Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

4.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64826

⸱

10 februari 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

Samenvatting

Ca2+ beeldvorming kan worden gebruikt als een proxy voor cellulaire activiteit, inclusief actiepotentialen en verschillende signaleringsmechanismen waarbij Ca 2+ het cytoplasma binnendringt of intracellulaire Ca2+ winkels vrijkomt. Pirt-GCaMP3-gebaseerde Ca2+ beeldvorming van primaire sensorische neuronen van het dorsale wortelganglion (DRG) bij muizen biedt het voordeel van gelijktijdige meting van een groot aantal cellen. Tot 1.800 neuronen kunnen worden gemonitord, waardoor neuronale netwerken en somatosensorische processen als een ensemble in hun normale fysiologische context op populatieniveau in vivo kunnen worden bestudeerd. Het grote aantal bewaakte neuronen maakt de detectie mogelijk van activiteitspatronen die moeilijk te detecteren zouden zijn met behulp van andere methoden. Stimuli kunnen worden toegepast op de achterpoot van de muis, waardoor de directe effecten van stimuli op het DRG-neuronensemble kunnen worden bestudeerd. Het aantal neuronen dat Ca 2+ transiënten produceert en de amplitude van Ca2+ transiënten duidt op gevoeligheid voor specifieke sensorische modaliteiten. De diameter van neuronen levert bewijs van geactiveerde vezeltypen (niet-schadelijke mechano versus schadelijke pijnvezels, Aβ-, Aδ- en C-vezels). Neuronen die specifieke receptoren tot expressie brengen, kunnen genetisch worden gelabeld met td-Tomaat en specifieke Cre-recombinasen samen met Pirt-GCaMP. Daarom biedt Pirt-GCaMP3 Ca2+ beeldvorming van DRG een krachtig hulpmiddel en model voor de analyse van specifieke sensorische modaliteiten en neuronsubtypen die fungeren als een ensemble op populatieniveau om pijn, jeuk, aanraking en andere somatosensorische signalen te bestuderen.

Inleiding

Primaire sensorische neuronen innerveren direct de huid en dragen somatosensorische informatie terug naar het centrale zenuwstelsel 1,2. Dorsale wortelganglia (DRG's) zijn cellichaamclusters van 10.000-15.000 primaire sensorische neuronen 3,4. DRG-neuronen vertonen verschillende grootte, myelinisatieniveaus en gen- en receptorexpressiepatronen. Neuronen met een kleinere diameter omvatten pijngevoelige neuronen en neuronen met een grotere diameter reageren meestal op niet-pijnlijke mechanische stimuli 5,6. Stoornissen in de primaire sensorische neuronen zoals letsel, chronische ontsteking en perifere neuropathieën kunnen deze neuronen gevoelig maken voor verschillende stimuli en bijdragen aan chronische pijn, allodynie en pijnovergevoeligheid 7,8. Daarom is de studie van DRG-neuronen belangrijk bij het begrijpen van zowel somatosensatie in het algemeen als veel pijn- en jeukaandoeningen.

Neuronen die in vivo vuren zijn essentieel voor somatosensatie, maar tot voor kort waren hulpmiddelen om intacte ganglia in vivo te bestuderen beperkt tot relatief kleine aantallen cellen 9. Hier beschrijven we een krachtige methode voor het bestuderen van de actiepotentialen of activiteiten van neuronen op populatieniveau in vivo als een ensemble. De methode maakt gebruik van beeldvorming op basis van cytoplasmatische Ca2+ dynamica. De Ca 2+ gevoelige fluorescerende indicatoren zijn goede proxy's voor het meten van cellulaire activiteit vanwege de normaal lage concentratie cytoplasmatisch Ca2+. Deze indicatoren hebben gelijktijdige monitoring van honderden tot enkele duizenden primaire sensorische neuronen mogelijk gemaakt bij muizen 9,10,11,12,13,14,15,16 en ratten 17. De methode van in vivo Ca2+ beeldvorming die in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt om reacties op populatieniveau op mechanische, koude, thermische en chemische stimuli direct te observeren.

Het fosfoinositide-bindende membraaneiwit Pirt komt op hoge niveaus tot expressie in bijna alle (>95%) primaire sensorische neuronen18,19 en kan worden gebruikt om de expressie van de Ca 2+ sensor, GCaMP3, aan te sturen om neuronactiviteit in vivo20 te monitoren. In dit protocol worden technieken beschreven voor het uitvoeren van in vivo DRG-chirurgie, Ca2+ beeldvorming en analyse in de rechter lumbale 5 (L5) DRG van Pirt-GCaMP3-muizen14 met behulp van confocale laserscanmicroscopie (LSM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Texas Health Science Center in San Antonio.

OPMERKING: Eenmaal gestart, moeten dierchirurgie (stap 1) en beeldvorming (stap 2) op een continue manier worden voltooid. Data-analyse (stap 3) kan later worden uitgevoerd.

1. Chirurgie en het beveiligen van het dier voor de rechterkant L5 DRG-beeldvorming

OPMERKING: Zowel mannelijke als vrouwelijke Pirt-GCaMP3 C57BL/6J muizen van 8 weken of ouder werden gebruikt in deze studie. Hoewel beide geslachten even goed kunnen worden afgebeeld, moeten muizen minstens 8 weken oud zijn vanwege zwakke of intermitterende Pirt-expressie bij jongere muizen. De Pirt-GCaMP3 C57BL/6J muizen werden gegenereerd aan de Johns Hopkins University14. Aan weerszijden kan DRG worden afgebeeld en andere lumbale DRG's (bijv. Lumbale 4) kunnen worden afgebeeld. De opgegeven tijden zijn schattingen voor een ervaren chirurg. Incidentele technische problemen zoals verhoogde bloedingen kunnen de benodigde tijd verlengen.

  1. Bereid een steriele zoutoplossing met 40 mg / ml ketamine en 6 mg / ml xylazine. Het totale volume moet ten minste 9 μL/g lichaamsgewicht bedragen voor zowel chirurgie als euthanasie na beeldvorming.
    LET OP: Ketamine is schadelijk als het wordt geïnjecteerd, ingeslikt of wanneer het in contact komt met het oog. Ga er voorzichtig mee om.
  2. Zorg ervoor dat alle chirurgische hulpmiddelen schoon en gesteriliseerd zijn door autoclaveren of een andere NIH-gids voor de zorg en het gebruik van door proefdieren goedgekeurde methode.
  3. Injecteer tussen 15 en 25 minuten voor de operatie een Pirt-GCaMP3-muis intraperitoneaal (i.p.) met ~ 2,25 μL ketamine / xylazine voor elke gram lichaamsgewicht (90 mg / kg ketamine, 13,5 mg / kg xylazine). Niet meer dan 120 mg/kg ketamine.
  4. Controleer binnen 15 tot 25 minuten na injectie van anesthesie (stap 1.3) of de muis het chirurgische anesthesievlak heeft bereikt door in de contralaterale achterpoot te knijpen (niet de ipsilaterale / rechterachterpoot). De afwezigheid van de ontwenningsreflex van de achterhand zorgt ervoor dat een chirurgisch niveau van anesthesie wordt bereikt.
    OPMERKING: Hindlimb ontwenningsreflex wordt gedurende het hele experiment gebruikt om de anesthesie te controleren. Gebruik altijd de contralaterale achterpoot.
  5. Plaats de muis op een verwarmde pad om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden.
    OPMERKING: Het kan nuttig zijn om het hoofd van de muis op zijn plaats te houden met een stereotaxisch frame (zie Materiaaltabel) of een ander frame op basis van de voorkeur van de onderzoeker.
  6. Lokaliseer de lumbale vergroting door te voelen voor het bekkenbot van de muis. Scheer de achterkant van de muis boven het lumbale vergrotingsgebied. Deze stap duurt ~ 90 s.
    OPMERKING: De muis kan kort van de verwarmde pad worden verwijderd om te scheren.
  7. Maak met een schaar een driezijdige rechthoekige incisie (8 mm x 20 mm) boven de lumbale vergroting en vouw de huid weg met een tang (figuur 1A). Deze stap duurt ~2 min.
    OPMERKING: Onderzoekers kunnen ook een hemostattang of een oprolmechanisme gebruiken om de incisie open te houden. Dit is geen overlevingsoperatie, dus extra reiniging van het operatiegebied is niet nodig; Het kan echter worden gedaan met behulp van povidon-jodium. De grootste aanvaardbare incisiegrootte wordt hier gegeven. Een kleinere incisie heeft de voorkeur boven een grotere incisie.
  8. Gebruik de 13 mm veerdissectieschaar om 3-4 mm incisies aan de rechterkant van de wervelkolom te maken. Gebruik een schaar om de huid en spieren naar de zijkanten terug te knippen om de wervelkolom bloot te leggen (figuur 1B). Deze stap duurt ~3 min.
  9. Gebruik een schaar van 8 mm om het dwarsproces van de rechter L5 DRG te reinigen door de spier en het bindweefsel weg te snijden terwijl u probeert het bloeden te minimaliseren. Gebruik katoen en/of gelschuim om het bloed op te nemen. De L5-wervel is de eerste wervel die rostral is tot aan het bekkenbeen.
    OPMERKING: Deze stap duurt ~ 3 minuten en kan extra tijd in beslag nemen als het dier meer bloedt dan normaal.
  10. Snijd het rechter L5-dwarsproces open met Friedman-Pearson-rongeurs of een sterke fijne tang. Zorg ervoor dat u de DRG niet aanraakt (figuur 1C).
    OPMERKING: Deze stap duurt ~ 2 minuten, maar kan extra tijd in beslag nemen als het dier meer bloedt dan normaal.
  11. Ga niet verder totdat het bloeden volledig stopt. Voorkom bloedingen op het DRG-oppervlak met gelschuim of katoen. Deze stap duurt 1-4 minuten.
  12. Verplaats de muis en het verwarmingskussen naar het aangepaste werkgebied (figuur 2A,B). Gebruik podiumtape om het dier en het verwarmingskussen op zijn plaats te houden. Plaats de neus van het dier in de neuskegel zodat het dier continue isofluraananesthesie kan krijgen. Zet de rechter achterpoot vast die uit het podium steekt, zodat de prikkels gemakkelijk op de poot kunnen worden aangebracht. Deze stap duurt 3 min.
  13. Bevestig de wervelkolom op zijn plaats met de podiumklemmen over de huid op de wervels en/of het bekkenbot net rostral en caudaal naar de L5 DRG. Pas de klemmen en het podium aan om het oppervlak van de DRG zo waterpas mogelijk te maken (figuur 2B,C).
    OPMERKING: Het kan nodig zijn om het weefsel dat tussen de DRG en het doel ligt te trimmen.
  14. Plaats het podium onder de microscoop zodat het objectief zich 8 mm direct boven de DRG bevindt wanneer het wordt neergelaten (figuur 3A, B). Plaats de rectale thermometer.
    OPMERKING: De afstand van de DRG tot het doel kan variëren op basis van het doel, de microscoop en het dier.
  15. Sluit de hoogspanningslijnen aan op het verwarmingskussen en de rectale thermometer. Sluit de neuskegel aan op de isofluraangasleidingen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Voorbeeld van DRG-blootstellingsoperatie . (A) Een klein gebied werd geschoren en de huid werd gesneden en teruggevouwen. De incisie is ~10 mm op de rostral-caudale as. (B) Er werd een incisie gemaakt aan de rechterkant van de wervelkolom en spier- en bindweefsel werden weggesneden, waardoor het L5-proces aan de rechterkant werd blootgesteld. Bloed werd opgenomen met gelschuim. (C) Het transversale proces werd gereinigd en het bot over de DRG werd verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: De muis op een aangepast podium monteren voor DRG-beeldvorming . (A) Het aangepaste werkgebied wordt weergegeven. Het bestaat uit een bodemplaat en een plaat voor het dier. De dierenmontageplaat bevindt zich op een vergrendelingskogel en een draaigewricht van de kom. Een neuskegel met lijnen voor het leveren van zuurstof / isofluraanmengsel en een afvalgasleiding samen met een met aluminiumfolie omwikkelde verwarmingspad worden op de dierenmontageplaat geplakt. Twee armen, elk gemaakt van drie vergrendelingskogel- en socketdraaigewrichten, zijn vastgeschroefd aan de basisplaat. Elke arm heeft een klem gemaakt van een tang met een schroef voor het aandraaien en losmaken. (B) Het dier is op de montageplaat van het dier gemonteerd. De neus wordt in de neuskegel geplaatst. Klemmen worden over de huid geplaatst die de wervelkolom en het bekkenbot vasthouden. De rechter (ipsilaterale) achterpoot is afgeplakt om uit te steken voor gemakkelijke toegang voor het aanbrengen van stimuli. (C) Een close-up van de geklemde wervelkolom en het bekkenbot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Dier op aangepast podium wordt onder het microscoopobjectief geplaatst . (A) Een groothoekweergave van het podium, het dier en de microscoop. Draden naar de DC-temperatuurregelaar en leidingen naar zuurstof / isofluraaninlaat en afvalgasleiding zijn zichtbaar aan de linkerkant. (B) Een close-up van het dier onder het microscoopobjectief. De DRG bevindt zich ~8 mm onder het objectief. De rectale thermometer wordt ingebracht en de neus bevindt zich in de neuskegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. DRG-beeldvorming

  1. Gebruik een rechtopstaande confocale microscoop 10x/0.4 DIC objectief en de bijbehorende software (zie Tabel van Materialen) voor beeldvorming. Gebruik de instellingen van het groene filter (FITC): excitatie 495 nm, emissie 519 nm, detectiegolflengte 500-580 nm, GaAsP-Pmt1 beeldvormingsapparaat, GaAsP-PMT-detector.
    OPMERKING: Gebruik voor andere microscopen de door de fabrikant aanbevolen instellingen.
  2. Zoek het oppervlak van de DRG met de microscoop. Stel de klemmen op het podium zo in dat het DRG-oppervlak zo vlak mogelijk is en dat het maximale oppervlak in het brandpuntsvlak wordt gevisualiseerd.
    OPMERKING: De keuze van het objectief kan variëren afhankelijk van de gebruikte microscoop en de voorkeur van de gebruiker. De keuze van de software hangt af van de microscoop. Een niveau DRG resulteert in duidelijkere beelden, stelt de software in staat om duidelijkere films te construeren, maakt beeldvorming van meer neuronen mogelijk en maakt analyse eenvoudiger en nauwkeuriger.
  3. Toevoer 1% -1,5% isofluraan in zuurstofstroom naar de neuskegel om ervoor te zorgen dat de muis verdoofd blijft. Controleer het dier zorgvuldig tijdens de procedure om isofluraananesthesie te behouden zonder overdosering.
    OPMERKING: De hoeveelheid isofluraan die nodig is om de anesthesie te behouden, kan variëren per individueel dier en stimulus. Meestal is 1,5% voldoende. Als het dier tijdens de stimulus beweegt, moet isofluraan worden verhoogd. Als de ademhaling oppervlakkig wordt, moet isofluraan worden verlaagd. Test voor elke stimulus de achterste reflex op de contralaterale achterpoot.
    LET OP: Isofluraan kan schadelijk zijn of duizeligheid of slaperigheid veroorzaken bij inademing. Vermijd inademing en gebruik alleen in een goed geventileerde ruimte.
  4. Laad het microscoop rapid scanning protocol.
    1. Gebruik de standaardinstellingen voor snel scannen: voxelgrootte 2,496 μm x 2,496 μm x 16 μm, 512 x 512 pixels, 10 optische slice Z-stack, 1 luchtige eenheid (AU)/32 μm, 1% 488 nm laservermogen 5 mW, pixeltijd 1,52 μs, lijntijd 0,91 ms, frametijd 465 ms, LSM-scansnelheid 8, bidirectioneel scannen, GaAsP-PMT detectorversterking 650 V, digitale versterking 1. Optimale instellingen kunnen variëren per microscoop en dier.
    2. Om een snel scanprotocol in te stellen, klikt u op het tabblad Acquisitie . Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Frames . Klik op Voorinstellingen > 512 x 512 om de microscoop in te stellen om een afbeelding van 512 pixels x 512 pixels op te nemen. Dit zal op zijn beurt de X- en Y-waarden van de voxelgrootte instellen op basis van de beeldgrootte, die wordt bepaald door de microscoopsoftware.
    3. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Kanalen . Klik op het vak Track2 . Gebruik het vervolgkeuzemenu naast het vak Track2 om Groen (FITC) te selecteren. Er wordt een nieuw tabblad geopend onder Track2.
    4. Klik naast Lasers op het vakje 488 . Dit zal de excitatie- en emissiegolflengten bepalen.
    5. Stel naast de schuifregelaar van 488 nm het laservermogen in op 1%. Klik op de knop 1 AU om de aperature voor 1 Airy-eenheid in te stellen. Stel onder FITC Master Gain in op 650 V, Digital Offset op 0 en Digital Gain op 1.
    6. Schakel op het tabblad Acquisitie het selectievakje Z-Stack in. Klik op de Live knop om een live beeld van het ganglion te bekijken. Draai de brandpuntsvlakknop omhoog totdat er slechts een kleine boog van neuronen zichtbaar is.
    7. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Z-Stack > knop Laatste instellen . Draai de knop van het brandpuntsvlak naar beneden totdat er slechts een kleine boog van neuronen zichtbaar is. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Z-Stack > knop Eerste instellen . Klik op de knop Live om het live beeld uit te schakelen.
    8. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Z-Stack . Vul het veld Segmenten in met 10. Hiermee worden 10 optische plakjes ingesteld en wordt automatisch de voxeldiepte bepaald.
    9. Klik op het tabblad Acquisitie op het vak Time Series . Er verschijnt een nieuw tabblad Tijdreeksen onder Acquisitieparameters. Klik op het tabblad Tijdreeks > veld Cycli met het aantal cycli dat u vervolgens wilt nemen. In dit geval is het 8.
    10. Stel de scansnelheid en -richting in. Onder Acquisitieparameters > > het tabblad Acquisitiemodus > Dubbele pijl voor birdirectioneel scannen. Selecteer het tabblad Acquisitiemodus > Frame- > scansnelheidsschuifregelaar > 8.
      OPMERKING: Normaal gesproken kan men instellingen van een eerder experiment laden en hoeft men alleen het laservermogen aan te passen als het beeld te helder of te zwak is en de Z-Stack Set Last en Set First aan te passen.
  5. Maak een korte 8-cyclusscan van de DRG door te klikken op Experiment starten onder het tabblad Acquisitie . Maak een film door een orthogonale projectie van scans (één scan per frame) in de loop van de tijd te maken en handmatig te controleren op beeldhelderheid en beeldartefacten zoals "golven" van helderheid die de DRG kruisen. Pas de klempositie en optische sectiedikte aan en herhaal deze stap totdat een heldere film van hoge kwaliteit is bereikt.
    OPMERKING: Deze stap moet worden herhaald als het dier beweegt of wordt verplaatst door de onderzoeker. Problemen om naar te zoeken zijn onder meer gebieden van het ganglion (niet alleen enkele neuronen) die in de loop van het experiment lichter en donkerder lijken te worden, waardoor een golvend uiterlijk ontstaat of gebieden verdwijnen of helderder worden. Beweging groter dan ongeveer de helft van de diameter van een klein neuron (<20 μm) is een ander groot probleem. Golvendheid kan vaak worden verholpen door de eerste en laatste positie van de Z-Stack dichter bij elkaar te brengen (zie stap 2.4.4 hierboven) en de optische plakdikte te verkleinen. Film 1 geeft een voorbeeld van een golvende ganglia voorafgaand aan het nivelleren en het instellen van de juiste optische plakdikte. Film 2 is na het corrigeren van nivellering en optische plakdikte. Het verschil is subtiel, maar het heeft een enorm effect op de analyse.
  6. Laad het microscoop hoge resolutie scanprotocol.
    1. Gebruik de standaardinstellingen voor scannen met hoge resolutie: voxelgrootte 1,248 μm x 1,248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 pixels, 6 optische slice Z-stack, 1,2 luchtige eenheid (AU)/39 μm, 5% 488 nm laservermogen/25 mW, pixeltijd 2,06 μs, lijntijd 4,95 ms, frametijd 5,06 s, LSM-scansnelheid 6, bidirectioneel scannen, GaAsP-PMT detectorversterking 650 V, digitale versterking 1. Optimale instellingen kunnen variëren per microscoop en dier.
    2. Als u een scanprotocol met hoge resolutie wilt instellen, klikt u op het tabblad Acquisitie . Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Frames . Klik op Voorinstellingen > 1024 x 1024 om de microscoop in te stellen om een afbeelding van 1024 pixels x 1024 pixels op te nemen. Dit zal op zijn beurt de X- en Y-waarden van de voxelgrootte instellen op basis van de beeldgrootte, die wordt bepaald door de microscoopsoftware.
    3. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Kanalen . Klik op het vak Track2 . Gebruik het vervolgkeuzemenu naast het vak Track2 om Groen (FITC) te selecteren. Er wordt een nieuw tabblad geopend onder Track2.
    4. Klik naast Lasers op het vakje 488 . Dit zal de excitatie- en emissiegolflengten bepalen. Klik op het vak High Intensity Laser Range .
    5. Stel naast de schuifregelaar van 488 nm het laservermogen in op 5%. Klik op de knop 1 AU om de aperature voor 1 Airy-eenheid in te stellen. Stel onder FITC Master Gain in op 650 V, Digital Offset op 0 en Digital Gain op 1.
    6. Schakel op het tabblad Acquisitie het selectievakje Z-Stack in. Klik op de Live knop om een live beeld van het ganglion te bekijken. Draai de brandpuntsvlakknop omhoog totdat er slechts een kleine boog van neuronen zichtbaar is.
    7. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Z-Stack > knop Laatste instellen . Draai de knop van het brandpuntsvlak naar beneden totdat er slechts een kleine boog van neuronen zichtbaar is. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Z-Stack > knop Eerste instellen . Klik op de knop Live om het live beeld uit te schakelen.
    8. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Z-Stack . Vul het veld Segmenten in met 6. Hiermee worden 6 optische segmenten ingesteld en wordt automatisch de voxeldiepte bepaald.
    9. Controleer op het tabblad Acquisitie of het selectievakje Tijdreeks is uitgeschakeld (geen tijdreeksen).
    10. Stel de scansnelheid en -richting in. Klik onder Acquisitieparameters op het tabblad Acquisitiemodus > Voorinstellingen frame > > 1024 x 1024. Selecteer het tabblad Acquisitiemodus > Frame > richting > Pijl met dubbele kop voor bidirectioneel scannen. Selecteer het tabblad Acquisitiemodus > schuifregelaar Frame- > scansnelheid > 6.
    11. Als cellen zijn gelabeld met td-Tomato, stel dan de microscoop in om het rode kanaal 592 nm excitatie / 614 nm emissie te scannen, detectiegolflengte 600-700 nm naast het groene kanaal. Stel dit in door naar Acquisitieparameters te gaan en op het tabblad Kanalen > het vak Track1 te klikken. Gebruik het vervolgkeuzemenu naast het vak Track1 om Rood (Texas Red) te selecteren. Volg hetzelfde proces als in stap 2.6.3, behalve klik op het vak 561 in plaats van het vak 488 . Stel het laservermogen in op 1%. Td-Tomato is veel helderder dan GCaMP3 en vereist een lager laservermogen.
  7. Maak een afbeelding met hoge resolutie van de DRG door op de knop Experiment starten onder het tabblad Acquisitie te klikken.
  8. Laad het snelscanprotocol van de microscoop (zie stap 2.4). Registreer spontane activiteit in de DRG gedurende 80 cycli (ongeveer 10 minuten). Genereer een orthogonale projectiefilm en controleer of het beeld van voldoende kwaliteit is voor analyse.
    OPMERKING: Kwaliteitsoverwegingen zijn dezelfde als in stap 2.5.
  9. Voor het aanbrengen van stimuli, stel de microscoop in om 15-20 scans uit te voeren. Wacht tot scans 1-5 zijn voltooid om de basislijn te produceren. Pas de stimulus toe tijdens scans 6-10. Wacht ten minste 5 minuten na elke stimulus voordat u de volgende stimulus toepast om desensibilisatie te voorkomen.
    OPMERKING: Mechanische stimuli moeten eerst worden toegepast en vervolgens koude, thermische en chemische stimuli. Zwakkere stimuli (bijv. lage mechanische kracht, temperaturen dichter bij kamertemperatuur) moeten worden toegepast vóór sterkere stimuli (bijv. hogere mechanische kracht, temperaturen verder van kamertemperatuur). Zorg er bij het aanbrengen van stimuli voor dat u geen beweging van de DRG veroorzaakt. Met name voor sterke thermische stimuli is het vaak nodig om 2% isofluraan gedurende 1-2 minuten toe te passen voordat de stimulus wordt gestart. Op de microscoop die in dit onderzoek is gebruikt, is elke scan duidelijk te horen, zodat de onderzoeker het einde van de scan gemakkelijk kan identificeren, waardoor stimulustoepassing onmiddellijk na scan 5 mogelijk is. Elke methode die de toepassing van stimuli op een consistent tijdstip vergemakkelijkt, zal echter werken.
  10. Voor een mechanische pers, houdt u de knijper van de algometer met de poot tussen de peddels zonder de poot aan te raken en knijpt u onmiddellijk na het einde van scan 5 en stopt u onmiddellijk na scan 10. Controleer de perskracht met een algometer (zie Materiaaltabel). Houd de perskracht zo dicht mogelijk bij de gewenste kracht (hier gebruiken we een drukprikkel van 100 g) en zorg ervoor dat deze niet meer dan 10 g boven de gewenste kracht uitkomt.
    OPMERKING: Men kan stimuli detecteren met slechts 0,07 g von Frey-filamenten en maar liefst 600 g perskracht.
  11. Voor koude en thermische prikkels, koel of verwarm een beker water tot net onder (voor koud) of boven (voor thermisch) de gewenste temperatuur en begin met scannen. Gebruik hier een stimulus van 45 °C. Wanneer het water de juiste temperatuur heeft, breng je de stimulus direct na scan 5 aan door de poot onder te dompelen in het water. Trek het bekerglas direct na scan 10 weg.
    OPMERKING: De temperatuur moet binnen 1 °C van de gewenste temperatuur op scan 5 liggen. Als de temperatuur van het bekerglas onjuist is, pas de stimulus dan niet toe, omdat dit de neuronen ongevoelig kan maken. In plaats daarvan koelt of verwarmt u het water opnieuw en probeert u het opnieuw. We hebben temperaturen gemeten tot 0 °C (ijswater) en tot 95 °C. Houd er echter rekening mee dat temperaturen boven 50 °C weefsels kunnen beschadigen en latere experimenten kunnen verstoren. Evenzo zijn sommige chemicaliën (bijv. tetrodotoxine, capsaïcine) onomkeerbaar of kunnen ze niet worden weggespoeld en kunnen ze verdere experimenten op het dier voorkomen.
  12. Nadat alle stimuli zijn aangebracht en geregistreerd, euthanaseert u het dier door overdosering met ketamine / xylazine (200 mg / kg ketamine, 30 mg / kg xylazine of 5 μL per gram lichaamsmassa van oplossing bereid in stap 1.1), gevolgd door onthoofding.

3. Data-analyse

  1. Open de afbeeldingsbestanden door te slepen en neer te zetten in ImageJ. Nadat u het bestand hebt geopend, selecteert u het afbeeldingstype onder Afbeelding > Type > RGB-kleur.
    OPMERKING: De StackReg21-plug-in onder Plug-ins > StackReg is handig voor het corrigeren en uitlijnen van bewegingsartefacten. ImageJ kan de meeste bestandsindelingen van microscoopsoftware lezen. De keuze van het afbeeldingstype is afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker. RGB vereenvoudigt het produceren van kleurenafbeeldingen voor publicatie. Softwarepakketten van de microscoopfabrikant of cytoNet22 kunnen ook helpen bij de analyse. Het is niet nodig om StackReg te downloaden, te installeren en te gebruiken, maar het wordt wel aanbevolen.
  2. Gebruik de tool region of interest (ROI) om actieve neuronen te selecteren onder Analyze > Tool > ROI Manager. Teken ROI's met behulp van de ellips - of rechthoekgereedschappen op de werkbalk en plaats ze in het ROI-bestand door op de knop Toevoegen onder Toevoegen in het venster ROI-beheer te drukken of door op de toets "t" te drukken.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het ROI-bestand regelmatig opslaat. Gebruikers kunnen ROI's altijd herstellen door een ROI-bestand naar ImageJ te slepen en neer te zetten en op het vak Alles weergeven onder aan het venster ROI-beheer te klikken. Opslaan als overlay wordt niet aanbevolen. Uit ervaring blijkt dat opslaan als ROI.zip-bestand de analyse vereenvoudigt.
  3. Controleer onder Metingen analyseren > instellen of de optie gemiddelde grijswaarde is ingeschakeld. schakel alle andere selectievakjes uit onder Metingen instellen. Gebruik de multi-measure tool in het ROI manager menu om de intensiteit binnen de ROI's te berekenen. Meet de intensiteit met behulp van het ROI-venster onder Meer > Multimeter.
    OPMERKING: Soms liggen aangrenzende neuronen te dicht bij elkaar om afzonderlijke ROI's te trekken. Deze neuronen kunnen niet worden gebruikt om de voorbijgaande intensiteit te meten, maar kunnen worden opgenomen in tellingen van activerende neuronen.
  4. Sla het CSV-bestand op dat door Multimeasure is gegenereerd en open het CSV-bestand met elke spreadsheetsoftware.
    OPMERKING: Zie Aanvullend bestand 1 voor een voorbeeld van een spreadsheetsjabloon om de analyse te vergemakkelijken.
  5. Bereken Ca2+ transiënte intensiteit als ΔF / F 0 = (F t- F 0) / F 0, waarbij Ft de pixelintensiteit is in een ROI op het moment van interesse, en F 0 de basislijnintensiteit is die wordt bepaald door het gemiddelde te nemen van de intensiteiten van ofwel de 2-4 frames vóór de Ca 2+ transiënt voor spontane activiteit of de eerste 1-5 frames van de ROI voor Ca2+ transiënten die optreden tijdens stimulatie. Sluit neuronen uit die Ca2+ pieken produceren vóór de stimulus en analyseer geen activiteit nadat de stimulus is geëindigd.
  6. Voor Ca2+ transiënte intensiteitsanalyse, steekproef willekeurig ongeveer gelijke aantallen neuronen van elk ganglion om te voorkomen dat de gegevens worden scheefgetrokken naar ganglia die het grootste aantal reagerende neuronen produceerden. Sluit pieken uit waar ΔF / F 0 <0,15 .
    OPMERKING: Er zijn alternatieve gepubliceerde methoden voor analyse en inclusie / uitsluiting van neuronen 11,12,23,24,25,26,27,28.
  7. Meet neurondiameters met het lijngereedschap op de werkbalk in ImageJ. Bereken de gemiddelde diameter uit de lijnen die langs de langste en kortste diameters zijn getekend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

figure-results-1
Figuur 4: Representatieve beelden van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen. (A,D) Single frame hoge resolutie scans van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen worden getoond. (B,E) . Gemiddelde intensiteitsprojecties van 15 frames Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglia van respectievelijk pa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Aanhoudende pijn is aanwezig in een breed scala van aandoeningen, slopende en / of het verminderen van de kwaliteit van leven voor ongeveer 8% van de mensen29. Primaire sensorische neuronen detecteren schadelijke stimuli op de huid en hun plasticiteit draagt bij aan aanhoudende pijn8. Hoewel neuronen kunnen worden bestudeerd in celkweek en explantaten, verwijdert dit ze uit hun normale fysiologische context. Chirurgische blootstelling van de DRG, gevolgd door Pirt-GCaMP3 Ca...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01DE026677 en R01DE031477 (aan Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.), en een Rising STAR Award van het University of Texas system (Y.S.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anased Injection (Xylazine)Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DICCal Zeiss422642-9900-000
Cotton Tipped ApplicatorsMcKesson24-106-1S
Curved HemostatFine Science Tools13007-12
DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
DC Temperature Controller Heating PadFHC40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated ForcepsFine Science Tools11252-50
FHC DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
Ketaset (Ketamine)ZoetisKET-00002R2
Luminescent Green Stage TapeJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane VaporizerMidmark91305430
Micro dissecting scissorsRobozRS-5882
Micro dissecting spring scissorsFine Science Tools15023-10
Micro dissecting spring scissorsRobozRS-5677
Mini Rectal Thermistor ProbeFHC40-90-5D-02
Operating scissorsRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J miceJohns Hopkins UniversityN/ABeide geslachten kunnen even goed worden geïmageed. Muizen moeten minstens 8 weken oud zijn vanwege zwakke of intermitterende Pirt-promoterexpressie bij jongere muizen.
SMALGO small animal algometerBioseb In vivo Research InstrumentsBIO-SMALGO
Stereotaxic frameKopf Model 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J miceJackson Laboratory7909
Top Plate, 6 in x 10 inNewport290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J miceJackson Laboratory17769
Zeiss LSM 800 confocal microscopeCal ZeissLSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6

Referenties

  1. Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
  2. Wessels, W. J., Marani, E. A rostrocaudal somatotopic organization in the brachial dorsal root ganglia of neonatal rats. Clinical Neurology and Neurosurgery. 95, 3-11 (1993).
  3. Schmalbruch, H. The number of neurons in dorsal root ganglia L4-L6 of the rat. The Anatomical Record. 219 (3), 315-322 (1987).
  4. Sørensen, B., Tandrup, T., Koltzenburg, M., Jakobsen, J. No further loss of dorsal root ganglion cells after axotomy in p75 neurotrophin receptor knockout mice. The Journal of Comparative Neurology. 459 (3), 242-250 (2003).
  5. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Current Biology. 9 (12), 429-431 (1999).
  6. Liu, Y., Ma, Q. Generation of somatic sensory neuron diversity and implications on sensory coding. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 52-60 (2011).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Stucky, C. L., Mikesell, A. R. Cutaneous pain in disorders affecting peripheral nerves. Neuroscience Letters. 765, 136233(2021).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiology of Pain. 11, 100083(2022).
  10. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Scientific Reports. 9 (1), 7651(2019).
  11. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., McMahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  12. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Science Advances. 2 (11), 1600990(2016).
  13. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. The Journal of Neuroscience. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  14. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  15. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  16. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Reports. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  17. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  18. Kim, A. Y., et al. a phosphoinositide-binding protein, functions as a regulatory subunit of TRPV1. Cell. 133 (3), 475-485 (2008).
  19. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of TRPV1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  21. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  22. Mahadevan, A. S., et al. cytoNet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Computational Biology. 18 (6), 1009846(2022).
  23. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  24. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. The Journal of Physiology. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  25. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450(2016).
  26. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171(2015).
  27. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nature Neuroscience. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  28. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  29. Torrance, N., Smith, B. H., Bennett, M. I., Lee, A. J. The epidemiology of chronic pain of predominantly neuropathic origin. Results from a general population survey. The Journal of Pain. 7 (4), 281-289 (2006).
  30. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca(2+) activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. The Journal of Neuroscience. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  31. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Na(V)1.8-positive and Na(V)1.8-negative sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  32. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  33. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5810(2021).
  34. Chan, S. L., Mayne, M., Holden, C. P., Geiger, J. D., Mattson, M. P. Presenilin-1 mutations increase levels of ryanodine receptors and calcium release in PC12 cells and cortical neurons. The Journal of Biological Chemistry. 275 (24), 18195-18200 (2000).
  35. Sierra, D. A., Popov, S., Wilkie, T. M. Regulators of G-protein signaling in receptor complexes. Trends in Cardiovascular Medicine. 10 (6), 263-268 (2000).
  36. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca(2+) responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 101-104 (2018).
  37. Tan, C. H., McNaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  38. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nature Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  39. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  40. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nature Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  41. Harada, K., et al. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 7 (1), 7351(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

In vivo beeldvormingconfocale microscopiePirt-GCaMP3-muizenneuronale ensemble-activiteitsensorische modaliteitenpijnovergevoeligheidmechanische stimuli
In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.