Het huidige protocol beschrijft een efficiënte methode voor de real-time en dynamische acquisitie van voltage-gated kalium (Kv) kanaalstromen in H9c2 cardiomyocyten met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kaliumkanalen op het myocardiale celmembraan spelen een belangrijke rol bij de regulatie van celelektrofysiologische activiteiten. Omdat het een van de belangrijkste ionkanalen is, zijn voltage-gated kalium (Kv) -kanalen nauw verbonden met sommige ernstige hartaandoeningen, zoals door geneesmiddelen geïnduceerde myocardiale schade en een hartinfarct. In deze studie werd de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van 1,5 mM 4-aminopyridine (4-AP, een breedspectrum kaliumkanaalremmer) en aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM) op de Kv-kanaalstroom (IKv) in H9c2-cardiomyocyten te bepalen. Het bleek dat 4-AP de IKv met ongeveer 54% remde, terwijl het remmende effect van AC op de IKv een dosisafhankelijke trend vertoonde (geen effect voor 25 μM, 30% remmend tarief voor 50 μM, 46% remmend tarief voor 100 μM en 54% remmend tarief voor 200 μM). Vanwege de kenmerken van hogere gevoeligheid en precisie, zal deze techniek de verkenning van cardiotoxiciteit en de farmacologische effecten van etnomedicine gericht op ionkanalen bevorderen.
Inleiding
Ionkanalen zijn speciale geïntegreerde eiwitten ingebed in de lipide bilayer van het celmembraan. In aanwezigheid van activatoren vormen de centra van dergelijke speciale geïntegreerde eiwitten zeer selectieve hydrofiele poriën, waardoor ionen van de juiste grootte en lading op een passieve transportmanier kunnen passeren1. Ionkanalen vormen de basis van celexcitabiliteit en bio-elektriciteit en spelen een sleutelrol in een verscheidenheid aan cellulaire activiteiten2. Het hart levert bloed aan andere organen door regelmatige samentrekkingen als gevolg van een excitatie-contractie-gekoppeld proces geïnitieerd door actiep....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De commercieel verkregen H9c2 rat cardiomyocyten (zie de tabel van materialen) werden geïncubeerd in DMEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer. De whole-cell patch-clamp techniek werd vervolgens gebruikt om de veranderingen in IKv in normale H9c2 cellen en 4-AP- of AC-behandelde cellen te detecteren (figuur 1 en figuur 2).
1. Oplossingsvoorbereiding
- Bereid het DMEM-celkweekmedium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol maakte de opname van de IKv mogelijk volgens de parameters die zijn ingesteld in de hele-cel patch-clamp techniek. De IKv werd geactiveerd door 150 ms depolariserende pulsstimulus van −40 tot +60 mV bij een houdpotentiaal van −60 mV (figuur 3A). De IKv van de H9c2 rat cardiomyocyten verscheen eerst rond -20 mV, en daarna nam de amplitude toe met verdere depolarisatie. De gemiddelde relatie tussen de IKv en de membraanpotentiaal werd be.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De patch-clamp elektrofysiologische techniek wordt voornamelijk gebruikt om de elektrische activiteit en functionele kenmerken van ionkanalen op het celmembraan te registreren en weer te geven25. Op dit moment omvatten de belangrijkste opnamemethoden van de patch-clamp-techniek eenkanaalsopname en hele celopname26. Voor de hele celmodus worden de glasmicro-elektrode en negatieve druk gebruikt om een zeer resistente afdichting te vormen tussen een klein deel van het celmembr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We waarderen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82130113) en het Key R &D and Transformation Program van de afdeling Wetenschap & Technologie van de provincie Qinghai (2020-SF-C33).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopyridine | Sigma | MKCJ2184 | |
| Aconitine | Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd | DSTDW000602 | |
| Amplifier | Axon Instrument | MultiClamp 700B | |
| Analytical Balance | Sartorius | 124S-CW | |
| ATP Na2 | Solarbio | 416O022 | |
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length) | Sutter Instrument | 163225-5 | |
| Cell culture dish (100 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cell culture dish (35 mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 3012022 | |
| Clampex software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 5 | |
| Clampfit software | Molecular Devices, LLC. | Version 10. 6. 0. 13 | data acqusition software |
| D-(+)-glucose | Rhawn | RH289133 | |
| Digital camera | Hamamatsu | C11440 | |
| Digitizer | Axon Instrument | Axon digidata 1550B | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-1000 | |
| H9c2 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0111 | |
| HCImageLive | Hamamatsu | 4.5.0.0 | |
| HCl | Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd | 2106081 | |
| HEPES | Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd | 20210221 | |
| KCl | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020082501 | |
| KOH | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2020112601 | |
| MgCl2 | Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute | 20160408 | |
| MgCl2·6H2O | Chengdu Colon Chemical Co., Ltd | 2021020101 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285A | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Microscope cover glass (20 × 20 mm) | Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd | 80340-0630 | |
| Milli-Q | Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd | Milli-Q IQ 7005 | |
| MultiClamp 700B commander | Axon Instrument | MultiClamp commander 2.0 | signal-amplifier software |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| PH meter | Mettler Toledo | S201K | |
| Phosphate buffered saline (1x) | Gibco | 8120485 | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
Referenties
- Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
- Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
