Methodenartikel

Strategieën voor screening van kleine moleculen, van identiteitsvaststelling van leads tot validatie

923 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64811

⸱

20 januari 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

BESPREKTE ARTIKELEN:

Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. 152, e59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. 148, e59928 (2019).

Gao, S. et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. 145, e59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. 141, e58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. 138, e58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. 119, e55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. 139, e57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. 104, e52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. 143, e58946 (2019).

Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. 166, e61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. 165, e61787 (2020).

Redactioneel

De genoomrevolutie heeft geleid tot een enorme hoeveelheid kennis over het verband tussen genetische verstoring en verschillende ziektefenotypen1. Dit heeft geleid tot de annotatie van talrijke eiwitten als potentiële doelen voor geneesmiddelen en heeft interesse gewekt in de ontdekking en ontwikkeling van verbindingen die deze doelen remmen2. In deze context zijn verschillende screeningsstrategieën opgedoken als belangrijke benaderingen voor het ontdekken van hit-verbindingen, doelvalidatie, het meten van bindingsaffiniteiten, selectiviteit, toxiciteit en in-cel doelbetrokkenheid, evenals verbindingsreactiviteit, stabiliteit en farmacokinetische eigenschappen. Deze verzameling bevat enkele van de methodologische vooruitgang op dit gebied met als doel een veelvoud aan strategieën te laten zien die kunnen worden gebruikt om de biochemische en/of biologische activiteit van kleine moleculen te screenen en te evalueren.

Proteïnekinasen vertegenwoordigen een grote enzymfamilie met meer dan 500 leden. Deze enzymen zijn belangrijke regulatoren van alle cellulaire processen, en hun storing is in verband gebracht met talrijke ziekten3. Daarom zijn zij het middelpunt van intense belangstelling geweest in geneesmiddelontdekking en, door uitbreiding, methodologieontwikkeling. Dus, vier artikelen in deze verzameling rapporteren over vooruitgang op dit gebied. Festa et al. beschrijven een screeningsplatform voor kinase-remmerontdekking dat gebruik maakt van zelf-geassembleerde nucleïnezuurprogrammeerbare eiwitarrays (NAPPA)4. Deze arrays tonen volledige humane kinasen en maken multiplex-screening van verbindingen mogelijk over een grote kinaseverzameling, waardoor niet alleen het identificeren van hits mogelijk is, maar ook het profileren van selectiviteit. Tieman et al. beschrijven een op fosfo-antilichaammicroarray gebaseerde methode ontwikkeld om cell-wide veranderingen in fosforylatiestatus te screenen als een uitlezing van kinase-remmeractiviteit5. Dit kan leiden tot inzichten in de aard van de paden die resistent zijn geworden tegen remming, wat een belangrijke parameter is die relevant is voor het begrijpen van geneesmiddelrespons en werkzaamheid. Chen et al. beschrijven een flowcytometrie-assay voor het screenen van kinase-remmercollecties om verbindingen te identificeren die het T-celreceptor (TCR) signaal beïnvloeden6. Deze strategie leidde tot de snelle identificatie van kinasen betrokken bij TCR-signalering, wat hun potentieel als doelen voor immunotherapeutische geneesmiddelontwikkeling aangeeft. Ten slotte wordt de activiteit van veel kinasen gereguleerd door eiwit-eiwitinteracties (PPI's), wat suggereert dat verbindingen die deze PPI's targeten van belang kunnen zijn. Nandha Premnath et al. beschrijven een methode genaamd REPLACE (vervanging met partiële ligand-alternatieven met behulp van computationele verrijking) die kan worden gebruikt om niet-ATP concurrerende PPI's van kinasen te ontwikkelen door kenmerken van peptide-binders om te zetten in kleine moleculen die dezelfde bindingsoppervlakte bezetten7.

Naast kinasen spelen veel andere enzymen een rol bij ziekten en zijn ze in geneesmiddelontdekking nagestreefd. Daarom zijn ook methoden geoptimaliseerd voor andere enzymen dan kinasen van belang. Bijvoorbeeld, Stockman et al. beschrijven nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie-gebaseerde activiteitsassays om remmers van nucleoside ribohydrolasen van de parasiet Trichomonas vaginalis te ontdekken en te evalueren8. Deze assays kunnen ook worden gebruikt voor de bepaling van IC50 waarden. Om te screenen voor ATPase-remmers ontwikkelden Radnai et al. een semi-hoogdoorlaatscreeningsmethode die een gekoppelde enzymassayformaat gebruikt dat twee enzymen (pyruvaatkinase en lactaatdehydrogenase) omvat die uiteindelijk ATPase-activiteit vertalen in intrinsieke fluorescentie van nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) als uitlezing9. In tegenstelling tot alle tot dusver beschreven enzymen die processief zijn en meerdere stappen katalyseren, is proproteïne convertase subtilizine/kexine type 9 (PCSK9) een protease met eenmalige omwenteling die autogeïnhibeerd wordt door zijn substraat. Dit maakt screening voor remmers van PCSK9 uitdagend, en Chorba et al. beschrijven een hoogdoorlaats celgebaseerde methode die PCSK9-splitsingsactiviteit koppelt aan de uitgescheiden luciferase-activiteit als uitlezing, waardoor screening voor remmers mogelijk wordt10.

Naast het vinden van verbindingen die de activiteit van verschillende doelen remmen, zijn assays die bevestigen dat de verbinding zijn beoogde doel in cellen aanspreekt ook van groot belang. Axelsson et al. beschrijven een strategie voor het valideren van doelbetrokkenheid in adherante cellen op basis van het combineren van hoge-inhoud beeldvorming door immunofluorescerende antilichamen en een cellulaire thermische shift-assay (CETSA)11. Deze assay gebruikt een isotherme hitte-uitdaging voor cellen behandeld met een grote verbindingscollectie om stabiliserende verbindingen te identificeren. Een methode die doelbetrokkenheid en activiteit van degraderende moleculen kan beoordelen, ontwikkeld door Riching et al., gebruikt HiBiT/LgBiT-tagging-technologie om een luminescent eiwit te produceren en degradatieparameters te monitoren via een afname in luminescentie12. Ten slotte beschrijven Takakusagi et al. een methode voor het valideren van eiwit-geneesmiddelinteracties die is gebaseerd op het gebruik van faag-gebaseerde peptidedisplays om te screenen voor binding tussen geneesmiddel-bindende peptidemotieven en kleine moleculen13. De peptidedisplay-screen wordt gecombineerd met bioinformatica-analyse om doelbinding te valideren.

Een andere laag van kleine molecuulvalidatie is de karakterisering van hun effecten in diermodellen. Deze verzameling bevat twee van dergelijke methoden, een die zebravis (Danio rerio) modellen van humane influenza A-virusinfectie gebruikt om de

Openbaarmakingen

M.K. is een betaalde consultant voor Life Science Editors.

Dankbetuigingen

M.K. wordt gedeeltelijk ondersteund door de NCI T32 CA236754.

Referenties

  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

Gerelateerde artikelen