Methodenartikel

DNA-virusdetectiesysteem op basis van RPA-CRISPR/Cas12a-SPM en deep learning

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64833

⸱

10 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol dat recombinasepolymeraseamplificatie combineert met een CRISPR/Cas12a-systeem voor sporendetectie van DNA-virussen en draagbare smartphonemicroscopie bouwt met een door kunstmatige intelligentie ondersteunde classificatie voor point-of-care DNA-virusdetectie.

Samenvatting

We rapporteren een snel, eenvoudig te implementeren, zeer gevoelig, sequentiespecifiek en point-of-care (POC) DNA-virusdetectiesysteem, dat recombinasepolymerase-amplificatie (RPA) en CRISPR/Cas12a-systeem combineert voor sporendetectie van DNA-virussen. Doel-DNA wordt afzonderlijk geamplificeerd en herkend door RPA en CRISPR/Cas12a, wat de collaterale splitsingsactiviteit van Cas12a activeert die een met fluorofoor-quencher gelabelde DNA-verslaggever splitst en fluorescentie generaliseert. Voor POC-detectie is draagbare smartphonemicroscopie gebouwd om fluorescerende beelden te maken. Daarnaast worden deep learning-modellen voor binaire classificatie van positieve of negatieve monsters, die een hoge nauwkeurigheid bereiken, binnen het systeem ingezet. Kikkervirus 3 (FV3, geslachten Ranavirus, familie Iridoviridae) werd getest als voorbeeld voor dit POC-detectiesysteem van het DNA-virus, en de detectielimieten (LoD) kunnen binnen 40 minuten 10 aM bereiken. Zonder bekwame operators en omvangrijke instrumenten toont de draagbare en miniatuur RPA-CRISPR/Cas12a-SPM met kunstmatige intelligentie (AI) ondersteunde classificatie een groot potentieel voor de detectie van POC-DNA-virussen en kan het de verspreiding van dergelijke virussen helpen voorkomen.

Inleiding

In de afgelopen jaren hebben zich vaak epidemieën van infectieziekten voorgedaan die door verschillende virussen worden veroorzaakt, waaronder de ebolavirusepidemie (EVD) in 20141 en 20182, het Middle East Respiratory Syndrome (MERS) in 20153, de epidemie van het zikavirus in 20154, de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt door ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)5 en de aanhoudende apenpokken veroorzaakt door het apenpokkenvirus (MKPV) in 20226. Deze plotselinge uitbraken van epidemische infectieziekten veroorzaken een groot aantal doden en brengen enorme economische verliezen en sociale onrust met zich mee. Er is dringend behoefte aan een snel en nauwkeurig detectiesysteem om de infectie snel te diagnosticeren en verdere verspreiding van het virus te voorkomen.

Onlangs hebben geclusterde regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindroomherhalingen (CRISPR) en CRISPR-geassocieerde (Cas) eiwitten wereldwijd aandacht gekregen en veelbelovende resultaten opgeleverd bij de detectie van nucleïnezuren 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Het CRISPR/Cas12a-eiwit, geleid door CRISPR-RNA (crRNA), bindt zich aan het doel-DNA en splitst het. Deze activiteit leidt tot het vrijkomen van niet-specifiek enkelstrengs DNA (ssDNA), bekend als trans-splitsing, en kan worden gebruikt om het detectiesignaal voor nucleïnezuurdetectie te verbeteren. Sommige traditionele detectiemethoden zoals polymerasekettingreactie (PCR), kwantitatieve real-time PCR (qPCR) en enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) zijn ingewikkeld, tijdrovend en kostbaar voor point-of-care (POC) detectie. Ons eerdere werk heeft met succes een geautomatiseerd, geïntegreerd en kosteneffectief detectiesysteem voor het Afrikaanse varkenspestvirus (AVP) ontwikkeld op basis van CRISPR/Cas12a-technologie. In dit systeem bereikten we een detectielimiet van 1 pM binnen een tijdsbestek van 2 uur zonder dat er versterking nodig was. Het CRISPR/Cas12a-systeem en recombinasepolymerase-amplificatie (RPA) worden gecombineerd om de gevoeligheid en specificiteit voor de detectie van sporen-DNA te verbeteren. Vergeleken met andere isotherme versterkingstechnieken is RPA eenvoudig van ontwerp en handig in gebruik, omdat het een kortere reactietijd heeft zonder geavanceerde temperatuurregelingsapparatuur.

Voor POC-detectie van ziekteverwekkers worden instrumenten zoals smartphonemicroscopie (SPM), draagbare fluorimeter of laterale flowstrips ontwikkeld voor de uitlezingen van de resultaten 16,17,18. SPM legt beelden vast via een camera en uploadt deze naar sommige mobiele applicaties voor snelle gegevensanalyse. Een dergelijke microscopie maakt een draagbaar, goedkoop en geminiatuurd signaalacquisitiesysteem met een hoge gevoeligheid en heeft voordelen aangetoond bij het detecteren van ziekteverwekkers zoals H5N1, het Zika-virus en SARS-CoV-219,20. Daarom bouwen we een draagbare SPM om de fluorescentiesignalen op te vangen die worden geactiveerd door RPA-CRISPR/Cas12a-detectie van het doelwit-DNA-virus. De ssDNA-reportersonde die een fluorofoor en een quencher verbindt, zal worden gesplitst wanneer CRISPR/Cas12a het doel-DNA-virus herkent, en de fluorescentie die door de fluorofoor wordt uitgezonden, kan worden vastgelegd door SPM.

Vergeleken met de professionele software die gewoonlijk wordt gebruikt om de resultateninformatie van de fluorescentiebeelden van SPM21 te verkrijgen, gebruiken sommige experts machine learning en deep learning om de concentraties van virus-DNA te kwantificeren na het verkrijgen van fluorescentiebeelden22, wat meer tijd in beslag neemt. Als het gaat om het classificeren van medische beelden, worden conventionele neurale netwerken (CNN's) vaak gebruikt om kenmerken van de onbewerkte gepixelde afbeeldingen op een end-to-end manier te leren 23,24,25,26. Populaire op CNN gebaseerde deep learning-modellen zoals AlexNet, DenseNet-121 en EfficientNet-B7 zijn op dit gebied met succes toegepast27,28. Het verkrijgen van grote datasets in specifieke domeinen kan echter een uitdaging zijn, waardoor transfer learning29,30 nodig is. Met deze aanpak wordt een deep learning-model met een grote dataset vooraf getraind en wordt het vooraf getrainde model gebruikt als startpunt voor een nieuwe taak met een kleine dataset. Deze techniek kan de behoefte aan grote datasets verminderen, overfitting tegengaan en de trainingstijd verkorten31. Hierin gebruiken we deep learning-modellen met transfer learning voor de binaire classificatie van de fluorescentiebeelden van de positieve en negatieve monsters.

In deze methode combineren we RPA en het CRISPR/Cas12a-systeem voor de sporendetectie van DNA-virussen. Doel-DNA wordt afzonderlijk geamplificeerd en herkend door RPA en CRISPR/Cas12a, wat de collaterale splitsingsactiviteit van Cas12a activeert die een met fluorofoor-quencher gelabelde DNA-verslaggever splitst en fluorescentie generaliseert. We bouwen een draagbare SPM om de fluorescerende beelden te maken voor POC-detectie en ontwikkelen deep learning-modellen voor binaire classificatie. Het schema van het ingebouwde POC-detectiesysteem is weergegeven in figuur 1. Zonder bekwame operators en omvangrijke instrumenten toont de RPA-CRISPR/Cas12a-SPM met kunstmatige intelligentie (AI) ondersteunde classificatie een groot potentieel voor de detectie van POC-DNA-virussen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Het schema van het RPA-CRISPR/Cas12-SPM-detectiesysteem samen met AI-classificatie voor verzamelde afbeeldingen. De nucleïnezuren van dierlijke monsters worden vrijgegeven door PINDBK. Het doel-DNA van het virus wordt specifiek versterkt en herkend door het RPA-CRISPR/Cas12a-systeem. CRISPR/Cas12a-bindingen met crRNA en het Cas12a-crRNA-complex bindt met doel-DNA, wat de collaterale splitsing van CRISPR/Cas12a op de ssDNA-reportersondes veroorzaakt. De fluorofoor op de verslaggever wordt vrijgegeven en de fluorescentie wordt gedetecteerd door een gecommercialiseerde plaatlezer of de SPM die we bouwen. Drie verschillende deep learning-modellen, waaronder AlexNet, DenseNet-121 en EfficientNet-B7 met transfer learning, worden gebruikt om de fluorescentiebeelden te classificeren. Dit cijfer is hergebruikt met toestemming van Lei et al.35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Verwerking van monsters

  1. Neem Frog Virus 3 (FV3, geslachten Ranavirus, familie Iridoviridae), een dubbelstrengs DNA-virus. Selecteer het belangrijkste capside-gen (mcp) als doelwit voor de detectie van FV3, aangezien het sterk geconserveerd is en meestal wordt beschouwd als het doelwit voor de detectie van ranavirus. De gekozen doelsequentie is weergegeven in tabel 1.
    LET OP: Frog Virus 3 wordt in dit protocol als voorbeeld genomen.
  2. Gebruik voor de bereiding van doelwit-DNA-fragmenten DNA-fragmenten van het mcp-gen van FV3 en het infectieuze milt- en niernecrosevirus (ISKNV, een ander ranavirus).
    OPMERKING: In deze studie werden de doel-DNA-fragmenten commercieel verkregen van een bedrijf dat in de materiaaltabel staat vermeld. Ze worden beschouwd als het doelwit en de controle van de daaropvolgende detectie.
NaamVolgorde
FV3 MCPNTS: 5' ... gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTCGGTCGGCGTtcccaggtcg... 3' (240 bp)
TS: 5' ... ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc... 3' (240 bp)
ISKNV MCPNTS: 5' ... ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg... 3' (231 bp)
TS: 5' ... ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc... 3' (231 bp)

Tabel 1: Doelvolgorde geselecteerd in deze methode.

2. RPA-reactie

  1. Ontwerp en synthetiseer de RPA-primerparen voor de doelsequentie. De sequenties van RPA-primerparen worden beschreven in tabel 2.
  2. Bereid de 5x RPA-reactiebuffer (tabel 3) en MgCl2 (100 mM) voor.
  3. Meng de vier belangrijkste RPA-enzymen (UvsX, UvsY, GP32, Bsu-eiwit) in de 1x RPA-reactiebuffer, samen met de vooraf ontworpen primers, zoals beschreven in tabel 4.
  4. Draai het mengsel grondig.
  5. Voeg voor elke RPA-reactie 1 μL van het doel uit stap 1 toe en meng het grondig door opnieuw te vortexen.
  6. Voeg 7 μL MgCl2 (100 mM) toe om de reactie op gang te brengen. Het uiteindelijke volume van elke RPA-reactie is 50 μL.
  7. Voer de test uit bij 37 °C gedurende 30 minuten.
  8. Het RPA-product kan enkele dagen bij 4 °C worden bewaard. Naarmate RPA-producten verslechteren, gebruik het dan zo snel mogelijk voor verdere detectie om betere diagnoseresultaten te verkrijgen.
  9. [Optioneel] Voer DNA-gelelektroforese uit.
    1. Verwijder 5 μL RPA-producten, voeg een geschikt volume van 6x DNA-laadbuffer toe en voer DNA-gelelektroforese uit in de Tris-acetaat EDTA (TAE)-buffer.
    2. Laat de elektroforese ongeveer 20 minuten onder 120 V draaien totdat de banden van de laadbuffer de bodem van de gel bereiken.
    3. Bepaal of de doelsequentie met succes wordt versterkt uit het monster door de grootte van de banden van het monster te vergelijken met de banden van de marker.
NaamVolgorde
RPA primer FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA primer RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

Tabel 2: RPA-primers die bij deze methode worden gebruikt.

BestanddeelOorspronkelijke concentratieOptelling
PEG 20.000-114 mg
ATP100 mM125 μL
dNTP's25 mM48 μL
Tris-HCl1 miljoen125 μL
DTT1 miljoen125 μL
Fosfocreatine1 miljoen250 μL
Creatine kinase10 μg/μL50 μL
ddH2O-277 μL
Totaal volume-1 ml

Tabel 3: De samenstelling van de 5x RPA-reactiebuffer (pH 7,5).

BestanddeelOorspronkelijke concentratieOptelling
5x RPA-reactiebuffer-10 μL
UvsX-eiwit5 mg/ml2,6 μL
UvsY eiwit5 mg/ml0,9 μl
GP32-eiwit5 mg/ml2,54 μL
Bsu-eiwit5 mg/ml0,88 μL
Voorwaartse primer100 μM0,25 μL
omgekeerde primer100 μM0,25 μL
ddH2O-24,58 μL
Doel-1 μL
*MgCl2100 mM7 μL
Totaal volume50 μL
*MgCl2 moet als laatste worden toegevoegd om de RPA-reactie op gang te brengen.

Tabel 4: De samenstelling van de RPA-reactie.

3. CRISPR/Cas12a-detectie zonder SPM

  1. Gebruik de crRNA's (Table of Materials) van de doelsequentie en de ssDNA-reportersonde die een fluorofoor en een quencher verbindt voor CRISPR/Cas12a. Hier is carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) gekoppeld als de fluorofoor aan de 5'-uiteinden van ssDNA-reportersondes en Black Hole Quencher-2 (BHQ2) als de quencher aan de 3'-uiteinden. De gedetailleerde sequentie van crRNA en ssDNA reporter wordt beschreven in Tabel 5.
  2. Bereid het Lachnospiraceae-bacterie Cas12a (LbCas12a) eiwit voor met 10x CRISPR/Cas12a-reactiebuffer.
  3. Los 1 μL RPA-reactieproduct uit sectie 2 op in 1x CRISPR/Cas12a-reactiebuffer met LbCas12a-crRNA-complexen en 500 nM ssDNA-reportersonde in een reactievolume van 100 μL.
  4. Na het mengen van LbCas12a en crRNA, laat je het mengsel minstens 5 minuten staan om een functioneel complex te vormen. Voeg na de incubatie andere componenten toe aan het reactiemengsel en voer de hele reactie uit bij 37 °C. Het uiteindelijke volume van elke CRISPR/Cas12a-reactie is 100 μL. De gedetailleerde concentraties van elke component in elke CRISPR/Cas12a-reactie worden beschreven in tabel 6.
  5. Voer de 100 μL CRISPR/Cas12a-detectiereactie uit bij 37 °C gedurende 30 minuten.
  6. Onderzoek de fluorescentiesignalen constant door een microplaatlezer bij een excitatiegolflengte van 535 nm en een emissiegolflengte van 595 nm met een versterking van 60.
    OPMERKING: De detectie van verschillende golflengten van excitatie- en emissielicht hangt af van de keuze van de fluorofoor en quencher in de eerder ontworpen ssDNA-reportersondes.
  7. Deel voor deze verzamelde gegevens de controlewaarde door de meting van de positieve monsters om alle gegevens te normaliseren en integreer ze vervolgens voor een T-testanalyse met twee steekproeven.
NaamVolgorde
LbCas12a crRNA voor FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
ssDNA verslaggever/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tabel 5: Sequenties van CRISPR/Cas12a crRNA en ssDNA-reporter gebruikt in deze methode.

BestanddeelOorspronkelijke concentratieOptelling
NEBuffer r2.1-10 μL
Lba Cas12a (CPF1)10 μM0,5 μL
crRNA10 μM0,625 μL
Wacht minstens 5 minuten om het LbCas12a/crRNA-complex te laten combineren.
DNA-verslaggever100 μM0,5 μL
ddH2O-87.375 μL
Doel-1 μL
Totaal volume-100 μL

Tabel 6: De samenstelling van de CRISPR/Cas12a-reactie.

4. SPM-instelling

  1. Stel voor het excitatiepad een laserstraal in om door de filters met neutrale dichtheid (ND) te gaan om de laserintensiteit te verzwakken.
  2. Genereer een gecollimeerde straal van een asferische lens (hierna L1 genoemd) en reflecteer deze door de dichroïsche spiegel (DM).
  3. Richt het licht op het glasplaatje waar het monster door het objectief wordt geplaatst (20x) om de fluorescentie van het monster te verlichten en te prikkelen. De monstertafel maakt een nauwkeurige aanpassing van het brandpuntsvlak mogelijk, waarbij de straal naar het achterste brandpuntsvlak van het objectief wordt gericht. De hierboven genoemde stappen vormen het excitatiepad van het SPM-instrument.
  4. Plaats voor het emissiepad een externe lens (hierna L2 genoemd) om een tussenliggend beeld aan de andere kant van het objectief te vormen. Het objectief verlicht tegelijkertijd het monster en verzamelt het zendsignaal.
  5. Neem het fluorescentiesignaal van het monster op met behulp van de smartphone die aan het einde van het emissiepad is geplaatst. Gebruik een stabiele beugel om schudden te voorkomen.
  6. Stel een banddoorlaatfilter in tussen L1 en de camera van de smartphone om het opgewonden licht weg te filteren, terwijl alleen het uitgezonden licht van het monster de camera bereikt, wat de detectie kan optimaliseren.
  7. Immobiliseer de SPM-opstelling op een breadboard voor draagbare implementatie.
    OPMERKING: Het schema en het fysieke uiterlijk van het SPM-apparaat voor fluorescentiedetectie op basis van de RPA-CRISPR/Cas12a-reactie worden weergegeven in afbeelding 2. De CRISPR/Cas12a-detectie vindt plaats op het voorbehandelde objectglaasje dat in de volgende stap wordt beschreven.

figure-protocol-1
Figuur 2: Schematisch en fysiek uiterlijk van het SPM-apparaat dat wordt gebruikt voor fluorescentiedetectie. (A) Het fysieke uiterlijk van het SPM-apparaat voor het verzamelen van fluorescentiebeelden na de RPA-CRISPR/Cas12a-reactie. (B) Schema van het SPM-apparaat voor fluorescentiedetectie op basis van de RPA-CRISPR/Cas12a-reactie. Deze figuur is aangepast (aangepaste beeldpositie en kleur) met toestemming van Lei et al.35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Behandeling van glasplaatje voor detectie met SPM

  1. Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) voor door de basis en het uithardingsmiddel te mengen in een verhouding van 10:1, gevolgd door 2 uur op een kookplaat bij 80 °C te bakken.
  2. Behandel zowel PDMS als het objectglaasje (Lengte: 75 mm; Hoogte: 50 mm) met zuurstofplasmabehandeling gedurende 120 s, druk ze vervolgens samen.
  3. Bak het glas/PDMS 2 uur op 95 °C; het is permanent verzegeld door de Si-O-Si-binding. PDMS heeft een hoge transparantie en geen autofluorescentie, wat bevorderlijk is voor SPM-detectie. De behandeling van het glasplaatje en PMDS wordt uitgevoerd volgens He et al.32

6. CRISPR/Cas12a-detectie met SPM

  1. Gebruik de crRNA's (Table of Materials) van de doelsequentie en de ssDNA-reportersonde die een fluorofoor en een quencher verbindt voor CRISPR/Cas12a. In deze methode is carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) gekoppeld als de fluorofoor aan de 5'-uiteinden van ssDNA-reportersondes en Black Hole Quencher-2 (BHQ2) als de quencher aan de 3'-uiteinden. De gedetailleerde sequentie van crRNA en ssDNA reporter wordt beschreven in Tabel 5.
  2. Bereid het Lachnospiraceae-bacterie Cas12a (LbCas12a) eiwit voor met 10x CRISPR/Cas12a-reactiebuffer.
  3. Los 1 μL RPA-reactieproduct uit sectie 2 op in 1x CRISPR/Cas12a-reactiebuffer met LbCas12a-crRNA-complexen en 500 nM ssDNA-reportersonde in een reactievolume van 100 μL.
  4. Na het mengen van LbCas12a en crRNA, laat je het mengsel minstens 5 minuten staan om een functioneel complex te vormen. Voeg na incubatie andere componenten toe aan het reactiemengsel en voltooi de reactie bij 37 °C. Het uiteindelijke volume van elke CRISPR/Cas12a-reactie is 100 μL. De gedetailleerde concentraties van elke component in elke CRISPR/Cas12a-reactie worden beschreven in tabel 6.
  5. Voer de 100 μL CRISPR/Cas12a-detectiereactie uit op het voorbehandelde glasplaatje en dek het af met een dekglaasje. Incubeer het objectglaasje met reactie bij RT gedurende 10 min.
  6. Meet de fluorescentiesignalen aan de hand van de SPM. Plaats het glasplaatje met de detectiereactie op de tafel van de SPM, houd de juiste afstand, pas de brandpuntsafstand en helderheid aan, zoek vervolgens naar het gezichtsveld van de reactie en stel deze scherp om een beeld vast te leggen.
    OPMERKING: Er moet eerst een standaardcurve worden verkregen, zodat de gegevens van de monsters kunnen worden geschaald naar het geschatte concentratiebereik. Er worden verschillende concentraties van gezuiverde doelen gebruikt, waaronder 10 nM, 1 nM, 100 pM en 10 pM, een ander virus als negatieve controle (vóór RPA).

7. Dataset en gegevensvergroting

  1. Verzamel de fluorescentiebeelden van de detectietest in sectie 6 als de datasets. Herhaal ten minste drie parallelle detecties voor elke steekproef om gegevensparallelliteit te garanderen.
    1. Enkele geschikte manieren om een hoger parallellisme te bereiken, kunnen worden goedgekeurd. Wanneer u bijvoorbeeld de fluorescentiebeelden van elk monster verzamelt, stelt u handmatig scherp en zoekt u naar een relatief helderder veld om foto's te maken. Fotografeer tegelijkertijd elk monster om het fluorescentiesignaal op meer dan vijf verschillende locaties te bereiken.
  2. Meet de gemiddelde grijswaarde van elke afbeelding en de standaarddeviatie van de gemiddelde grijswaarde in een concentratiegroep door ImageJ.
  3. Stel een intensiteitsbereik in [mediaan - standaarddeviatie, mediaan + standaarddeviatie] voor het opschonen van gegevens.
    OPMERKING: In de afbeeldingen die in de eerste stappen zijn verkregen, kunnen er afbeeldingen zijn met grote verschillen, dus het is noodzakelijk om de afbeeldingen te screenen. Als de intensiteit van de beelden buiten de ingestelde drempel ligt, moeten ze als uitschieters worden beschouwd en worden uitgesloten.
  4. Label de afbeeldingen voor het gezuiverde doel in toenemende concentraties met respectievelijk 0-6 in oplopende volgorde.
  5. Om de robuustheid van het systeem te verbeteren en overfitting te voorkomen, implementeert u beeldvergrotingstechnieken zoals horizontaal spiegelen, verticaal spiegelen en willekeurige ruis door middel van transformatiefuncties in Python. Dit helpt om variaties in de dataset te introduceren.

8. Leren overdragen

  1. Gebruik als backbone-netwerk het deep learning-model AlexNet33 voor classificatie.
  2. Om te voldoen aan de beperking van het vooraf getrainde model in sectie 7, wijzigt u de vorm van de invoerafbeeldingen in 224 pixels x 224 pixels x 3 kanalen (hoogte en breedte van 224 pixels en een diepte van 3 kanalen voor de rode, groene en blauwe kleurkanalen) via transformatiefuncties in Python.
    OPMERKING: Deze stap is een veelgebruikte voorverwerking voor heterogene gegevens in transfer learning, inclusief transformatie.
  3. Gebruik een vooraf getraind backbone-netwerk met de ImageNet-gegevensset om functies te extraheren terwijl u gebruikmaakt van de gewichten van tussenliggende verborgen lagen die zijn geleerd.
  4. In de context van de fluorescentieclassificatie vervangt u de laatste volledig verbonden laag van het neurale netwerk, die oorspronkelijk 1000 neuronen bevatte voor de ImageNet-taak, door een volledig verbonden laag met 2 of 7 neuronen.
  5. Evalueer de prestaties van het setup-trainingsmodel met behulp van een reeks metrische gegevens, waaronder verwarringsmatrix, nauwkeurigheid, precisie, herinnering en F1-score op basis van Lawton en Viriri34.

Resultaten

Deze methode richt zich op een snel, eenvoudig te implementeren, zeer gevoelig en point-of-care (POC) detectiesysteem voor DNA-virussen. Het ontwerp van primerparen voor de RPA-reactie en het crRNA-ontwerp voor de CRISPR/Cas12a-reactie zijn twee van de essentiële onderdelen, aangezien ze de efficiëntie van de RPA-CRISPR/Cas12a-reactie zullen beïnvloeden en de daaropvolgende detectie en classificatie zullen beïnvloeden.

In deze methode wordt FV3 beschouwd als een voorbeeld van DNA-virusdetectie. Sommige RPA-primerparen voor FV3 zijn ontworpen, en de meest efficiënte wordt gekozen en ervoor gezorgd dat deze een goede versterkingsefficiëntie vertoont, wat kan worden bevestigd door de helderheid en grootte van de banden te garanderen door middel van gelelektroforese van de RPA-producten zoals vermeld in stap 2.8. Tegelijkertijd hebben we CRISPR/Cas12a crRNA's ontworpen en de meest efficiënte gekozen op basis van het sterkere fluorescentiesignaal dat wordt geactiveerd bij een CRISPR/Cas12a-reactie zonder RPA. De volgorde van de drie voorwaartse en drie achterwaartse primers voor RPA en drie crRNA voor Cas12a wordt weergegeven in Tabel 7. Op basis van de resultaten van de agarosegelelektroforese in figuur 3 geeft het6e paar primers een betere versterkingsefficiëntie (F2 en R1), die voor de methode is geselecteerd. Zoals te zien is in figuur 4, is crRNA-3 het meest efficiënt voor collaterale splitsing, die in de methode wordt geselecteerd.

RPA primer F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG
RPA primer F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA primer F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGT
RPA primer R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG
RPA primer R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA
RPA primer R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT

Tabel 7: De RPA-primers en crRNA-sequenties voor reactie-optimalisatie.

figure-results-1
Figuur 3: Resultaten van agarosegelelektroforese voor beoordeling van de RPA-efficiëntie. De RPA-reacties werden uitgevoerd met behulp van verschillende combinaties van primers onder dezelfde conditie met een gezuiverd doel van 1 nM. Nummer 1 werd beschouwd als de combinatie van RPA-F3 en RPA-R3, 2 als RPA-F3 en RPA-R2, 3 als RPA-F3 en RPA-R1, 4 als RPA-F2 en RPA-R3, 5 als RPA-F2 en RPA-R2, 6 vertegenwoordigde RPA-F2 en RPA-R1, 7 als RPA-F1 en RPA-R3, 8 als RPA-F1 en RPA-R2, 9 als RPA-F1 en RPA-R2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Detectie van de FV3-doelfragmenten met drie verschillende crRNA's door de CRISPR/Cas12a. De concentraties van gezuiverde fragmenten die in de detectie werden toegepast, varieerden van 10 nM tot 100 pM doel-DNA versus 10 nM controle-DNA met 30 minuten incubatie. Dit cijfer is hergebruikt met toestemming van Lei et al.35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de gegevens in figuur 5 te genereren, hebben we geoptimaliseerde RPA-primers, crRNA en de SPM-opstelling toegepast. Om een beter idee te krijgen van de concentratie in de monsters, hebben we 240 bp DNA-fragmenten van het sterk geconserveerde major capside (MCP) gen van FV3 en infectieus milt- en niernecrosevirus (ISKNV, Iridoviridae) geamplificeerd als doelwit en controle via een PCR-amplificatiekit, die wordt uitgevoerd volgens de procedures die worden weergegeven in tabel 8. De grootte van het geamplificeerde DNA wordt bevestigd door middel van agarosegelelektroforese en we hebben het gezuiverde dsDNA-doelwit en de controle uit de gel geëxtraheerd. De gezuiverde DNA-fragmenten worden gekwantificeerd met behulp van een NanoDrop 2000 spectrofotometer.

figure-results-3
Figuur 5: De fluorescentiebeelden van gezuiverd doelwit-DNA en controle-DNA. (A) De negatieve controle. (B) Gezuiverd doelwit-DNA (100 pM). Dit cijfer is hergebruikt met toestemming van Lei et al.35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PodiumTemperatuur (°C)TijdCyclus(sen)
Hete start955 min1
Denaturatie95jaren '30 seconden35
Annealing6045 seconden
Extensie72jaren '30 seconden
Extensie725 min1
Opslag4--

Tabel 8: De procedure van de PCR-amplificatie.

Alleen ter referentie wordt een dataset met 162 fluorescentiebeelden verkregen na het opschonen van de gegevens. Het aantal fluorescentiebeelden voor verdere analyse moet worden uitgebreid en we hebben de dataset getraind door 337 fluorescentiebeelden te gebruiken voor binaire classificatie en 398 voor multiclass-classificatie.

We bereikten detectie binnen ongeveer 40 minuten, inclusief 30 minuten voor RPA-versterking en 10 minuten voor LbCas12a-detectie na RPA. Bij gebruik van het ontwikkelde detectiesysteem met geselecteerde RPA-primers en crRNA vertoont de signaalintensiteit van 10 aM FV3 en controle significante verschillen, zoals weergegeven in aanvullende figuur 1.

Aanvullende figuur 1: De statistieken van de signaalintensiteit voor fluorescentiebeelden verzameld in RPA-LbCas12a-reacties met verschillende concentraties van gezuiverde fragmenten. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001; : p < 0,0001; F: FV3, I: ISKNV; A.U.: Absorptie-eenheid. Dit cijfer is hergebruikt met toestemming van Lei et al.35. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In deze methode ontwikkelen we een snel, eenvoudig te implementeren, zeer gevoelig, sequentiespecifiek en POC DNA-virusdetectiesysteem met AI-assistentie. Na het verkrijgen van monsters wordt RPA toegepast om de doelsequentie te versterken, en vervolgens kan CRISPR/Cas12a het doel-DNA herkennen en fluorescentie afgeven, waardoor het detectiesignaal wordt vergroot. Draagbare smartphonemicroscopie is gebouwd om fluorescentiebeelden te maken, en deep learning-modellen met transfer learning worden gebruikt voor binaire classificatie van de beelden van de positieve en negatieve monsters. FV3 wordt in deze methode als positief monster genomen en vervolgens vanuit meerdere perspectieven onderzocht om de specificiteit en gevoeligheid van het voorgestelde systeem te verbeteren.

De eerste strategie is het ontwerpen van specifieke RPA-primers en het zeven van de meest efficiënte primers. De versterkingsefficiëntie van de RPA-reactie wordt beïnvloed door verschillende primers36. De specificiteit van de primers die worden gebruikt om het doelgen van de DNA-virusstammen te amplificeren, kan worden bevestigd door te stralen tegen de standaarddatabase van nucleotidesequencing. Aangezien er geen handleiding is voor het ontwerpen van efficiënte RPA-primerparen, is experimentele validatie vereist37.

Een andere benadering is om het crRNA van het doelvirus te ontwerpen voor CRISPR/Cas12a-reactie, aangezien de collaterale splitsingsefficiëntie aanzienlijk bijdraagt aan de detectiegevoeligheid 38,39. De sterkte van het getriggerde fluorescentiesignaal in de CRISPR/Cas12a-reactie zonder RPA moet in overweging worden genomen bij het selecteren van het betere crRNA. Bovendien wordt de collaterale activiteit van het LbCas12a-eiwit constant geactiveerd gedurende 24 uur32, wat de detectie ten goede kan komen.

Voor het identificeren van virussen en het visualiseren van virale deeltjes is fluorescentiemicroscopie toegepast40,41. Conventionele microscopie is echter omslachtig en prijzig voor een snelle POC-diagnose. In het voorgestelde systeem wordt dus een draagbare SPM met lagere kosten gebouwd om het fluorescentiesignaal te bereiken door de beelden vast te leggen voor POC-detectie. Een dergelijke draagbare SPM kost veel minder dan een gecommercialiseerde plaatlezer of real-time PCR-machine, wat kostenvriendelijk is voor het instellen van een detectiesysteem.

Dit voorgestelde platform moet ook op sommige punten verder worden verbeterd. Bij het toepassen van dit detectieplatform op andere DNA-virusdetectie, moeten zowel de RPA-primer als de Cas12a-crRNA-sequentie opnieuw worden ontworpen. Aangezien er geen handleiding is voor hun ontwerp, moeten experimenten worden uitgevoerd om hun efficiëntie te evalueren. Hoewel het voorgestelde systeem kan voldoen aan de voordelen van draagbaarheid, moet de grootte van het hele systeem nog verder worden verkleind om een lichter systeem te verkrijgen. Omdat de camera van de mobiele telefoon zelf niet gemakkelijk kan worden scherpgesteld voor opnamen op korte afstand, kost het tijd om zich aan te passen tijdens het verkrijgen van fluorescerende beelden, inclusief het gezichtsveld, voor beelden met een betere kwaliteit.

Met de vooruitgang in gerelateerde technologie en nieuwe toepassingen daarvan, zal de efficiëntie van POC-detectie blijven verbeteren. De hier gepresenteerde methode is een voorbeeld van een verbetering die kan helpen bij POC-detectie op basis van het CRISPR/Cas12a-systeem en het SPM-platform, met nieuwe AI-hulp. Bovendien kan het geïntegreerde systeem worden gebruikt om elk DNA-doelwit te identificeren vanwege de herprogrammeerbaarheid van het crRNA. Het RPA-CRISPR/Cas12a-AI-systeem zal een belangrijke positie innemen bij de identificatie van DNA-pathogenen in termen van detectiegevoeligheid, specificiteit, tijd en betrouwbaarheid.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 31970752, Science, Technology, Innovation Commission of Shenzhen Municipality JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Open financiering van het Shenzhen Bay Laboratory, SZBL2020090501004; Stichting voor postdoctorale wetenschappen van China 2020M680023; en Algemene Administratie van de Douane van de Volksrepubliek China 2021HK007.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
20x versterkingOLYMPUSOPLN20X
532 nm groene laserThorlabsPL201met 0,9 mW uitgangsvermogen
535 nm doorsnijwellengtechromeAT535
6x DNA laadbufferThermo scientificR0611
96-well zwarte microplaatCorning Incorporated3603Zwart met platte heldere bodem
Asferatische lensLubangN/A
Bandpass filterSEMROCKFF01-542/27-25
Bsu DNA PolymeraseATG BiotechnologyM103Groot fragment
crRNASangon BiotechN/A
DNA fragmentenSangon BiotechN/A
Dichroische houdersRuicageN/A
Dichroische spiegelSEMROCKFF555-Di03-25x36met een doorsnijwellengte van 535 nm
E.Z.N.A Gel Extractie KitOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
Filter houdersRuicageN/A
Fluorofoor-ssDNA-Quencher reporter sondesSangon BiotechN/ATAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) als de fluorofoor op de 5 uiteinden; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) als de quencher op de 3 uiteinden
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJOpen-sourceVersie 1.53t 24Gedownload van https://imagej.nih.gov/ij/ 
Microplaat lezerSPARK, TECANN/A
Multi-Block thermische Cycler PCR instrumentLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c SpectrofotometersThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Reactie buffer
Oxygen plasma behandeling Electro-Technic  ProductenN/A
Pathogeen Inactivatie, Nucleïnezuur extractie-vrij, Direct-to-PCR Buffer met Proteinase K (PINDBK)EbioPINDBK -25mL
PCR primer paartjesSangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
RPA primer paartjesSangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
TranslatietrapjesRuicageN/A
Doorgelaten neutrale dichtheidsfiltersThorlabsND40A
Tripel achromatische lenzenThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106

Referenties

  1. Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
  2. The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study. Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).
  3. Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. Middle East respiratory syndrome. Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).
  4. Plourde, A. R., Bloch, E. M. A literature review of Zika virus. Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).
  5. Yuan, X., et al. Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19. ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).
  6. Minhaj, F. S., et al. Monkeypox outbreak - nine states, May 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).
  7. Bao, M., et al. Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing. ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).
  8. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  9. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  10. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  11. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  12. Mukama, O., et al. An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids. Biosens Bioelectron. 159, 112143(2020).
  13. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  14. Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives. Biosens Bioelectron. 193, 113541(2021).
  15. Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review). Biosens Bioelectron. 175, 112867(2021).
  16. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).
  17. Kumar, M., et al. FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip. eLife. 10, e67130(2021).
  18. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  19. Ganguli, A., et al. Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care. Biomed Microdevices. 19 (4), 73(2017).
  20. Yeo, S. J., et al. Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses. Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).
  21. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nat Commun. 12 (1), 2276(2021).
  22. Shiaelis, N., et al. Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning. ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).
  23. Liu, Y., et al. Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference. Front. Comput. Sci. 4, 1036934(2022).
  24. Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. AI-assisted forward modeling of biological structures. Front Cell Dev Biol. 7, 279(2019).
  25. Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification. IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).
  26. Zhang, R., et al. RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia. Comput Biol Med. 150, 106084(2022).
  27. Xie, Y., et al. Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network. Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).
  28. Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -D. A review of deep learning on medical image analysis. Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).
  29. Artoni, P., et al. Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).
  30. Li, J., et al. DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology. Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).
  31. Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. How transferable are features in deep neural networks. Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).
  32. He, Q., et al. High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system. Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).
  33. Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. ImageNet classification with deep convolutional neural networks. Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).
  34. Lawton, S., Viriri, S. Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning. Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).
  35. Lei, Z., et al. Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning. ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).
  36. Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay. Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).
  37. Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella. Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).
  38. Habimana, J. D., et al. Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review. Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).
  39. Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay. Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).
  40. Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy. Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).
  41. Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton. Viruses. 10 (4), 166(2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Point of caresmartphone microscopiedeep learning modelFrog Virus 3fluorescentiedetectiecollaterale splitsingbeeldclassificatiebepaling van de virale load

Gerelateerde artikelen