μL steriele DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+.
  5. Voeg na 10 minuten drogen 400 μL van het murine monolayer medium toe aan de onderkant van de celkweekinzet en 75 μL bovenop. Herhaal dit totdat alle celkweekinzetstukken zijn ondergedompeld. Laat de plaat in de biologische veiligheidskast of plaats hem terug in de couveuse totdat deze nodig is.
  6. Verwijder de 24-well plaat van volwassen (organoïden op dag 3-5 van de groei) darm colonoïden uit de 37 ° C, 5% CO2 incubator, en plaats het onder de biologische veiligheidskast. Verwijder het medium met steriele tips en was elk goed met 1 ml RT steriele DPBS (zonder Ca 2+ of Mg2+).
    OPMERKING: Een individuele put van 75-125 volwassen colonoïden wordt gesplitst in een verhouding van 1: 4.
  7. Verwijder de DPBS zonder Ca 2+ of Mg2+ met behulp van steriele tips en verteer elke plug van de keldermembraanmatrix door 500 μL RT enzymatisch dissociatiereagens in elk te passeren put te plaatsen.
  8. Pipetteer elk putje ongeveer 6-10 keer op en neer om de plug te breken. Kras niet op de onderkant van de plaat om de plug te verwijderen. Draai in plaats daarvan de 24-putplaat in een hoek van 45°, plaats de punt van de pipet aan de rand van de plug en maak deze voorzichtig los.
  9. Plaats de 24-well plaat terug in een steriele 37°C, 5% CO2 incubator gedurende 3-4 min.
  10. Verwijder de plaat en pipetteer het enzymatische dissociatiereagens vijf tot zeven keer op en neer voor elke put onder een biologische veiligheidskast. Breng de gedissocieerde colonoïden van elke put over in een steriele, 15 ml conische buis. Breng tot een volume van 10 ml met ijskoud wasmedium voor muizen.
  11. Centrifugeer de gedeeltelijk verteerde colonoïden bij 300 x g bij 4°C gedurende 5 minuten in een draaiende emmercentrifuge.
  12. Verwijder onder de biologische veiligheidskast het supernatant uit de pellet met behulp van een pipet van 10 ml. Verwijder het resterende medium met een P200-pipet. Resuspendie van de colonoïde pellet in murine monolayer medium. Voeg 75 μL medium toe per celkweekinzet van gefragmenteerde colonoïden die moeten worden verguld.
  13. Voeg 75 μL colonoïde suspensie toe aan het midden van elke celkweekinzet. Voordat u de colonoïde suspensie aan elke put toevoegt, pipet u voorzichtig een of twee keer op en neer voordat u de 75 μL verwijdert, wat een meer uniforme beplating mogelijk maakt.
  14. Plaats de 24-putplaat met celkweekinzetstukken gedurende 10 minuten op een roterend platform om een uniforme verspreiding over de celkweekinzet mogelijk te maken.
  15. Plaats de plaat in een steriele 37°C, 5% CO2 incubator.
  16. Maak de volgende dag (dag 1) de onaangetaste colonoïdefragmenten los door het medium drie tot vijf keer op en neer te pipetteren met een P200-pipet. Plaats de punt voorzichtig langs de binnenkant van de celkweekinzet om de aangehechte darmcellen niet te verstoren. Breng geen bubbels in het medium, omdat dit voorkomt dat alle niet-vastgemaakte fragmenten worden verwijderd.
  17. Verwijder onmiddellijk het medium en het colonoïdemengsel. Herhaal dit totdat alle celkweekinzetstukken zijn schoongemaakt.
  18. Voeg voorzichtig 150 μL voorverwarmd murine monolayer medium toe aan de apicale zijde van elke celkweekinzet. Voeg 400 μL verwarmd murine monolayer medium toe aan elke put van een nieuwe 24-well plaat. Breng de celkweekinzet over op de nieuwe plaat door de pin vast te pakken met een steriele tang. Verander het medium om de dag tot samenvloeiing.
    OPMERKING: De colonoïde fragmenten moeten 3-5 dagen na het plateren een confluente monolaag vormen.

7. Het meten van de netto weerstand van de epitheliale monolagen met behulp van een voltohmmeter op dag 3 - 5 van monolaagcultuur

OPMERKING: De eetstokelektroden lijken op een tang en zijn asymmetrisch van lengte. De langere arm van de sonde is de basolaterale elektrode en de kortere arm is de apicale elektrode. De sonde kan moeilijk in te brengen zijn tussen de binnen- en buitenkant van de celkweekinzet. Door de sonde bij het inbrengen onder een lichte hoek te plaatsen, gevolgd door het verticaal rechttrekken van de sonde, voorkomt u dat de sonde vast komt te zitten. Zorg ervoor dat u de nettoweerstand van elke celkweekinzet onder een vergelijkbare hoek leest, omdat dit de waarden kan beïnvloeden.

  1. Plaats de voltohmmeter en alle reagentia in een biologische veiligheidskast.
    1. Sluit de voltohmmeter aan op het dichtstbijzijnde stopcontact en sluit de plastic modulaire connector van de elektrodesonde aan op de INPUT-aansluiting op het display aan de voorzijde.
    2. Om de voltohmmeter in een hoek van 45° te plaatsen, zwaait u de metalen arm aan de achterkant van de apparatuur naar buiten totdat deze op zijn plaats vergrendelt.
    3. Schakel nu de voltohmmeter in door de aan / uit-schakelaar UP op het display aan de voorkant om te draaien. Draai ten slotte de schakelaar omhoog naar OHMS om de meting in deze statistiek weer te geven.
  2. Verwijder de 24-well plaat van de 37°C, 5% CO2 incubator, en leg de plaat plat in de biologische veiligheidskast. De transepitheliale elektrische weerstand (TEER) is temperatuurgevoelig. Verwijder de plaat alleen vlak voordat de TEER wordt gelezen.
  3. Steriliseer de elektrodesonde in voorverwarmde 70% ethanol gedurende 30 s tot 1 min. Verwijder de sonde, keer deze om en veeg er een tot twee keer mee om de overtollige ethanol te verwijderen. Laat de sonde ongeveer 30 s aan de lucht drogen.
  4. Was de resterende ethanol die op de sonde achterblijft met voorverwarmd wasmedium voor muizen.
    LET OP: Laat geen van de resterende ethanoldruppels hoger op de sonde in de celkweekinzet vallen. Laat bij het afwassen van de ethanol met medium het medium niet boven het steriele ethanolveld komen. Dit kan ertoe leiden dat besmet medium de celkweekinzet binnendringt.
  5. Houd de sonde loodrecht op de celkweekinzet. Plaats de basolaterale elektrode (langer uiteinde van de sonde) aan de buitenkant van de celkweekinzet totdat deze de basis van de 24-putplaat raakt. Schuif de apicale elektrode (korter uiteinde van de sonde) in de celkweekinzet. Varieer de afstand van de twee elektroden niet van goed tot put. Dit heeft invloed op de TEER-meting.
  6. Controleer of de apicale elektrode de basis van de celkweekinzet niet raakt voordat u de TEER leest. Begin met de invoeging van de achtergrondbesturingscelcultuur en noteer de waarde. De waarde wordt automatisch digitaal weergegeven op de voorkant van de voltohmmeter.
  7. Herhaal stap 7.5-7.6 voor elke celkweekinzet.
    OPMERKING: Als er verschillende experimentele omstandigheden bestaan tussen de celkweekinzetstukken, steriliseer de sonde dan tussen elke nieuwe toestand. Begin bij stap 7.1 en doorloop de stappen numeriek.
  8. Plaats de 24-putplaat terug in de incubator zodra alle TEER-metingen zijn geregistreerd.
  9. De nettowaarden bij 350 Ω of meer zijn indicatief voor monolaagvorming. Herhaal dit nogmaals op de volgende dagen totdat monolaagvorming is bereikt.
    OPMERKING: Over het algemeen kunnen waarden van 1.000 Ω of meer worden vastgelegd op dag 3, maar na verloop van tijd zullen ze allemaal convergeren naar een lager getal rond 350 Ω.

8. Berekening van de TEER met behulp van netto weerstandsmetingen van de voltohmmeter

OPMERKING: Succesvolle monolaagvorming van de colonoïden geeft TEER-metingen groter dan 115 Ω ·cm2.

  1. Neem individuele netto weerstandswaarden en trek de netto weerstand goed af van de achtergrond. De celkweekinzetstukken bedekt met het keldermatrixmembraan geven een netto aflezing van ongeveer 100 Ω.
  2. Neem de nettoweerstandsmetingen met achtergrondaftrek en vermenigvuldig deze met het oppervlak van de celkweekinzet. Een 24-well celkweekinzetstuk heeft een oppervlakte van 0,33 cm2.
  3. Als de waarden 115 Ω cm2 of hoger zijn, ga dan verder met de downstream experimentele assays.

9. Het induceren van ontsteking in de epitheliale monolagen met ontstekingsmediatoren

  1. Zodra succesvolle monolagen zich hebben gevormd, voegt u ontstekingsmediatoren toe aan de cultuur aan de basale kant van de cultuur. Bereid het monolaagmedium van de ontstekingsmediator voor, zoals beschreven in stap 1.9, en voeg 400 μL toe aan elke put in een nieuwe plaat met 24 putten.
  2. Verwijder het medium van de apicale zijde van de celkweekinzet en voeg 150 μL van het muriene monolaagmedium zonder Y-27632 toe. Vul deze kant niet aan met ontstekingsmediatoren. Als de celdood echter buitensporig lijkt, laat de Y-27632 dan in de media. Dit moet door de eindgebruiker worden bepaald.
  3. Breng de celkweekinzetstukken over op een nieuwe 24-putplaat en plaats ze in de putjes aangevuld met het monolaagse medium van de ontstekingsmediator.
  4. Stimuleer de monolagen met ontstekingsmediatoren gedurende 24-72 uur, afhankelijk van het experiment.
  5. Om geneesmiddelreacties te testen met behulp van dit ontstekingsmodel, vult u het monolaagmedium aan de apicale kant van de celcultuurinzet aan met het medicijn van keuze. Het medicijn kan op elk moment in het experiment worden toegevoegd, afhankelijk van het werkingsmechanisme van het medicijn en de stroomafwaartse parameters die moeten worden beoordeeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het 3D-darmcolonoïdcultuursysteem is een waardevol hulpmiddel om de intrinsieke bijdrage van het epitheel aan de intestinale mucosale homeostase te bestuderen. Het beschreven protocol biedt gedetailleerde instructies voor het isoleren van crypten van C57BL / 6J (WT) muizen op een leeftijd van 8 weken en het opzetten van een langdurig colonoïde cultuursysteem dat kan worden gemanipuleerd voor meerdere downstream-toepassingen. Bij de isolatie en beplating van crypten in de keldermembraanmatrix lijken de crypten dicht en me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van organoïden heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop de wetenschappelijke gemeenschap orgaansystemen in vitro bestudeert met het vermogen om de cellulaire structuur en functie van een dier of mens gedeeltelijk in een schaal samen te vatten. Verder bieden organoïde systemen afgeleid van mensen met ziekten een veelbelovend hulpmiddel voor gepersonaliseerde geneeskunde die therapeutische besluitvorming zou kunnen begeleiden. Hier beschrijven we een crypte-isolatieprotocol dat goed w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bijdragende auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01DK120986 (aan K.P.M.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.4-μM transparant transwell, 24-wellGreiner Bio-one662-641
15-mL kegelvormige buisjesThermo Fisher 12-565-269
50-mL kegelvormige buisjesThermo Fisher 12-565-271
70-μM celzeefVWR76327-100
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010Voorraadconcentratie (1x); Eindconcentratie (1x)
B-27 supplement Invitrogen12587-010Voorraadconcentratie (50x); Eindconcentratie (1x)
Chopsticks Electrode Set voor EVOWorld Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR Membraan MixCorning354-230Voorraadconcentratie (100%); Eindconcentratie (100%)
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-5GVoorraadconcentratie (1 M); Eindconcentratie (1.5 mM); Oplosmiddel (ultrapuur water)
DMEM hoge glucoseThermo Fisher11960-069Voorraadconcentratie (1x); Eindconcentratie (1x)
Dulbecco's fosfaatgebufferde zout oplossing zonder Calcium en MagnesiumGibco 14190-144Voorraadconcentratie (1x); Eindconcentratie (1x)
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (ETDA)Sigma-AldrichE7889Voorraadconcentratie (0.5 M); Eindconcentratie (30 mM)
Foetaal Rund SerumBio-TechneS11150HVoorraadconcentratie (100%); Eindconcentratie (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscoopglazen, Wit, 25 x 75 mmThermo Fisher 12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1Eindconcentratie (400 µg/µL)
Gentamicine ReagensGibco/Fisher15750-060Voorraadconcentratie (50 mg/mL); Eindconcentratie (250 μg/mL)
GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061Voorraadconcentratie (100x); Eindconcentratie (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080Voorraadconcentratie (1 M); Eindconcentratie (10 mM)
hIFNγR&D Systems285-IFVoorraadconcentratie (1000 ng/µL); Eindconcentratie (10 ng/mL); Oplosmiddel (ultrapuur water)
hIL-1βR&D Systems201-LBVoorraadconcentratie (10 ng/µL); Eindconcentratie (20 ng/mL); Oplosmiddel (ultrapuur water)
hTNFαR&D Systems210-TAVoorraadconcentratie (10 ng/µL); Eindconcentratie (40 ng/mL); Oplosmiddel (ultrapuur water)
Waterstofperoxide SigmaH1009Voorraadconcentratie (30%); Eindconcentratie (0.003%); Oplosmiddel (Muis wasmedia)
Hygromycin B GoldInvivoGenant-hg-1Eindconcentratie (400 µg/µL)
L-WRN Cell LineATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176Voorraadconcentratie (0.5 µg/µL); Eindconcentratie (50 ng/mL); Oplosmiddel (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplementInvitrogen17502-048Voorraadconcentratie (100x); Eindconcentratie (1x)
N-Acetyl-L-cysteïneSigma A9165-5GVoorraadconcentratie (500 mM); Eindconcentratie (1 mM); Oplosmiddel (ultrapuur water)
NogginPeprotech250-38Voorraadconcentratie (0.1 ng/µL); Eindconcentratie (100 ng/mL); Oplosmiddel (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Thermo Fisher15140-122Voorraadconcentratie (100x); Eindconcentratie (1x)
Petrischalen (gesteriliseerd; 100 mm x 15 mm) Polystrene wegwerpVWR25384-342
Polystyreen Microplates, 24 well weefselkweek behandeld, sterielGreiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR&D Systems3474-RS-050Voorraadconcentratie (0.25 µg/µL); Eindconcentratie (500 ng/mL); Oplosmiddel (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013Voorraadconcentratie (10x); Eindconcentratie (1x); Oplosmiddel (1 mM EDTA)
UltraPure Water Invitrogen10977-023Voorraadconcentratie (1x); Eindconcentratie (1x)
Y-27632 dihydrochloride Abcamab120129Voorraadconcentratie (10 mM); Eindconcentratie (10 µM); Oplosmiddel (UltraPure Water)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222(2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102(2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678(2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38(2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202(2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054(2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Epitheliale barri recolonoid kweekinflammatoire darmziektebarri refunctieinflammatoire mediatorenmonolaagkweekstamcelnichescreening van therapeutische geneesmiddelen

Gerelateerde artikelen