Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Intra-peritoneale transplantatie voor het genereren van acute myeloïde leukemie bij muizen

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64834

⸱

6 januari 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt intra-peritoneale injectie van leukemiecellen gebruikt om acute myeloïde leukemie (AML) bij muizen vast te stellen en te verspreiden. Deze nieuwe methode is effectief bij de seriële transplantatie van AML-cellen en kan dienen als een alternatief voor diegenen die problemen en inconsistenties kunnen ervaren met intraveneuze injectie bij muizen.

Samenvatting

Er is een onvervulde behoefte aan nieuwe therapieën voor de behandeling van acute myeloïde leukemie (AML) en de bijbehorende terugval waarbij persistente leukemiestamcellen (LSC's) betrokken zijn. Een experimenteel AML-knaagdiermodel om therapieën te testen op basis van het succesvol transplanteren van deze cellen via retro-orbitale injecties in ontvangende muizen is beladen met uitdagingen. Het doel van deze studie was om een eenvoudige, betrouwbare en consistente methode te ontwikkelen om een robuust muizenmodel van AML te genereren met behulp van een intra-peritoneale route. In het huidige protocol werden beenmergcellen getransduceerd met een retrovirus dat humaan MLL-AF9-fusie-oncoproteïne tot expressie brengt. De efficiëntie van afstammingsnegatieve (Lin-) en Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populaties als donor-LSC's bij de ontwikkeling van primaire AML werd getest en intra-peritoneale injectie werd aangenomen als een nieuwe methode om AML te genereren. Vergelijking tussen intra-peritoneale en retro-orbitale injecties werd gedaan in seriële transplantaties om de twee methoden te vergelijken en te contrasteren. Zowel Lin- als LSK-cellen getransduceerd met humaan MLL-AF9-virus goed geënt in het beenmerg en de milt van ontvangers, wat leidt tot een volledige AML. De intra-peritoneale injectie van donorcellen vestigde AML in ontvangers bij seriële transplantatie en de infiltratie van AML-cellen werd gedetecteerd in het bloed, beenmerg, milt en lever van ontvangers door flowcytometrie, qPCR en histologische analyses. Intra-peritoneale injectie is dus een efficiënte methode van AML-inductie met behulp van seriële transplantatie van donorleukemische cellen.

Inleiding

Acute myeloïde leukemie (AML) is een vorm van hematologische maligniteit van diverse etiologie met een slechte prognose1. De generatie van AML-diermodellen legt de basis voor het begrijpen van de complexe variaties en pathobiologie in een poging om nieuwe therapieën te ontdekken2. Leukemogenese bij muizen omvat de transplantatie van donorcellen die fusie-oncoproteïnen tot expressie brengen, inclusief fusies waarbij het gen voor gemengde afstammingsleukemie (MLL) betrokken is om AML krachtig te induceren, om de ziekte bij mensen na te bootsen3. Verschillende cellulaire oorsprong van donorcellen zijn gemeld bij de transplantatie van MLL-gen-geassocieerde AML4, waarbij zeer weinig bekend is over de cellen die verantwoordelijk zijn voor de oorsprong van de ziekte.

Er zijn meerdere routes ontwikkeld voor transplantatie bij muizen; in plaats van een intrafemorale injectie, die direct gemuteerde donorcellen in beenmerg5 introduceert, is een intraveneuze injectie die gebruik maakt van de veneuze sinusplexus, staartader en halsader op grote schaal gebruikt om murine AML-modellen 6,7,8,9 te genereren. In het geval van retro-orbitale (r.o.) injectie zijn verschillende inherente nadelen, zoals volumebeperking, hoge technische vraag, weinig kans op herhaalde pogingen of fouten, en potentieel oogletsel, grote struikelblokken geweest met beperkte of geen haalbare alternatieven7. Staartaderinjectie kan vergelijkbare problemen hebben naast lokale verwondingen; Om de procedure te vergemakkelijken, moeten muizen vaak worden opgewarmd om hun staartaders te verwijden10. Het is ook moeilijk om de staartader te lokaliseren zonder een extra lichtbron, vooral in de C57BL / 6-muizenstam. Voor jugulaire aderinjectie heeft onderzoekspersoneel voldoende training nodig om de ader te lokaliseren en mogelijke complicaties te beperken. Bovendien moeten zowel veneuze sinus- als halsaderinjecties onder anesthesie worden uitgevoerd, wat een ander niveau van complexiteit toevoegt. Het is dus verleidelijk om nieuwe routes voor transplantatie te verkennen om de oprichting van AML-muizenmodellen te vergemakkelijken.

Intra-peritoneale (i.p.) injectie wordt vaak gebruikt voor het toedienen van geneesmiddelen, kleurstoffen en anesthetica 11,12,13,14,15; Het is ook gebruikt om hematopoëtische cellen te introduceren voor ectopische hematopoëse16 en om van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen te transplanteren in verschillende muismodellen 17,18,19,20,21. Het is echter niet vaak gebruikt om hematopoëtische maligniteiten bij muizen vast te stellen, met name om de progressie van de AML-ziekte te bestuderen.

De huidige studie beschrijft de haalbaarheid van i.p. injectie bij het genereren van AML-muismodellen, naast het vergelijken van de transplantatie-efficiëntie van afstammingsnegatieve (Lin-) en Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populaties als donorcellen. Deze bevindingen bieden een eenvoudige en efficiënte manier om experimentele modellen van AML en gerelateerde myeloïde leukemieën te genereren. Een dergelijke methode heeft het potentieel om ons begrip van de ziektemechanismen te vergroten en een relatief eenvoudig model te bieden om experimentele therapieën te testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden vooraf goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Pennsylvania State University.

1. Bereiding van buffers en reagentia

  1. Bereid ampicilline aangevulde (AP) LB agar platen (steriele 10 cm platen). Los hiervoor 10 g LB-bouillon met agar op in 400 ml gedestilleerd water, roer en breng het volume op 500 ml. Steriliseer de oplossing door autoclaveren, laat de oplossing vervolgens afkoelen, voeg 0,5 ml ampicilline (bouillon: 150 mg / ml) toe aan de oplossing en schud deze om te mengen. Voeg onmiddellijk 18 ml oplossing toe aan een steriele plaat van 10 cm in de buurt van een alcohollamp, laat stollen bij kamertemperatuur en bewaar de platen ondersteboven bij 4 °C tot verder gebruik.
  2. Bereid LB-media door 10 g LB zonder agar op te lossen in 500 ml gedestilleerd water. Steriliseer de oplossing door autoclaveren, laat de oplossing afkoelen, voeg 0,5 ml ampicilline (bouillon: 150 mg / ml) toe aan de oplossing en schud het om te mengen.
  3. Bereid de stroombuffer voor door 5 ml penicilline/streptomycine en 10 ml warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (hiFBS) toe te voegen aan 485 ml 1x dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS).
    OPMERKING: Om FBS te inactiveren door verhitting, plaatst u ontdooide FBS-flessen in een waterbad van 56 °C. Zorg ervoor dat de flessen niet omvallen of anderszins ondergedompeld raken in het waterbad. De temperatuur is van cruciaal belang voor volledige degradatie; om dit te garanderen, wacht tot de temperatuur stabiliseert op 56 °C nadat u de flessen in het waterbad hebt geplaatst. Draai de flessen drie keer om de 10 minuten voorzichtig rond. Laat het serum niet langer dan 30 minuten incuberen.
  4. Bereid onderhoudsmedia voor door 50 ml hiFBS, 5 ml L-glutamine en 5 ml penicilline / streptomycine toe te voegen aan 440 ml dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM). Bereid transfectiemedia voor door 50 ml hiFBS en 5 ml L-glutamine toe te voegen aan 445 ml DMEM-media.
  5. Bereid rode bloedcel (RBC) lysisbuffer door 4,145 g NH4Cl, 0,504 g NaHCO3 en 16,81 mg ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water. Bereid onvolledige Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM) media door 75 ml hiFBS, 5 g runderserumalbumine (BSA), 0,5 ml 10 mg / ml insuline, 2,5 ml 4 mg / ml holo-transferrine, 3,5 μl β-mercaptoethanol, 5 ml L-glutamine en 0,5 ml ciprofloxacine toe te voegen aan 416,5 ml IMDM-media.
  6. Bereid 10 ml 2x IMDM-media, waarin de concentratie cytokines tweemaal de hoeveelheid in 1x IMDM-media is, door toevoeging van 10 μL 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL 10 mg/ml insuline, en 50 μl van 4 mg/ml holo-transferrine in 9,87 ml onvolledige IMDM-media.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de stroombuffer, RBC-lysisbuffer, onderhoudsmedia, transfectiemedia en onvolledige IMDM-media vóór gebruik worden gesteriliseerd.

2. Plasmide transformatie

  1. Ontdooi 20 μL van α-Select competente cellen op ijs. Voeg 1 μL (~2 ng) MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmide22 toe aan ontdooide competente cellen en meng voorzichtig door op de buis te tikken. Incubeer de reactie op ijs gedurende 30 minuten.
  2. Hitteschok van het mengsel door incubatie gedurende 40 s in een verwarmingsblok van 42 °C. Breng de buis onmiddellijk gedurende 2 minuten op ijs.
  3. Voeg 1 ml LB-media (zonder ampicilline) toe aan de buis en schud bij 37 °C en 200 tpm gedurende 1 uur.
  4. Centrifugeer de buis bij kamertemperatuur bij 500 x g gedurende 4 minuten en gooi 0,9 ml supernatant weg. Suspendeerde het neerslag in de resterende 0,1 ml LB-media.
  5. Verdeel de getransformeerde competente cellen over voorverwarmde (37 °C) AP LB agarplaten. Incubeer de plaat ondersteboven bij 37 °C gedurende 12-16 uur.
  6. Kies een enkele kolonie en gebruik de getransformeerde cellen in 10 ml AP LB-media gedurende een nacht bij 37 °C en 200 tpm.
  7. Voeg 5 ml verbruikte getransformeerde competente cellen toe aan 500 ml AP LB-media in een kolf en incubeer de kolf gedurende een nacht bij 37 °C en 200 tpm.
  8. Extraheer het plasmide met behulp van een plasmide-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant en resuspensie in 0,5 ml geautoclaveerd ultrapuur water. Kwantificeer het plasmide met behulp van een spectrofotometer.

3. Transfectie van Phoenix Ecotropic (pECO) cellen

  1. Kweek 2 x 106 pECO-cellen/plaat in onderhoudsmedia in platen van 10 cm in een bevochtigde 5% CO 2-incubator bij 37 °C. Zorg ervoor dat de pECO-cellen in exponentiële groeifase worden gehouden en actief delen voordat ze worden doorgegeven.
  2. Wanneer de cellen 80% confluent worden, was de platen tweemaal met 5 ml DPBS, voeg 1 ml trypsine toe aan de plaat en incubeer in een bevochtigde 5% CO 2-incubator bij 37 ° C gedurende2 minuten. Oogst de cellen met 5 ml onderhoudsmedia in een steriele buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 4 °C en 400 x g . Resuspensie van de celpellet in 5 ml onderhoudsmedia.
  3. Meng 10 μL celsuspensie en 10 μL trypanblauw en laad 10 μL op een hemocytometer om de cellen te tellen.
    Totaal cellen/ml = (totaal aantal cellen geteld x Verdunningsfactor x 104 cellen/ml)/ Aantal getelde kwadraten)
    Zaai 2 x 106 cellen/schaal in schaaltjes van 6 cm met 5 ml onderhoudsmedia voor transfectie en kweek de cellen in een bevochtigde 5% CO 2-incubator bij 37 °C.
  4. Vervang de onderhoudsmedia door 5 ml transfectiemedia wanneer de cellen na 18 uur cultuur 50% -60% confluent worden.
  5. Bewaar het transfectiereagens gedurende ten minste 30 minuten vóór de transfectie op kamertemperatuur.
  6. Voeg 5,5 μg MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmide22 toe aan 0,5 ml gewone DMEM-media in een steriele buis van 1,5 ml. Meng het voorzichtig door op de buis te tikken en laat het 10 minuten zitten.
  7. Voeg 14,6 μL (3x de hoeveelheid plasmide; v/g) transfectiereaag toe aan de buis en tik drie keer om de 10 minuten zachtjes op de buis.
  8. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan alle delen van de gerechten met de pECO-cellen in transfectiemedia. Beweeg de gerechten 10 keer voorzichtig naar voren en naar achteren en 10 keer zijwaarts. Incubeer de gerechten in een bevochtigde 5% CO 2-incubator bij 37 °C gedurende 48 uur.
  9. Meet de transfectie-efficiëntie door florescentiemicroscopie en flowcytometrie voor groen fluorescerend eiwit (GFP) zoals beschreven in22. De cellen worden eerst gated op FSC-A/FSC-H en FSC-A en SSC-A om singlets te verkrijgen. De GFP+ populatie is gated op FL1 plot door deze te vergelijken met niet-getransfecteerde cellen.
  10. Verzamel en filter de supernatanten door een spuitfilter van 0,45 μm in een steriele buis van 50 ml. Gebruik de supernatanten onmiddellijk voor transductie of vries ze in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: pECO-cellen moeten op de juiste manier worden gemengd en gelijkmatig in gerechten worden gezaaid. Laat de cellen zich verspreiden door de gerechten 10 keer naar voren en naar achteren te bewegen en 10 keer zijwaarts tijdens het zaaien. Het celnummer dat moet worden gezaaid, kan variëren afhankelijk van de variaties in het tellen. Om het optimale aantal zaaicellen te vinden dat 50% -60% samenvloeiing kan bereiken na 18 uur cultuur, is het nuttig om cellen met seriële verdunningen te zaaien.

4. Lentivirale transductie

  1. Euthanaseer 8-10 weken oude CD45.1 vrouwelijke C57BL6/J-muizen (twee tot drie donormuizen per ontvangende muis) in een CO2-kamer .
  2. Steriliseer het hele lichaam van de muizen met 70% ethanol. Plaats de muizen op een steriele chirurgische pad op een piepschuimen bord en speld de benen door de muispootkussens.
  3. Knip de huid boven de buikholte bij de middellijn en verbreed de onderhuidse ruimte naar de achterpoten met een steriele schaar met een scherpe steriele schaar.
  4. Verleng de incisie van de buiklijn tot aan de enkels. Verbreed de onderhuidse ruimte onder de achterpoten met de messen van een steriele schaar met een scherp uiteinde.
  5. Knip de achillespees door met een steriele schaar. Houd de pees vast met een tang met tanden en snijd het andere uiteinde af dat aan het dijbeen is bevestigd om de gastrocnemiusspier te verwijderen.
  6. Knip de quadricepspees die aan de knie is bevestigd met een steriele schaar met een scherp uiteinde. Houd de pees vast met een tang met tanden en snijd de spierkoppen die aan het dijbeen zijn bevestigd om de gastrocnemiusspier te verwijderen.
  7. Knip de andere spieren rond het dijbeen aan het einde die aan het scheenbeen zijn bevestigd met een steriele schaar met een scherp uiteinde.
  8. Knip de enkel af met een steriele schaar met een scherp uiteinde en zorg ervoor dat het scheenbeen intact blijft. Houd het distale uiteinde van het dijbeen vast met een tang met tanden en knip het heupgewricht af met een steriele schaar, zodat de heupkop intact blijft.
  9. Breng de scheenbenen en dijbenen over naar de stroombuffer in een steriele buis van 15 ml.
  10. Scheid het scheenbeen en het dijbeen door de knie met de hand te breken. Verwijder de patella, het kraakbeen en de femorale condylen om het tibiale plateau en het distale dijbeen met de hand bloot te leggen. Verwijder de spieren met behulp van een steriel gaasje en week de botten vervolgens in de stroombuffer.
  11. Snijd de femurhals af en spoel de beenmergcellen met stroombuffer van beide uiteinden van het dijbeen met behulp van een spuit van 10 ml met een naald van 23 G.
  12. Snijd de tibiale malleolus en spoel de beenmergcellen met stroombuffer van beide uiteinden van het scheenbeen met behulp van een spuit van 10 ml met een naald van 23 G.
  13. Dispergeer de cellen door op en neer te pipetteren met een spuit van 10 ml met een naald van 18 G. Centrifugeer de eencellige suspensie bij 4 °C en 400 x g gedurende 3 minuten.
  14. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 5 ml RBC-lysisbuffer om de RBC's gedurende 3 minuten te lyseren.
  15. Voeg 5 ml stroombuffer toe om de lysis te stoppen en centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 4 °C en 400 x g .
  16. Plaats een 70 μm celzeef op een steriele buis van 50 ml. Suspensie de pellet met 5 ml stroombuffer, meng en ga door de celzeef om de cellen te verzamelen.
  17. Stel de celconcentratie met stroombuffer in op 1 x 108/ml in polypropyleenbuizen met ronde bodem.
  18. Selecteer Lin-cellen met behulp van een muis hematopoietische celisolatiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  19. Houd drie buisjes van 1 x 104 cellen in 100 μL buffer opzij voor één niet-gekleurde controle en twee enkele antilichaam-gekleurde controles voor APC-geconjugeerde anti-muis CD117 (c-Kit) en PE-Cy7-geconjugeerde anti-muis Ly-6A/E (Sca-1). Gebruik 1 μL antilichaam (van 0,2 mg/ml voorraad) voor elk van de afzonderlijke antilichaam-gekleurde controles.
  20. Kleuring de rest van de cellen in een buis met beide antilichamen (4 μL van elk uit 0,2 mg / ml voorraden) in 400 μL. Incubeer de buizen op ijs in het donker gedurende 0,5-1 uur.
  21. Was na het kleuren de cellen door 1 ml stroombuffer toe te voegen en gedurende 3 minuten te centrifugeren bij 4 °C en 400 x g .
  22. Resuspendeer de cellen voor de niet-gekleurde controle en de enkele antilichaam-gekleurde controles in 100 μL stroombuffer. Resuspendeerde dubbele antilichaam-gekleurde cellen in 1 ml stroombuffer voor sortering.
  23. Sorteer hematopoëtische stamcellen (HSC's) als een LSK-populatie met behulp van een celsorteerder zoals beschreven in23,24.
  24. Bedek tijdens het kleuren een steriele schaal van 6 cm als volgt met retronectine: Bereid 100 μg / ml bouillon retronectine in PBS en voeg 0,9 ml PBS en 0,1 ml retronectine toe aan een schaal van 6 cm. Bedek de schaal in een steriele kap op kamertemperatuur gedurende 2 uur. Verwijder vervolgens de retronectine en blokkeer de schaal met 0,5 ml gefilterde 2% BSA (in PBS) gedurende 30 minuten. Was de schaal twee keer met 5 ml PBS en de schaal is klaar voor transductie.
  25. Centrifugeer de gesorteerde HSC's of ongesorteerde Lin-cellen bij 4 °C en 400 x g gedurende 3 minuten en resuspensie in 3 ml 2x (cytokines) IMDM-media en 3 ml viraal supernatant (gegenereerd uit stap 3.10) in een schaal met retronectinecoating. Incubeer de schaal in een bevochtigde 5% CO 2-incubator bij 37 °C gedurende 6 of 24 uur.
    OPMERKING: In de huidige studie werden Lin-cellen gesorteerd of ongesorteerd, afhankelijk van het experimentele ontwerp.

5. Seriële transplantatie (figuur 1)

OPMERKING: Primaire ontvangende muizen waren 8-10 weken oude mannelijke C57BL6 / J-muizen (CD45.2). Ze kregen water ad libitum met antibiotica om opportunistische spijsverteringsinfecties te voorkomen, van 3 dagen vóór de transplantatie tot 7 dagen na de transplantatie. Primaire ontvangende muizen werden 3 uur vóór transplantatie subletoraal bestraald (4,75 Gy)25. Isofluraan werd niet toegepast op muizen met intra-peritoneale injectie.

  1. Na transductie gedurende 6 of 24 uur, oogst de cellen door centrifugeren bij kamertemperatuur en 400 x g gedurende 3 minuten. Gebruik trypsine om de cellen te verzamelen die aan de bodem van de schaal zijn bevestigd, indien nodig. Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in voorverwarmd PBS. Bepaal het volume van PBS afhankelijk van het aantal ontvangers (d.w.z. 0,1 ml / muis en 0,5 ml / muis voor ontvangers met respectievelijk retro-orbitale en intra-peritoneale injecties).
  2. Plaats de subletoraal bestraalde ontvangende muizen in een isofluraankamer (zuurstofdebiet is ingesteld op 1,0 l/min en verdamper van isofluraan is ingesteld op 5%). Breng natte zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent. De muizen zijn klaar voor verdere procedures wanneer de hartslag daalt tot 60 slagen per min.
  3. Injecteer cellen retro-orbitaal (0,1 ml/muis)7 of intraperitoneaal (0,5 ml/muis)26 in primaire ontvangende muizen met een naald van 27 G1/2. Observeer de muizen continu totdat ze voldoende bewustzijn krijgen om sternale lighouding te behouden. Controleer de muizen dagelijks op hun welzijn na transplantatie.
  4. Na 1 maand wekelijks bloed verzamelen door retro-orbitale bloedingen om leukocytose te controleren door het volledige bloedbeeld (CBC) op een hemavet te evalueren zoals hieronder beschreven.
    1. Plaats de muis lateraal na anesthesie met isofluraan (stroomsnelheid van zuurstof is ingesteld op 1,0 l / min en verdamper van isoflurance is ingesteld op 5%). De muizen zijn klaar voor verdere procedures wanneer de hartslag daalt tot 60 slagen per min.
    2. Proptose het oog met de duim en wijsvinger. Penetreer de veneuze sinusplexus met asteriel hemacriet capillair door de binnenste canthus.
    3. Verzamel 20-25 μL bloed in een EDTA-bloedafnamebuis en sluit de oogleden om het bloeden te stoppen. Breng één druppel gentamicinesulfaat oftalmische oplossing aan op het oog.
  5. Op het eindpunt, wanneer de witte bloedcellen (WBC's) 4 x 104 cellen / μL bereiken, euthanaseert u de muis in een CO2-kamer en isoleert u de beenmergcellen door de dijbenen en tibia's te spoelen met stroombuffer, gevolgd door RBC-lysis zoals vermeld in stap 4.
  6. Oogst op het eindpunt de splenocyten zoals hieronder vermeld.
    1. Euthanaseer de muis in een CO2-kamer . Plaats de muizen op een steriele chirurgische pad op een piepschuimen bord en speld de benen door de muispootkussens. Steriliseer het hele lichaam van de muizen met 70% ethanol.
    2. Knip de huid en spieren bij de middellijn om de buikholte bloot te leggen met een steriele schaar met een scherp uiteinde. Isoleer de milt met een steriele schaar en plaats deze in een stroombuffer in een steriele buis van 15 ml.
    3. Gaas de milt door een steriele zeef van 70 μm in een schaal van 6 cm met 3 ml stroombuffer. Breng de cellen over van de schaal naar een steriele buis van 15 ml en centrifugeer de eencellige suspensie bij 4 °C en 400 x g gedurende 3 minuten.
    4. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 5 ml RBC-lysisbuffer om de RBC's gedurende 3 minuten te lyseren. Voeg 5 ml stroombuffer toe om de lysis te stoppen en centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 4 °C en 400 x g .
    5. Plaats een 70 μm celzeef op een steriele buis van 50 ml. Suspensie de pellet met 5 ml stroombuffer, meng en ga door de celzeef om cellen te verzamelen.
  7. Identificeer primaire (1°) AML-cellen door de splenocyten en beenmergcellen te kleuren met FITC-geconjugeerd antimuis CD45.1-antilichaam en te detecteren op een flowcytometer. De cellen worden eerst gated op FSC-A/FSC-H en FSC-A en SSC-A om singlets te verkrijgen. De CD45.1+ populatie is gated op FL1 plot door het te vergelijken met ongekleurde cellen.
  8. Voor secundaire (2°) transplantatie, resuspensie CD45.1 AML milt cellen van 1° r.o. ontvangers in PBS (0,1 ml/muis) en injecteer ze retro-orbitaal in CD45.2 mannelijke C57BL6/J muizen. Resuspendeer parallel AML-miltcellen van 1° i.p. ontvangers in PBS (0,5 ml / muis) en injecteer ze intra-peritoneaal in 8-12 weken oud rood fluorescentie-eiwit (RFP) - tot expressie brengend Ai14TdTomato mannelijke muizen27.
  9. Voor tertiaire (3°) transplantatie, resuspendeerde AML-cellen geïsoleerd uit het beenmerg of peritoneale holte van 2° i.p. ontvangers en injecteer ze intra-peritoneaal in respectievelijk Ai14TdTomato (RFP+) of CD45.2 muizen. Resuspendeer AML-cellen geïsoleerd uit de peritoneale holte van 2° r.o. ontvangers en transplanteer ze door middel van r.o. injectie in Ai14TdTomato (RFP+) muizen.
    OPMERKING: Voor 2° transplantatie identificeerden we de ziekteprogressie bij 2° ontvangers door de CBC in perifeer bloed te monitoren. Om de oprichting van AML verder te bevestigen, verzamelden we volledig perifeer bloed door hartpunctie, evenals beenmerg, milt en lever. Verder voerden we i.p. lavage uit om i.p. cellen te verzamelen. Eencellige suspensies werden verkregen uit beenmerg, milt en i.p. lavage zoals hierboven beschreven. Cellen van deze sites werden geanalyseerd op een flowcytometer na RBC-lysis. AML-cellen werden herkend als RFP-negatieve (RFP-) cellen. Voor 3° transplantatie bemonsterden we bloed, beenmerg, milt, lever en i.p. cellen op het eindpunt; RFP- of CD45.1+ cellen werden geïdentificeerd als AML-cellen en onderzocht door middel van flowcytometrie. Er werd geen bestralings- of antibioticawater gegeven aan 2° en 3° ontvangende muizen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave van MLL-AF9 virale transductie in beenmerg HSC's en seriële transplantatie (1°, 2° en 3°). Het sorteren van de dubbelpositieve populatie van Sca-1 en c-Kit met behulp van een celsorteerder die wordt weergegeven in het gestippelde schaduwvak wordt als optioneel beschouwd, indien de middelen dit toelaten. De figuur is gemaakt met BioRender (https://biorender.com/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Intra-peritoneale lavage

  1. Injecteer tweemaal 5 ml onvolledige IMDM-media in de peritoneale holte om de cellen in een steriele buis van 15 ml te verzamelen. Centrifugeer de celsuspensie bij kamertemperatuur en 400 x g gedurende 3 minuten. Transplanteer AML-cellen (4 x 105 cellen/muis) uit de peritoneale holte van 2° ontvangers via i.p. injectie in 3° CD45.2 ontvangende muizen (n = 3).

7. Histologische analyse 28

  1. Isoleer de milt, levers en dijbenen van muizen bij euthanasie. Fixeer ze in 5 ml 10% (v / v) gebufferde formaline. Proef de milt en levers van gezonde tegenhangers voor vergelijkingen.
  2. Sluit vaste weefsels in paraffine in en snijd ze in secties. Bevlek de secties met hematoxyline en eosine (H &E) kleurstoffen.
  3. Verkrijg de beelden onder een microscoop bij 20x vergroting geïnstalleerd met een compatibele software voor histologische analyse.

8. Uitvoeren van semi-kwantitatieve PCR (qPCR)

  1. Bereid RNA's in RNA-reagens volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Gebruik 0,5-1,0 μg RNA's om cDNA te synthetiseren met behulp van een cDNA reverse transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Gebruik cDNA om qPCR uit te voeren met behulp van een qPCR-kit en voer de samples uit in een qPCR-systeem. Gebruik de volgende vooraf gevalideerde TaqMan-sondes: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 en 18S ribosomaal RNA (Hs99999901_s1).
  4. Laad de KMT2A en 18S amplicons op een 2% agarose gel om de expressie te visualiseren. Verkrijg afbeeldingen in een imager die is geïnstalleerd met het compatibele softwareprogramma.

9. Gegevensverwerking

  1. Analyseer resultaten met behulp van statistische analysesoftware en presenteer de resultaten als het gemiddelde ± SEM. Genereer cijfers met behulp van een commerciële illustratortool.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Vergelijking van de transplantatie-efficiëntie van murine AML-cellen met behulp van r.o. en i.p. transplantatieroutes
Eerder werd de vaststelling van 1° AML gemeld bij ontvangende muizen retro-orbitaal getransplanteerd met MLL-AF9-getransduceerde LSK-cellen, en de transplanteerbaarheid van 1° AML-cellen werd aangetoond door seriële transplantatie30. De huidige studie is de eerste die de mogelijkheid evalueert om beenmerglincellen te gebruiken om transplantatie uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze hierboven beschreven studies leveren ondersteunend bewijs dat de transplantatie van Lin-cellen vergelijkbaar is met LSK-cellen bij de generatie van 1° murine AML. Bovendien laten de huidige gegevens ook zien dat ip-injectie een efficiënte en handige methode is om murine AML vast te stellen in vergelijking met intraveneuze (of r.o.) injectie.

Naast LSK-cellen is gemeld dat andere populaties zoals granulocyt-monocytenvoorloper (GMP), gewone lymfoïde voorloper (CLP) en gewone myel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de Flow Cytometry Core Facility van het Huck Institute en de Histopathology Core Facility van het Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, voor het bieden van tijdige technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, toetredingsnummer 00000005 K.S.P. en R.F.P.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
a-Select competent cells BiolineBIO-85027
Ammonium chloride (NH4Cl)Sigma AldrichCat# A-9434
AmpicillinSigma AldrichCat# A0797
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin GradeGemini bio-productsCat# 700-102P
Ciprofloxacin HClGoldBio.comCat# C-861-100
DMEM, high glucose, no glutamineGibcoCat# 11960-044
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS)CorningCat# 21-031-CV
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology GradeCalbiochemCat# 324503
Fetal Bovine Serum - Premium SelectAtlanta BiologicalsCat# S11550
Holo-transferrin, bovineSigma AldrichCat# T1283
Insulin solution humanSigmaCat# I-9278
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)GibcoCat# 12440-053
L-glutamine 200 mM (100×) solutionHyClone, GelifesciencesCat# SH30034.01
LB broth, LennoxNEOGENCat #: 7290A
LB Broth with agar (Miller)Sigma AldrichCat# L-3147
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC)Miltenyi BiotecCat# 130-124-211
Mouse Interleukin-3 (IL-3)Gemini bio-productsCat# 300-324P
Mouse Interleukin-6 (IL-6)Gemini bio-productsCat# 300-327P
Mouse Stem Cell Factor (SCF)Gemini bio-productsCat# 300-348P
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xCorningCat# 30-002-CI
Phenix-Eco (pECO) cellsATCCCRL-3214
Potassium Bicarbonate (KHCO3), GranularJT. BakerCat# 2940-01
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC)BioLegend Cat # 105812
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)BD PharmingenCat# 558162
Recombinant Murine Flt3-LigandPepro Tech, INC.Cat# 250-31L
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin FragmentTaKaRaCat# T100A
TransIT-293 ReagentMirusBioCat# MIR 2705
TRI ReagentSigma AldrichCat# T9424
Trypan Blue Solution, 0.4%GibcoCat # 15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibcoCat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichCat# M3148
Commerciële tests 
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit StemCell technologiesCat# 19856A
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMixQuanta BioCat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25)QiagenCat#:12163
Dieren
Ai14TdTomato muizenJackson LaboratoryStam # 007914
CD45.1 C57BL6/J muizen Jackson LaboratoryStam # 002014
CD45.2 C57BL6/J muizen Jackson LaboratoryStam # 000664
Instrumenten en software
Adobe illustrator Versie 25.2.3
BD accuri C6 flow cytometerBD Biosciences
FlowJo 10.8.0BD
GeneSys software programma Versie 1.5.7.0
GraphPad Prism versie 6 GraphPad
Hemavet 950FS Drew Scientific
7300 Real time PCR systeemApplied Biosystems
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescerende Fluorescerende BeeldvormingG:Box Chemi

Referenties

  1. Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
  3. Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
  4. Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152(2019).
  5. Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
  6. Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
  7. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  8. Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
  9. Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
  10. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
  11. Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
  14. Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
  15. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  16. Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
  17. Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).
  18. Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
  19. Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
  20. Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360(2012).
  21. Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).
  22. Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).
  23. Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
  24. Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
  25. Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).
  26. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  27. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  28. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  29. Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
  30. Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).
  31. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  32. Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
  33. Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

AML muismodelleukemie stamcellenretro orbitale injectietransductie van beenmergMLL AF9 fusielineage negatieve cellenflowcytometrieseri le transplantatie
Intra-peritoneale transplantatie voor het genereren van acute myeloïde leukemie bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.