Methodenartikel

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in insulineproducerende eilandjesclusters

DOI:

10.3791/64840

⸱

23 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De differentiatie van stamcellen in eilandjescellen biedt een alternatieve oplossing voor conventionele diabetesbehandeling en ziektemodellering. We beschrijven een gedetailleerd stamcelkweekprotocol dat een commerciële differentiatiekit combineert met een eerder gevalideerde methode om te helpen bij het produceren van insuline-afscheidende, van stamcellen afgeleide eilandjes in een schaaltje.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in insuline-afscheidende bètacellen levert materiaal voor het onderzoeken van de bètacelfunctie en de behandeling van diabetes. Er blijven echter uitdagingen bestaan bij het verkrijgen van van stamcellen afgeleide bètacellen die native menselijke bètacellen adequaat nabootsen. Voortbouwend op eerdere studies zijn hPSC-afgeleide eilandjescellen gegenereerd om een protocol te creëren met verbeterde differentiatie-uitkomsten en consistentie. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een pancreasvoorloperkit tijdens fase 1-4, gevolgd door een protocol dat is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd artikel in 2014 (hierna "R-protocol" genoemd) tijdens fasen 5-7. Gedetailleerde procedures voor het gebruik van de pancreasvoorloperkit en microtiterplaten met een diameter van 400 μm om pancreasvoorloperclusters te genereren, R-protocol voor endocriene differentiatie in een statisch suspensieformaat met 96 putjes, en in vitro karakterisering en functionele evaluatie van hPSC-afgeleide eilandjes, zijn inbegrepen. Het volledige protocol duurt 1 week voor de eerste hPSC-uitbreiding, gevolgd door ~5 weken om insulineproducerende hPSC-eilandjes te verkrijgen. Personeel met basistechnieken voor stamcelkweek en training in biologische tests kan dit protocol reproduceren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bètacellen van de alvleesklier scheiden insuline af als reactie op stijgingen van de bloedglucosespiegel. Patiënten die onvoldoende insulineproductie hebben als gevolg van de auto-immuunvernietiging van bètacellen bij diabetes type 1 (T1D)1, of als gevolg van bètaceldisfunctie bij diabetes type 2 (T2D)2, worden doorgaans behandeld met exogene insuline. Ondanks deze levensreddende therapie kan het niet precies overeenkomen met de voortreffelijke controle van de bloedglucose zoals bereikt door dynamische insulinesecretie van bonafide bètacellen. Als zodanig lijden patiënten vaak aan de gevolgen van levensbedreigende hypoglykemische episodes en andere complicaties als gevolg van chronische hyperglykemische excursies. Transplantatie van menselijke kadavereilandjes herstelt met succes de strakke glykemische controle bij T1D-patiënten, maar wordt beperkt door de beschikbaarheid van eilandjesdonoren en moeilijkheden bij het zuiveren van gezonde eilandjes voor transplantatie 3,4. Deze uitdaging kan in principe worden opgelost door hPSC's als alternatief uitgangsmateriaal te gebruiken.

De huidige strategieën voor het in vitro genereren van insuline-afscheidende eilandjes uit hPSC's zijn vaak gericht op het nabootsen van het proces van embryonale pancreasontwikkeling in vivo 5,6. Dit vereist kennis van de verantwoordelijke signaalroutes en getimede toevoeging van overeenkomstige oplosbare factoren om kritieke stadia van de zich ontwikkelende embryonale alvleesklier na te bootsen. Het pancreasprogramma begint met de verbintenis tot definitief endoderm, dat wordt gekenmerkt door transcriptiefactoren forkhead box A2 (FOXA2) en geslachtsbepalende regio Y-box 17 (SOX17)7. Opeenvolgende differentiatie van definitief endoderm omvat de vorming van een primitieve darmbuis, die uitmondt in een achterste voordarm die de homeobox 1 (PDX1)7,8,9 van de pancreas en de twaalfvingerige darm tot expressie brengt, en epitheliale expansie in voorlopercellen van de pancreas die PDX1 en NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11 tot expressie brengen.

Verdere inzet voor endocriene eilandjescellen gaat gepaard met de voorbijgaande expressie van pro-endocriene hoofdregulator neurogenine-3 (NGN3)12 en stabiele inductie van de belangrijkste transcriptiefactoren neuronale differentiatie 1 (NEUROD1) en NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. De belangrijkste hormoonexpressiecellen, zoals insulineproducerende bètacellen, glucagon-producerende alfacellen, somatostatine-producerende deltacellen en pancreaspolypeptide-producerende PPY-cellen, worden vervolgens geprogrammeerd. Met deze kennis, evenals ontdekkingen uit uitgebreide, high-throughput drug screening studies, hebben recente ontwikkelingen het mogelijk gemaakt om hPSC-eilandjes te genereren met cellen die lijken op bètacellen die in staat zijn tot insulinesecretie 14,15,16,17,18,19.

Stapsgewijze protocollen zijn gerapporteerd voor het genereren van glucose-responsieve bètacellen 6,14,18,19. Voortbouwend op deze studies, omvat het huidige protocol het gebruik van een pancreasvoorloperkit voor het genereren van PDX1+/NKX6.1+ pancreasvoorlopercellen in een vlakke cultuur, gevolgd door aggregatie van microtiterplaten in clusters van uniforme grootte en verdere differentiatie in de richting van insuline-afscheidende hPSC-eilandjes met het R-protocol in een statische 3D-suspensiecultuur. Kwaliteitscontroleanalyses, waaronder flowcytometrie, immunokleuring en functionele beoordeling, worden uitgevoerd voor een rigoureuze karakterisering van de differentiërende cellen. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van elke stap van de gerichte differentiatie en schetst de in vitro karakteriseringsbenaderingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is gebaseerd op het werken met hPSC-lijnen, waaronder H1, HUES4 PDXeG en Mel1 INSGFP/W, in feedervrije omstandigheden. In dit hoofdstuk wordt een stapsgewijze procedure beschreven, met ondersteunende gegevens over de differentiatie van Mel1 INSGFP/W in het gedeelte met representatieve resultaten. We raden aan dat verdere optimalisatie nodig is bij het werken met andere hPSC-lijnen die hier niet worden vermeld. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle reagentia en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Voorbereiding van differentiatiemedia en oplossingen

OPMERKING: Zie tabel 1 voor alle oplossingen die moeten worden voorbereid en tabel 2 voor de differentiatiemedia.

  1. Bereid alle media en reagentia voor celkweek voor in een steriele bioveiligheidskast. Celkweekgerelateerde oplossingen en basale media voor gebruik kort opwarmen tot 37 °C in een bad.
    OPMERKING: Zoals hieronder beschreven, maak dagelijks verse differentiatiemedia door supplementen toe te voegen en gebruik ze op dezelfde dag. Als alternatief biedt de pancreasvoorloperkit de mogelijkheid om van tevoren een groter volume te bereiden dat gedurende meerdere dagen kan worden gebruikt volgens het protocol van de fabrikant. Beide methoden voor mediavoorbereiding blijken goed te werken. Houd er rekening mee dat het niet wordt aanbevolen om media voor langere tijd in het waterbad te laten staan. Bij het bereiden van media die elke dag vers zijn, wordt aanbevolen om aliquot supplementen te gebruiken om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.

2. Differentiatie van hPSC's in voorlopercellen van de pancreas

  1. Handhaaf ongedifferentieerde hPSC's op met matrigel gecoate vaten in mTeSR1 volledig medium en voer dagelijks mediumveranderingen uit. Tijdens onderhoudskweek passeren hPSC's elke 3-4 dagen wanneer cellen ~70% confluentie bereiken met behulp van het celdissociatiereagens volgens het protocol van de fabrikant. Om differentiatie te initiëren, dissocieert u de cellen in afzonderlijke cellen en zaait u ze op met 6 of 12 putjes behandelde weefselkweekplaten (met mediavolumes van respectievelijk 2 ml of 1 ml per putje).
    OPMERKING: Zie tabel 1 voor instructies met betrekking tot de opslag van endoderm basaal medium en de aliquots daarvan.
  2. Smeer kweekputjes voor met hESC-gekwalificeerd Matrigel (verdund in ijskoude DMEM/F12 zoals aanbevolen door het protocol van de fabrikant) en plaats de plaat gedurende 30 minuten in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  3. Verplaats de met Matrigel gecoate plaat naar kamertemperatuur (gebruik binnen 3 uur).
  4. Zuig het verbruikte medium uit de hPSC-cultuur op en spoel eenmaal met DPBS. Dissocieer hPSC-cultuur in afzonderlijke cellen met celdissociatie-enzym bij 37 °C gedurende 3-5 minuten. Spoel de cellen af door warm DMEM/F12-medium toe te voegen, breng ze over in een conische buis van 15 ml of 50 ml en draai ze gedurende 5 minuten rond op 300 × g .
  5. Resuspendeer de celpellet met stamcel-compleet medium plus 10 μM Y-27632 en voer levende celtellingen (trypanblauw-negatief) uit met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Geëxgeneerde Matrigel opzuigen en levende cellen onmiddellijk zaaien met een dichtheid van 1,60-1,80 × 10 5/cm2 op met matrigel beklede putjes en gedurende 24 uur incuberen in een bevochtigde incubator van 37 °C,5% CO2. Ga verder met fase 1.
    OPMERKING: Dit zal resulteren in ~95% startconfluentie voor het initiëren van differentiatie. Volgens het protocol van de fabrikant wordt een zaaidichtheid van 2,6 × 105/cm2 aanbevolen. Het wordt aanbevolen om verschillende zaaidichtheden te testen om de optimale waarde voor een cellijn te bepalen en om de levensvatbaarheid van de cel te controleren. Als de levensvatbaarheid lager is dan 80%, ga dan niet verder met differentiatie. Een lage levensvatbaarheid van de cellen kan het gevolg zijn van oververtering of overtrituratie tijdens de oogst of het langdurig achterlaten van cellen in het DMEM/F12-medium voorafgaand aan het zaaien.
  6. Verwarm op fase 1 dag 1 het basale medium van het endoderm kort tot 37 °C in een bad en ontdooi het supplement MR en CJ. Bereid fase 1A-medium voor door supplement MR en CJ toe te voegen aan het basale medium van het endoderm. Goed mengen en direct gebruiken.
  7. Zuig het verbruikte medium uit putten op, voeg fase 1A-medium toe en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
    NOTITIE: Wasstappen zijn niet nodig. Verwijder alle losse cellen uit de kweek door de kweekplaat voorzichtig te schudden voordat het medium wordt verwisseld. Voorkom dat de monolaag wordt verstoord door de pipetpunt niet aan te raken met de bodem van het putje tijdens het verwijderen van het medium en door het voorzichtig toevoegen van medium.
  8. Verwarm op Stage 1 dag 2 het endoderm basaal medium kort in een bad van 37 °C en ontdooi Supplement CJ. Bereid stadium 1B-medium voor door supplement CJ toe te voegen aan het endoderm basale medium. Goed mengen en direct gebruiken.
  9. Zuig het verbruikte medium uit de putten op, voeg fase 1B-medium toe en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  10. Herhaal stap 2.8-2.9 op stap 1, dag 3. Ga verder met fase 2.
  11. Verwarm op dag 1 van fase 2 het basaalmedium van stadium 2-4 van de alvleesklier in een bad van 37 °C en ontdooi supplement 2A en 2B. Bereid het medium van stadium 2A voor door supplement 2A en 2B toe te voegen aan het basaal medium van stadium 2-4 van de alvleesklier. Goed mengen en direct gebruiken.
  12. Zuig het verbruikte medium uit putten op, voeg stadium 2A-medium toe en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  13. Verwarm op Stage 2 dag 2 pancreas Stage 2-4 Basal Medium in een bad van 37 °C en ontdooi Supplement 2B. Bereid Stage 2B medium voor door Supplement 2B toe te voegen aan het pancreas Stage 2-4 Basal Medium. Goed mengen en direct gebruiken.
  14. Zuig het verbruikte medium uit de putjes, voeg Stage 2B-medium toe en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  15. Herhaal stap 2.13-2.14 op stap 2 dag 3. Ga verder met fase 3.
  16. Op Fase 3 dag 1, verwarm de alvleesklier Stadium 2-4 Basal Medium in een bad van 37 °C en ontdooi Supplement 3. Bereid fase 3 medium voor door supplement 3 toe te voegen aan het pancreasstadium 2-4 basaal medium. Goed mengen en direct gebruiken.
  17. Zuig het verbruikte medium uit putten op, voeg fase 3-medium toe en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  18. Herhaal stap 2.16-2.17 op stap 3, dag 2 en dag 3. Ga verder met fase 4.
  19. Op Fase 4 dag 1, verwarm de alvleesklier Stadium 2-4 Basal Medium in een bad van 37 °C en ontdooi Supplement 4. Bereid stadium 4 medium voor door supplement 4 toe te voegen aan de pancreas stadium 2-4 basaal medium. Goed mengen en direct gebruiken.
  20. Zuig het verbruikte medium uit putten op, voeg stadium 4-medium toe en incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  21. Herhaal stap 2.19-2.20 op fase 4, dag 2 tot en met dag 4. Ga verder met aggregatiestappen.

3. Aggregatie in clusters van voorlopercellen van de alvleesklier met behulp van microtiterplaten met een diameter van 400 μm

  1. Behandel op Stage 4 dag 5 de microwells voor (bijv. 24-wells plaatformaat) met 500 μL Anti-Adherence Spoeloplossing per putje.
  2. Bereid een balansplaat voor en centrifugeer de microtiterplaat bij 1.300 × g gedurende 5 minuten.
    NOTITIE: Controleer de plaat onder een microscoop om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen in de microbuisjes achterblijven. Centrifugeer opnieuw gedurende nog eens 5 minuten als er belletjes in microots blijven zitten.
  3. Zuig de Anti-Adherence Spoeloplossing uit de putjes en spoel eenmaal met 1 ml DPBS. Zuig de DPBS uit de putjes en voeg 1 ml aggregatiemedium toe aan elk putje.
  4. Verwijder het verbruikte medium uit de voorloperculturen van de alvleesklier en was eenmaal met DPBS. Dissocieer de culturen in afzonderlijke cellen met dissociatiereagens bij 37 °C gedurende 10-12 minuten. Spoel de cellen af met warme DMEM/F12, doe ze in een buisje en draai ze gedurende 5 minuten rond op 300 × g .
  5. Resuspendeer de celpellet in het aggregatiemedium en voer levende celtellingen uit. Zaai in totaal 2,4-3,6 miljoen cellen per putje (d.w.z. 2.000-3.000 cellen per microputje) en voeg aggregatiemedium toe aan elk putje om een uiteindelijk volume van 2 ml per putje te bereiken.
  6. Pipeteer de cellen voorzichtig een paar keer op en neer met een P1000-pipetpunt om een gelijkmatige verdeling van de cellen over het putje te garanderen. Breng geen luchtbellen in microtitercellen. Centrifugeer de microtiterplaat bij 300 × g gedurende 5 minuten om de cellen in de microwell op te vangen. Incubeer de microtiterplaat in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur aggregatie en ga verder met differentiatie in fase 5-7.
    NOTITIE: Pas op dat u de plaat niet verstoort tijdens de aggregatietijd. Voor een optimale aggregaatvorming kan tot 48 uur incubatietijd nodig zijn.

4. Differentiatie van kit-afgeleide pancreasvoorloperclusters in hPSC-eilandjes

  1. Verwarm op fase 5 dag 1 het basaalmedium van fase 5-7 in een bad van 37 °C en ontdooi supplementen (zie tabel 1 en tabel 2). Bereid fase 5-medium voor door supplementen (tot de uiteindelijke werkconcentraties) toe te voegen aan het basale medium van fase 5-7. Goed mengen en direct gebruiken.
  2. Na de vorming van het aggregaat pipet u de aggregaten voorzichtig een paar keer op en neer met een P1000-pipetpunt om niet-geaggregeerde cellen te laten zweven. Laat de aggregaten door de zwaartekracht tot rust komen (wacht ~1 min). Verwijder het verbruikte medium (met de drijvende niet-geaggregeerde cellen) voorzichtig zoveel mogelijk uit de put en vermijd het aanzuigen van aggregaten.
  3. Breng vers Stage 5-medium krachtig aan op het oppervlak van de microtiterplaat om aggregaten uit de microwells los te maken. Breng aggregaten over in ultralage bevestiging (ULA) 6-wells. Spoel eenmaal met Stage 5-medium om aggregaten volledig uit de microwells te halen.
  4. Verzamel alle aggregaten in de ULA 6-putten, resuspendeer aggregaten in fase 5-medium en pas de dichtheid aan tot 20 clusters per 100 μL (er wordt bijvoorbeeld verwacht dat er ~1.200 clusters uit elke put worden gehaald. Resuspendeer 1.200 clusters in 6 ml stadium 5 medium). Gebruik een meerkanaalspipet om 50 μl stadium 5-medium in elk putje van een ULA-plaat met 96 putjes met platte bodem te doseren. Vul de hoek- en randputjes met 200 μL DPBS.
    NOTITIE: Vermijd het gebruik van de randputten voor het kweken van aggregaten, aangezien deze vatbaar zijn voor meer verdamping; Gebruik anders een plaat met 96 putjes die is ontworpen om verdamping langs de randen te minimaliseren (bijv. platen met 96 putjes met ingebouwde grachten) of plaats de kweekplaat in een celkweekincubator met een hoge luchtvochtigheid in een microklimaat.
  5. Voeg 100 μL van de clusterresuspensie toe aan elk putje van de ULA platbodemplaat met 96 putjes, wat resulteert in een totaal van 150 μL kweekmedium met gemiddeld 20 clusters per putje.
    OPMERKING: Meng de clusterresuspensie elke keer voorzichtig voordat u het in 96 putjes doseert.
  6. Plaats kweekplaten gedurende 24 uur op een vlakke ondergrond in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  7. Bereid op Fase 5 dag 2 Fase 5 medium voor volgens stap 4.1.
  8. Gebruik een meerkanaalspipet om ~90 μL van het verbruikte medium uit elk putje te verwijderen en ververs met 100 μL Stage 5-medium.
  9. Herhaal stap 4.7-4.8 op stap 5 dag 3. Ga verder met fase 6.
  10. Verwarm op fase 6 dag 1 stadium 5-7 basaal medium in een bad van 37 °C en ontdooi supplementen (zie tabel 1 en tabel 2). Bereid fase 6 medium voor door supplementen (tot de uiteindelijke werkconcentraties) toe te voegen aan het basale medium van fase 5-7. Goed mengen en direct gebruiken.
  11. Gebruik een meerkanaalspipet om ~90 μl van het verbruikte medium te verwijderen en ververs met 100 μl fase 6-medium per putje.
  12. Herhaal stap 4.10-4.11 op fase 6, dag 2 tot en met dag 8. Ga verder met fase 7.
  13. Verwarm op fase 7 dag 1 het basaalmedium van fase 5-7 in een bad van 37 °C en ontdooi supplementen (zie tabel 1 en tabel 2). Bereid fase 7-medium voor door supplementen (tot de uiteindelijke werkconcentraties) toe te voegen aan het basale medium van fase 5-7. Goed mengen en direct gebruiken.
  14. Gebruik een meerkanaalspipet om ~90 μl van het verbruikte medium te verwijderen en ververs met 100 μl Stage 7-medium per putje.
  15. Herhaal stap 4.13-4.14 op stap 7 dag 2 tot en met dag 12. Ga verder met in-vitrokarakterisering .

5. Flowcytometrische analyse

  1. Verwijder kweekmedia en was één keer met DPBS. Dissocieer de culturen (vlakke voorlopercellen of differentiërende clusters) in afzonderlijke cellen met dissociatiereagens door incubatie bij 37 °C gedurende 10-12 min. Spoel af met FACS-buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g .
  2. Resuspendeer de celpellet in de FACS-buffer en voer celtelling uit. Draai de cellen gedurende 5 minuten rond op 300 × g . Resuspendeer afzonderlijke cellen in 500 μL Fix/Perm-buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    NOTITIE: Breng de Fix/Perm-buffer voor gebruik op kamertemperatuur. De Fix/Perm-buffer bevat paraformaldehyde (PFA). Ga voorzichtig om met PFA in een zuurkast en voer het af volgens de richtlijnen van de instelling.
  3. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 500 × g, was tweemaal met 500 μL 1x Perm/Wash-buffer en resuspendeer in 300 μL 1x Perm/Wash-buffer. Breng 100 μL eencellige resuspensie (elk met 2,5-3 × 10,5 cellen) over in drie microfugebuisjes voor ongekleurde controle, isotypecontrole en antilichaamkleuring (zie Materiaaltabel voor informatie over antilichamen en verdunningen van monsters). Incubeer gedurende 45 minuten op kamertemperatuur en dek af met folie.
  4. Centrifugeer op 500 × g gedurende 3 min. Twee keer wassen met 500 μL 1x Perm/Wash buffer. Resuspendeer de monsters in 100 μL FACS-buffer en analyseer de gekleurde cellen (zie Materiaaltabel voor intracellulaire kleuring van markers in specifieke stadia) met een flowcytometer en software (bijv. FlowJo).
    OPMERKING: Als de monsters niet onmiddellijk worden getest, bewaar ze dan bij 4°C beschermd tegen licht. Voor de gating-strategie worden de stroomgegevens eerst afgeschermd op scatter-eigenschappen (FSC-A en SSC-A) om klein cellulair afval te verwijderen, gevolgd door FSC-A- en FSC-breedte-eigenschappen om singlets te identificeren. Positieve en negatieve gating wordt bepaald door stamcelcontroles en/of niet-gekleurde, isotypecontroles.

6. Immunokleuring van de hele berg

  1. Verzamel clusters in een microfuge-buis. Clusters afwikkelen door de zwaartekracht. Zuig het verbruikte medium op en spoel eenmaal met 1 ml PBS (met calcium en magnesium). Fixeer de clusters met 1 ml 4% PFA een nacht bij 4°C.
  2. Spoel eenmaal met PBST en permeabiliseer 20-30 clusters met 500 μL 0,3% TritonX-100 in een microfugebuis bij kamertemperatuur gedurende ten minste 6 uur op een tilt shaker.
    OPMERKING: Voor grote clusters is een langere permeabilisatietijd (tot 24 uur) nodig.
  3. Incubeer de clusters in 100 μL blokkeerbuffer bij omgevingstemperatuur gedurende 1 uur op een tilt shaker. Verwijder de blokkeerbuffer en incubeer de clusters met 100 μL primaire antilichamen verdund in antilichaamverdunningsbuffer bij omgevingstemperatuur 's nachts op een tilt shaker.
    OPMERKING: Als de achtergrond sterk is tijdens de beeldvorming, incubeer dan met primaire antilichamen bij 4 °C.
  4. Was 3 x 30 min met 500 μL PBST grondig op een tilt shaker (kantelhoek ingesteld op 8, snelheid ingesteld op 20).
  5. Incubeer de clusters met 100 μL secundaire antilichamen in antilichaamverdunningsbuffer bij omgevingstemperatuur 's nachts op een tilt shaker. Dek de buizen af met folie.
    OPMERKING: Als de achtergrond sterk is tijdens de beeldvorming, incubeer dan met secundaire antilichamen bij 4 °C.
  6. Spoel eenmaal met 500 μL PBST. Voeg 100 μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-oplossing toe (10 μg/ml in PBST) en kleuring bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten. Dek af met folie en bescherm tegen licht.
  7. Was 3 x 30 min met 500 μL PBST grondig op een tilt shaker. Bedek de buizen tijdens de wasstap met folie.
  8. Bevestig de clusters op objectglaasjes in de beeldkamer (zie de materiaaltabel) die zijn voorgecoat met weefsellijm volgens het protocol van de fabrikant en gepubliceerde protocollen20,21.
  9. Monteer met weefselreinigingsmedium (80% glycerol in PBS-oplossing) en dek af met glazen dekglaasjes. Bescherm tegen licht tot confocale beeldvorming.
    OPMERKING: Als monsters niet onmiddellijk worden afgebeeld, bewaar ze dan bij 4 °C, beschermd tegen licht.

7. Statische GSIS-test

  1. Verwarm Kreb's Ringerbicarbonaat (3,3 G KRB)-buffer met lage glucose, KRB-buffer met hoge glucose (16,7 G) en KCl KRB-buffer van 30 mM KCl in een bad van 37 °C.
  2. Kies met de hand clusters die op maat zijn afgestemd en spoel ze af met 2 ml warme 3.3G KRB-buffer. Breng de clusters over in een niet met weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes en breng ze gedurende 1 uur in evenwicht in 2 ml of warme 3,3 G KRB-buffer in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  3. Vul na het balanceren de analysekamer (zie de materiaaltabel) met 100 μL warme 3.3G KRB-buffer. Kies met de hand vijf clusters en breng ze over naar het midden van de testkamer. Incubeer gedurende 30 minuten in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
    OPMERKING: Gebruik pipetpunten van 10 μl voor het overbrengen van clusters met een minimaal gemiddeld volume.
  4. Verzamel voorzichtig ~100 μL van het supernatans en bewaar het bij -30 °C tot meting van de basale insulinesecretie (zie stap 7.9). Droog of verlies geen trossen in deze stap. Voeg onmiddellijk 100 μL warme 16,7G KRB-buffer toe aan de analysekamer en incubeer dezelfde clusters gedurende 30 minuten in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  5. Verzamel voorzichtig ~100 μL van het supernatans en bewaar het bij -30 °C tot meting van de glucosegestimuleerde insulinesecretie (zie stap 7.9). Voeg onmiddellijk 100 μL warme 30 mM KCl KRB-buffer toe aan de analysekamer en incubeer dezelfde clusters gedurende 30 minuten in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  6. Verzamel voorzichtig ~100 μL van het supernatans en bewaar bij -30 °C tot meting van de KCl-gestimuleerde insulinesecretie (zie stap 7.9). Voeg onmiddellijk 100 μL RIPA lysisbuffer toe aan de testkamer en breng de lysisbuffer met alle vijf clusters over in een microfugebuis.
  7. Optioneel) Breek de clusters handmatig door krachtige trituratie met een P200-pipetpunt. Vortex gedurende 30 seconden en incubeer 30 minuten op ijs, gevolgd door nog eens 30 seconden vortex.
    NOTITIE: Zorg voor volledige lysis door vortexen en voldoende incubatietijd op ijs.
  8. Centrifugeer op 8.000 × g gedurende 1 min. Vang het supernatans op en bewaar het bij -30 °C tot de meting van het totale insulinegehalte (zie stap 7.9).
  9. Meet humane insuline in de supernatantmonsters met behulp van een humane insuline ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant en gepubliceerde protocollen20,22.
    OPMERKING: Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien van bovendrijvende monsters. Monsters met meer dan drie vries- en dooicycli mogen niet worden getest.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een hybride strategie om stamcellen in zeven stappen te differentiëren tot insuline-afscheidende hPSC-eilandjes, waarbij gebruik wordt gemaakt van een pancreasvoorloperkit voor de eerste vier fasen in vlakke cultuur, gevolgd door een aangepast protocol dat is gebaseerd op een eerder gerapporteerde methode6 in een statische suspensiecultuur voor de laatste drie fasen (Figuur 1). Met dit protocol is het van cruciaal belang om 24 uur na het zaaien van cel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een hybride protocol in zeven fasen dat het mogelijk maakt om hPSC-eilandjes te genereren die in staat zijn om insuline af te scheiden bij glucoseprovocatie binnen 40 dagen na kweek in vitro. Van deze meerdere stappen wordt aangenomen dat efficiënte inductie van definitief endoderm een belangrijk startpunt vormt voor de uiteindelijke differentiatie-uitkomsten18,27,28. In het protocol van de fabrik...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Timothy J. Kieffer was een medewerker van ViaCyte tijdens de voorbereiding van dit manuscript. De andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor de steun van STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF en de Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao en Shenghui Liang zijn ontvangers van de Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam is een ontvanger van de Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima is een ontvanger van de Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship en de CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. We danken Dr. Edouard G. Stanley van MCRI en Monash University oprecht voor het delen van de Mel1 INS GFP/W-lijn en de Alberta Diabetes Institute Islet Core voor het isoleren en distribueren van menselijke eilandjes. We erkennen ook de steun van de Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry-faciliteiten van de University of British Columbia. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397Thyroid hormone
4% PFA oplossingSanta Cruz Biotechnologysc-281692Moet worden behandeld in dampkap
96-Well, Ultralow Attachment, platte bodemCorning Costar (VWR)CLS3474Vlakke bodem; voor statische suspensiecultuur in de laatste drie stadia
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Dissociatiereagens voor Stage 4 cellen
Aggrewell400 platenSTEMCELL Technologies34415Microwell platen met een diameter van 400 µm
Aggrewell800 platenSTEMCELL Technologies34815Microwell platen met een diameter van 800 µm
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; gebruikt voor het beoordelen van Stage 1 cellen
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; gebruikt voor het beoordelen van Stage 7 cellen
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&D SystemsIC0041G1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2.000 in flow cytometry; gebruikt voor het beoordelen van Stage 7 cellen
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2.000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; gebruikt voor het beoordelen van Stage 4 cellen
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; gebruikt voor het beoordelen van Stage 1 cellen
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta signaalremmer
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010Microwell Spoeloplossing
Assay chamberCellvisD35-10-1-NVoor statische GSIS en confocale beeldvorming doeleinden
Bovine serum albumine (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100Voor immunokleuringsprocedure
CK19 antilichaamDAKOM08881:50 in gehele montage immunofluorescence
D-glucoseSigmaG8769Mediumsupplement
DAPISigmaD9542Voor nucleaire tegenstengeling
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix verdunningsoplossing
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in gehele montage immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in gehele montage immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in gehele montage immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in gehele montage immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in gehele montage immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in gehele montage immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in gehele montage immunofluorescence
DPBSSigmaD8537Zonder Ca2+ en Mg2+
ELISA, insuline, menselijkAlpco80-INSHU-E01.1Voor menselijk insulinemeting
Vetzuurvrij BSAProliant68700Mediumsupplement
Fixatie en Permeabilisatie Solution KitBD Sciences554714Fix/Perm en 10x Perm/Wash oplossingen inbegrepen
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174Voor clump passaging hPSCs tijdens onderhoudscultuur
Glucagon antilichaamSigmaG26541:400 in gehele montage immunofluorescence
GLUT1 antilichaamThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in gehele montage immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4Voor weefselklaring en montage
GSi XXSigma Millipore565789Notch remmer
HeparineSigmaH3149Mediumsupplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; mediumsupplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP antagonist
MAFA antilichaamAbcamab264051:200 in gehele montage immunofluorescence
Matrigel, hESC-gekwalificeerdThermo Fisher Scientific08-774-552Extracellulaire matrix voor vaatoppervlaktecoating
MCDB131 mediumLife technologies10372019Basismedium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850stamcelmedium en 5x supplement inbegrepen
N-Cys (N-acetyl cysteïne)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3SigmaS6297Mediumsupplement
NEUROD1 antilichaamR&D SystemsAF2746

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278(2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046(2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540(2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245(2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

B taceldifferentiatiepancreatische progenitorclustersstatische suspensiecultuurendocriene differentiatieglucosegestimuleerde insulinesecretieeilandceltypenPDX1 expressieNKX6 1 expressie

Gerelateerde artikelen