Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time kwantificering van de effecten van IS200/IS605 Family-Associated TnpB op Transposon-activiteit

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64825

⸱

20 januari 2023

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een protocol geschetst om live real-time beeldvorming uit te voeren om te kwantificeren hoe het accessoire-eiwit TnpB de dynamiek van transpositie in individuele levende Escherichia coli-cellen beïnvloedt.

Samenvatting

Hier wordt een protocol geschetst om live, real-time beeldvorming uit te voeren van transponeerbare elementactiviteit in levende bacteriële cellen met behulp van een reeks fluorescerende melders gekoppeld aan transpositie. Het laat met name zien hoe real-time beeldvorming kan worden gebruikt om de effecten van het accessoire eiwit TnpB op de activiteit van het transponeerbare element IS608, een lid van de IS200/IS605-familie van transponeerbare elementen, te beoordelen. De IS200/IS605 familie van transponeerbare elementen zijn overvloedige mobiele elementen verbonden met een van de meest ontelbare genen in de natuur, tnpB. Sequentie homologieën suggereren dat het TnpB-eiwit een evolutionaire voorloper kan zijn van CRISPR / Cas9-systemen. Bovendien heeft TnpB hernieuwde interesse gekregen, waarvan is aangetoond dat het fungeert als een Cas-ACHTIG RNA-geleid DNA-endonuclease. De effecten van TnpB op de transpositiesnelheden van IS608 worden gekwantificeerd en er wordt aangetoond dat de expressie van TnpB van IS608 resulteert in ~ 5x verhoogde transposonactiviteit in vergelijking met cellen zonder TnpB-expressie.

Inleiding

Transponeerbare elementen (TSE's) zijn genetische elementen die in hun gastheergenomen mobiliseren door excisie of katalyseren kopiëren gevolgd door genomische re-integratie. TSE's bestaan in alle domeinen van het leven en transpositie herstructureert het gastheergenoom, muteert coderings- en controlegebieden1. Dit genereert mutaties en diversiteit die een belangrijke rol spelen in evolutie 2,3, ontwikkeling 4,5 en verschillende menselijke ziekten6, waaronder kanker7.

Met behulp van nieuwe genetische constructies die aspecten van transpositieve activiteit koppelen aan fluorescerende verslaggevers, beschreef ons eerdere werk de ontwikkeling van een experimenteel systeem op basis van de bacteriële TE IS608, een vertegenwoordiger van de wijdverspreide IS200 / IS605-familie van TSE's, die de real-time visualisatie van transpositie in individuele levende cellenmogelijk maakt 8 (figuur 1). Het TE-systeem wordt weergegeven in figuur 1A. De TE bestaat uit de transposasecoderingssequentie, tnpA, geflankeerd door Left End (LE) en Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IP's), die de herkennings- en excisieplaatsen voor TnpA zijn. tnpA wordt uitgedrukt met behulp van de promotor PLTetO1, die wordt onderdrukt door de tet-repressor en induceerbaar is met anhydrotetracycline (aTc)9. De TE splitst de -10 en -35 sequenties van een constitutieve PlacIQ1 promotor10 voor de blauwe reporter mCerulean311. Zoals te zien is in figuur 1C, kan de TE worden weggesneden wanneer de productie van tnpA wordt geïnduceerd, wat leidt tot reconstructie van promotors. De geproduceerde cel drukt mCerulean3 uit en fluoresceert blauw. De N-terminus van TnpA is gefuseerd met de gele reporter Venus12, waardoor de TnpA-niveaus kunnen worden gemeten door gele fluorescentie.

IS608 en andere leden van de IS200/IS605-familie van transposons coderen meestal ook voor een tweede gen van de tot nu toe onbekende functie, tnpB13. De TnpB-eiwitten zijn een enorm overvloedige maar onvolmaakt gekarakteriseerde familie van nucleasen gecodeerd door verschillende bacteriële en archaeale TSE's 14,15, die vaak alleen uit tnpB16 bestaan. Bovendien hebben recente studies hernieuwde interesse in TnpB door te vinden dat TnpB functioneert als een CRISPR / Cas-achtige programmeerbare RNA-geleide endonuclease die dsDNA- of ssDNA-pauzes onder verschillende omstandigheden zal opleveren17,18. Het blijft echter onduidelijk welke rol TnpB kan spelen bij het reguleren van de omzetting. Om real-time visualisatie van de effecten van TnpB op IS608-transpositie uit te voeren, werd een versie van de transposon gemaakt, inclusief het coderende gebied van TnpB met een N-terminale fusie tot het rode fluorescerende eiwit mCherry.

Als aanvulling op meer gedetailleerde studies op bulkniveau uitgevoerd door het Kuhlman-lab19, wordt hier getoond hoe real-time beeldvorming van transposonactiviteit kwantitatief de impact van TnpB of andere accessoire eiwitten op transpositiedynamiek kan onthullen. Door TnpB te fuseren met mCherry, worden de individuele transpositiegebeurtenissen geïdentificeerd door blauwe fluorescentie en gecorreleerd met expressieniveaus van TnpA (gele fluorescentie) en TnpB (rode fluorescentie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van bacterieculturen

  1. Kweek E. coli stam MG1655 met plasmide transposon constructen (eerder beschreven in Kim et al.8) 's nachts in LB met de juiste antibiotica (25 μg/ml kanamycine, zie Materiaaltabel) bij 37 °C.
    OPMERKING: De sequenties van de gebruikte constructen en de bijbehorende sequenties zijn beschikbaar als GenBank20 toetredingsnummers OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 en OP717085.
  2. Om een exponentiële groei in steady-state te bereiken, ≥100 vouwen in het M63-medium (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,8 μM FeSO4, 15 mM [NH4] 2SO4, 0,5 μg / ml thiamine [vitamine B1]) aangevuld met een koolstofbron (0,5% w / v glucose hier) en geschikte antibiotica (zie Materiaaltabel).
  3. Kweek culturen bij 37 °C totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) ~0,2 bereikt. De culturen zijn klaar voor gebruik.

2. Dia voorbereiding

  1. Bereid een dia door M63 met 0,5% w/v glucose en 1,5% w/v agarose in de magnetron te koken om de agarose te smelten en ervoor te zorgen dat deze volledig gesmolten en goed gemengd is.
  2. Laat het mengsel afkoelen tot ~55 °C voordat u antibiotica en inductoren toevoegt (25 μg/ml Kanamycine en 10 ng/μL anhydrotetracycline [aTc], zie Materiaaltabel).
  3. Plaats een microscoopglaasje op de werkbank. Stapel nog twee dia's loodrecht op de eerste en plaats een andere op de bovenkant, parallel aan de onderste dia. Zorg ervoor dat er een opening is die gelijk is aan één schuifdikte tussen de onderste en bovenste dia's. Pipet ~ 1 ml van het M63 agarose mengsel in deze opening tussen de dia's langzaam om een klein gel vierkant te creëren.
  4. Zodra de gel is gestold (~ 10-15 min), schuift u de bovenste schuif om deze te verwijderen. Trim de agarose pad met een scheermes of mes. Pipetteer vervolgens 2,5 μL van de kweek (stap 1.3) en leg de deklip erop.
  5. Sluit de ruimte tussen de glijbaan en de afdekplaat af met epoxy (zie Materiaalopgave). Laat de epoxy drogen en de cellen minstens 1 uur bij 37 °C op de agarose pad bezinken.

3. Timelapse fluorescentiemicroscopie

  1. Plaats het bereide monster (stap 1.3) op een fluorescentiemicroscoop (zie materiaaltabel) in een omgeving die verwarmd en op 37 °C wordt gehouden.
    1. Stel de belichtingstijden in die geschikt zijn voor de camera die wordt gebruikt voor beeldacquisitie. Pas de verlichtingsintensiteit aan om fotobleaching te minimaliseren.
      OPMERKING: Voor dit onderzoek werd een blootstellingstijd van 2 s voor elke golflengte gebruikt.
    2. Zoek voor elke golflengte een gezichtsveld (FOV) met minimale fluorescentie. Verkrijg afbeeldingen om te gebruiken tijdens de analyse voor achtergrondaftrek.
  2. Stel een protocol op om afbeeldingen in een raster op verschillende golflengten en met regelmatige tijdsintervallen te verkrijgen.
    1. Codeer timelapse-fotografie in het protocol. Stel de acquisitiefrequentie in op het gewenste tijdsinterval (20 min hier) en de totale timelapse-duur op de gewenste lengte (24 uur).
    2. Codeer de juiste golflengten in het protocol (afhankelijk van de gebruikte constructie).
      OPMERKING: De mCherry excitatiepiek ligt op 587 nm en de emissiepiek op 610 nm21; mVenus is op 515 nm en 527 nm12, terwijl mCerulean3 op 433 nm en 475 nm11 ligt.
    3. Stel de rastergrootte in om vast te leggen tussen het gewenste aantal FOV's.
      OPMERKING: De hier getoonde representatieve gegevens gebruikten 8 x 8 FOV's.

4. Beeldanalyse

  1. Voer achtergrondaftrek uit op elk kleurkanaal met behulp van de respectieve achtergrondafbeeldingen die zijn verkregen in stap 3.1.2. Voor alle analysestappen gebruiken we standaardmodules in het open-source platform Fiji22 (zie Materiaalopgave).
  2. Benader de totale populatie op elk moment in de tijd door het mCerulean-kanaal te drempelen en het drempelgebied te delen door het gemiddelde celoppervlak.
  3. Om de unieke excisiegebeurtenissen te tellen, neemt u de tijdsderivaat van het mCerulean3-kanaal. Voer dit uit door opeenvolgende afbeeldingen in het mCerulean3-kanaal af te trekken. De excisiegebeurtenissen worden gedetecteerd in de tijdderivaat als een heldere flits van fluorescentie.
    1. Drempel de stapel excisiegebeurtenissen om ongewenste fluorescentie te elimineren. Merk op dat dit proces delen van de excisies zelf zal drempelen. Om dit op te lossen, verwijdt u de afbeeldingen om de excisies in hun oorspronkelijke grootte te herstellen.
      OPMERKING: Analyses met vergelijkbare drempel- en beeldanalysetechnieken kunnen ook op de andere fluorescentiekanalen worden uitgevoerd (bijv. excisiegebeurtenissen correleren met niveaus van transposase TnpA [gele Venusfluorescentie] en TnpB [rode mCherry-fluorescentie].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze methode voor het visualiseren van transposon-activiteit in levende cellen door fluorescentiemicroscopie, terwijl het een lagere doorvoer heeft dan bulkfluorescentiemetingen, maakt directe visualisatie van transposon-activiteit in individuele levende cellen mogelijk. Transposon-excisiegebeurtenissen resulteren in de reconstitutie van de promotor voor mCerulean3 (figuur 1), waardoor cellen die transposonactiviteit ondergaan door felblauwe fluorescentie kunnen worden geïdentificeerd (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De unieke methode die hier wordt gepresenteerd voor real-time beeldvorming van transponeerbare elementactiviteit in levende cellen is een gevoelige test die transpositie in levende cellen en in realtime direct kan detecteren en deze activiteit kan correleren met de expressie van accessoire eiwitten. Hoewel de doorvoer lager is dan kan worden bereikt met bulkmethoden, bereikt deze methode gedetailleerde metingen van TE-activiteit en eiwitexpressie in individuele levende cellen.

Een verscheidenh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Financiële steun voor dit onderzoek werd verstrekt door start-upfondsen van de Universiteit van Californië.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 Ton Clear EpoxyDevcon31345
AgaroseSigma-Aldrich5066
Ammonium sulfateSigma-AldrichAX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma-Aldrich37919
Argon LaserMelles Griot35-IMA-840-015
Blue Filter CubeChromaEx: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)GlucoseSigma-AldrichG7021
Eclipse Ti-E MicroscopeNikonDiscontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)Eppendorf North America Biotools22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 gFisher Scientific706834
FijiFiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)Fisher ScientificBP9723-2 
Glass Cover SlideFisher Scientific12-542B 
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich1355006
Magnesium sulfate Cert AcFisher ScientificXXM63SP3KG
Microscope HeaterWorld Precision Instruments96810-1
Potassium Phosphate MonobasicFisher Scientific17001H
ProScan III StagePrior
Red Filter CubeChromaEx: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP LaserCoherent1170412
Slide, MicroscopeFisher Scientific125535B
Thiamine HydrochlorideSigma-Aldrich (SIAL)T1270-100G
Ti-LU4 Laser LaunchNikon
Yellow Filter CubeChromaEx: Z514/10X, Em: ET535/30M

Referenties

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11(2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896(2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

TnpB eiwitreal time imagingfluorescente reportersbacteri le cellentransposonexcisiesingle cell analysefluorescentiemicroscopiemCerulean3 reporter
Real-time kwantificering van de effecten van IS200/IS605 Family-Associated TnpB op Transposon-activiteit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.