Vereenvoudigde volumetrische modellen als een effectieve strategie voor het segmenteren van actinenetwerken in cryo-elektronentomogrammen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om vereenvoudigde volumetrische modellen in luidruchtige, complexe, tomografische 3D-volumes te plaatsen. Dit maakt de snelle segmentatie van de dichtheid van actinefilamenten mogelijk, de detectie van systematische filamentbuiging en van openingen in haarbundelfilamenten, evenals een gemakkelijke kwantificering van volumetrische modeleigenschappen, zoals afstanden.

Samenvatting

Efficiënte methoden voor de extractie van interessante kenmerken blijven een van de grootste uitdagingen voor de interpretatie van cryo-elektronentomogrammen. Er zijn verschillende geautomatiseerde benaderingen voorgesteld, waarvan er vele goed werken voor datasets met een hoog contrast waarbij de interessante kenmerken gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd en duidelijk van elkaar gescheiden zijn. Onze cryo-elektronentomografische datasets van binnenoorstereocilia worden gekenmerkt door een dichte reeks zeshoekig verpakte actinefilamenten die vaak met elkaar verbonden zijn. Deze kenmerken maken geautomatiseerde segmentatie zeer uitdagend, nog verergerd door de hoge ruisomgeving van cryo-elektronentomogrammen en de hoge complexiteit van de dicht opeengepakte functies. Gebruikmakend van voorkennis over de organisatie van de actinebundel, hebben we lagen van een sterk vereenvoudigd bal-en-stok-actinemodel geplaatst om eerst een globale pasvorm voor de dichtheidskaart te verkrijgen, gevolgd door regionale en lokale aanpassingen van het model. We laten zien dat volumetrische modelbouw ons niet alleen in staat stelt om met de hoge complexiteit om te gaan, maar ook nauwkeurige metingen en statistieken over de actinebundel oplevert. Volumetrische modellen dienen ook als verankeringspunten voor lokale segmentatie, zoals in het geval van de actine-actine-kruisconnectoren. Volumetrische modelbouw, vooral wanneer deze verder wordt aangevuld met computergebaseerde geautomatiseerde aanpasbenaderingen, kan een krachtig alternatief zijn wanneer conventionele geautomatiseerde segmentatiebenaderingen niet succesvol zijn.

Inleiding

Cryo-elektronentomografie maakt het mogelijk om hele organellen of delen van cellen en weefsels te visualiseren met nanometerresoluties in hun bijna-oorspronkelijke staat ^1,2,3 met behulp van ofwel dompelbevriezing⁴ of hogedrukbevriezing ultrasnelle vitrificatie⁵. Aangezien slechts een beperkte elektronendosis kan worden verdragen door het cryo-geconserveerde, niet-gekleurde, ingevroren gehydrateerde monster, zijn de tomografische 3D-gegevens erg luidruchtig. Deze ruis kan vaak aanzienlijk worden verminderd door een verscheidenheid aan ruisfilteralgoritmen ^6,7, waaronder niet-lineaire anisotrope diffusie⁸, bilaterale filtering⁹ en recursieve mediaanfiltering¹⁰.

Bovendien leiden de kantelbeperkingen van de microscooptrap, wat resulteert in een ontbrekende wig van informatie, en het feit dat de dikte van het preparaat toeneemt bij hoge kantelhoeken, tot 3D-reconstructies met anisotrope resolutie. Dit betekent dat de dichtheid in de derde dimensie wordt uitgesmeerd als gevolg van een lagere resolutie in de Z-richting. Als gevolg hiervan lijkt de vorm van macromoleculen vervormd (d.w.z. minder goed gedefinieerd en langwerpig in de derde dimensie).

Een van de grootste uitdagingen bij de interpretatie van tomografische gegevens is de geautomatiseerde extractie van de relevante kenmerken, ook wel segmentatie¹¹ genoemd. Met voldoende unieke vormkenmerken en weinig ruis kunnen macromoleculaire machines in complexe 3D-volumes worden geïdentificeerd door middel van een sjabloon die overeenkomt met 12,13,14; Het succes van sjabloonmatching hangt echter af van de tomogramresolutie, een geschikt zoekmodel en de grootte- en vormkenmerken van de functievolumes. Als de kenmerken van belang voldoende uit elkaar liggen en herhalende motieven (zoals grote macromoleculaire machines) gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd, kunnen tomogramsubvolumes worden gecombineerd om de signaal-ruisverhouding te vergroten en individuele deeltjesvormvervormingen uit te middelen. Geautomatiseerde segmentatie van een actinefilamentnetwerk in elektronentomogrammen van de dunne rand van ingevroren-gehydrateerde Dictyostelium discoideum-cellen door middel van sjabloonmatching is gerapporteerd¹⁵.

Als de interessante kenmerken echter dicht bij elkaar liggen, kan de anisotropie van de gegevensresolutie leiden tot een uitsmering van de kaartdichtheden in de Z-richting (in de richting van de elektronenbundel), wat resulteert in een schijnbare samensmelting van de dichtheidsenveloppe van dicht bij elkaar liggende macromoleculaire machines of supramoleculaire complexen. In dergelijke gevallen zijn geautomatiseerde benaderingen voor segmentatie, zoals stroomgebied¹⁶, grenssegmentatie¹⁷ of een verscheidenheid aan op machine learning gebaseerde classificatiebenaderingen^18,19, mogelijk niet in staat om de kenmerken van belang te herkennen of een juiste grens rond een interessant object vast te stellen. Vaak eindigt men met een paar zeer grote stukken of met een zwaar overgesegmenteerd boek, waarbij veel moeite nodig is om veel kleine stukken samen te voegen totdat het interessante kenmerk als voltooid wordt beschouwd. Een dergelijke handmatige curatie van segmentatieresultaten kan zeer arbeidsintensief zijn en kan zelfs helemaal mislukken wanneer de structuur van belang een reeks dicht bij elkaar liggende filamenten is die met elkaar zijn verbonden via korte linkers. In dit gigantische netwerk van filamenteuze structuren kan het moeilijk zijn om je te oriënteren. Dit komt omdat, als gevolg van resolutie-anisotropie, dichtheden in elkaar lijken over te lopen, wat een formidabele uitdaging vormt voor zowel geautomatiseerde als interactieve handmatige segmentatiebenaderingen. Als gevolg hiervan kan men gemakkelijk tussen filamenten "springen" wanneer men alleen kleine gebieden visueel inspecteert.

Gelukkig hebben we in het geval van de actinebundel in de stereocilia van de haarcellen van het binnenoor kennis over de algehele organisatie van de actinebundels en de directionaliteit van de actinefilamenten^20,21. De actinebundel bestaat uit honderden zeshoekige, dicht opeengepakte actinefilamenten met een diameter van 6-8 nm, die ongeveer 12-13 nm van elkaar verwijderd zijn²².

Dit stelde ons in staat om een nogal andere benadering van segmentatie te kiezen die is gebaseerd op vereenvoudigde bal-en-stick-modellen om actinefilamenten weer te geven. De strategie omvatte het gelijktijdig plaatsen van een geïdealiseerde regelmatige reeks filamentmodellen in platen van de cryo-elektronentomografiedichtheidskaarten om laag voor laag een 3D-model van de actinebundel op te bouwen. We zorgden ervoor dat het model over het algemeen paste bij de dichtheidskaart voordat we lokale aanpassingen maakten aan individuele filamentmodellen of groepen filamentmodellen om ze nauw aan te laten sluiten bij de dichtheidskaart. Door automatische kleurcodering van de dichtheidswaarde op de locatie van het filamentmodel konden we gemakkelijk schijnbare hiaten in de actinebundel detecteren. Volumetrische modellen maken een kwantitatieve analyse van volumetrische eigenschappen mogelijk, zoals afstanden tussen actinefilamenten, en leiden ook tot een vereenvoudigde weergave van de algehele 3D-filamenteuze netwerkorganisatie.

Daarnaast kunnen modellen ook dienen als verankeringsstructuren voor de segmentatie van extra kenmerken, zoals actine-actine-linkers, aangezien (delen van) individuele filamentmodellen kunnen worden geselecteerd, waaromheen de juiste straalkaartdichtheidszones kunnen worden gegenereerd voor inspectie en verdere segmentatie.

Wij zijn van mening dat onze op volumetrische modellen gebaseerde segmentatiebenadering bijzonder nuttig is voor netwerken met grote filamenteuze structuren die hiaten en onderlinge filamentverbindingen kunnen bevatten. Segmentatie-algoritmen hebben de neiging om lokaal te werken, terwijl het menselijk brein rekening houdt met grotere gebieden en dus superieur is aan computers als het gaat om het herkennen van filamentstructuren, zelfs in een complexe omgeving met veel ruis.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de Southeast University.

1. Cryo-elektronentomografie gegevensbron voor volumetrische modelbouw

OPMERKING: De stereocilia cryo-elektronentomografische reconstructies die worden gebruikt voor een volumetrische modelbouw zijn eerder gepubliceerd ^22,23 en werden verkregen zoals beschreven door Metlagel et ^al.22.

De UCSF Chimera python-scripts voor stereocilia-modellering worden geleverd in aanvullend bestand 1, aanvullend coderingsbestand 1, aanvullend coderingsbestand 2, aanvullend coderingsbestand 3, aanvullend coderingsbestand 4 en aanvullend coderingsbestand 5.

1. Kort gezegd, dep stereocilia van het apicale oppervlak van het sensorische epitheel van de muisworst op de kanten koolstofsteunfilm van een raster van een elektronenmicroscoop (EM). Voer vervolgens ultrasnelle dompelbevriezingsvitrificatie en enkelassige cryo-elektronentomografische gegevensverzameling uit op een cryogene transmissie-elektronenmicroscopie (cryo-TEM), uitgevoerd op 300 kV met een nominale vervaging van 3,5-4,5 μm, met behulp van een CMOS-type camera in integratiemodus, met een pixelgrootte van 0,47 tot 0,59 nm (zie materiaaltabel).
2. Een typische dosis voor het verzamelen van gegevens met één as is doorgaans 80-100 elektronen/Ų. Reconstrueer de 3D-volumes van het tomogram met behulp van het softwarepakket IMOD²⁴, hetzij door middel van gewogen backprojectie of de SIRT-methode ^25,26.
3. Denoise de tomogrammen met behulp van recursieve mediane of bilaterale filtering in Priism²⁷ of de niet-lineaire anisotrope diffusieoptie in IMOD.
   OPMERKING: Het belangrijkste softwarepakket dat werd gebruikt voor interactieve visualisatie, het bouwen van volumetrische modellen en kwantitatieve analyse was de UCSF Chimera-software^28,29. Alle gebruikte softwarepakketten staan vermeld in de Materiaaltabel.

2. Cryo-elektronentomografie gegevensvoorbereiding voor volumetrische modelbouw

1. Tomogram rotatie
   OPMERKING: Het doel van deze stap is het vinden van de "optimale hoeken" waarin de actinekern is uitgelijnd in twee van de drie assen (x en z), zodat het plaatsen van de modellen in 3D kan worden gedaan met slechts één as om je zorgen over te maken. De volgende stappen worden uitgevoerd binnen het IMOD softwarepakket.
   1. Open 3dmod (IMOD) en open het 3D-afbeeldingsstackbestand in .mrc-bestandsindeling. Zorg ervoor dat de 3D-stapel zich in de 16-bits grijswaardenmodus bevindt en de juiste X-, Y- en Z-afmetingen weergeeft in de koptekst van het afbeeldingsbestand. Breng indien nodig correcties aan met behulp van de opdracht alterheader : alterheader -d (x_pixelspacing),(y_pixelspacing),(z_pixelspacing) inputfilename.mrc in de opdrachtprompt. Als de 3D-stack de TIFF-bestandsindeling heeft, gebruikt u de opdracht tif2mrc inputfilename.tif outputfilename.mrc in de opdrachtprompt om een .mrc-bestand te maken.
   2. Inspecteer het tomogram visueel en open "slicer" (door op backslash "\") te drukken om de beste rotatiehoeken te vinden in de X-, Y- en Z-dimensies voor uitlijning van het actinefilamentvlak met het Z-vlak. Manipuleer de X-rotatie, Y-rotatie, Z-rotatiebalk om de optimale hoek te vinden waaronder de actinefilamenten zijn uitgelijnd op de X- en Z-vlakken. Merk op dat het wijzigen van de gemiddelde dikte voor de weergave van het tomogram (Dik : Img) kan helpen bij het vinden van een ideale hoeveelheid middeling van de dichtheid in het Z-vlak en dus een verhoogd contrast. Zoom in en uit op het tomogram met behulp van respectievelijk de + en - toetsen op het toetsenbord.
   3. Zodra de ideale hoeken voor rotatie zijn geïdentificeerd, roteert u het tomogram door het IMOD-commando rotatevol -a (Z rotatiehoeken),(Y rotatiehoeken),(X rotatiehoeken) -s (x-width),(y-height),(z-depth) inputfilename.mrc outputfilename.mrc in de opdrachtprompt te typen. Zorg ervoor dat de kaart voldoende ruimte geeft voor de rotatie om te voorkomen dat delen van de kaart worden afgesneden bij het draaien.
      OPMERKING: Voor meer informatie over het gebruik van de opdracht rotatevol gebruikt u de optie in het helpmenu of gaat u naar de volgende URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/rotatevol.html). Dit commando (rotatevol) wijzigt de momenteel getoonde kaart in het IMOD-venster niet, maar maakt een nieuw kaartbestand met een dichtheidskaart die wordt geroteerd.
   4. Identificeer met behulp van het slicervenster de X-, Y- en Z-coördinaten van twee tegenover elkaar liggende hoeken van een kaart om het bijsnijdgebied met het stereocilium te identificeren met behulp van de opdracht trimvol .
   5. Gebruik de IMOD-opdracht Trimvol om de kaart bij te snijden op de eerder verkregen coördinaten door trimvol -x (x-coordiante 1),( x-coordiante 2) -y (y-coordiante 1),( y-coordiante 2) -z (z-coordiante 1),( z-coordiante 2) inputfilename.mrc outputfilename.mrc in de opdrachtprompt te typen. Nu is de kaart veel kleiner, en dus gemakkelijker en sneller om vanaf dit punt mee te werken.
      OPMERKING: Voor meer informatie over het gebruik van de opdracht trimvol gebruikt u de optie in het helpmenu of gaat u naar de volgende URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/trimvol.html). Met deze stappen maakt u een mrc-bestand dat is geroteerd en bijgesneden.
2. Tomogram-filtering
   OPMERKING: Deze stap maakt gebruik van een niet-lineair anisotrope diffusiefilter (NAD) van IMOD voor ruisonderdrukking. We hebben als beginwaarde de waarden gebruikt die worden aanbevolen op de IMOD-helppagina voor niet-lineaire anisotrope diffusiefiltering, zoals vermeld in de volgende URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/NADexample.html), en we hebben deze gebruikt als de beginwaarden.
   1. Typ etomo in de opdrachtprompt om de grafische etomo-gebruikersinterface van IMOD te starten.
   2. Selecteer de optie Niet-lineaire anisotrope diffusie in het etomo-menu en selecteer het kaartbestand (Kies een volume).
   3. Om een K-waarde te vinden en het aantal iteraties dat de beste filterresultaten oplevert, zoals beoordeeld door visuele inspectie, past u het NAD-filter toe op een kleiner testvolume om het gespecificeerde NAD-filtertestvolume te extraheren. Klik op de Rubberband Tool bovenaan de 3dmod-interface, klik met de linkermuisknop om het testvolume te selecteren en klik op de knoppen Hi en Lo om aan te geven dat de Z-slice de grens van het testvolume is (Get Test Volume Range from 3dmod). Pak het testvolume uit door op Testvolume extraheren te klikken.
   4. Filter het testvolume met behulp van verschillende K-waarden (Zoek een K-waarde voor testvolume > Lijst met K-waarden), zoals 0,1, 1,5, 10, 15, 25, 30, 50 en 75. Voer NAD-filtering uit met elk van de gespecificeerde K-waarden (uitvoeren met verschillende K-waarden > Testresultaten van verschillende K-waarden bekijken). Gebruik het slicervenster om de prestaties van het NAD-filter te evalueren en selecteer een K-waarde die wordt gebruikt voor het filteren van het hele volume.
   5. Gebruik de K-waarde die is geïdentificeerd in stap 2.2.4 en test verschillende aantallen iteraties, zoals 2, 5, 8, 11, 15 en 21 (Zoek een iteratienummer voor testvolume > Lijst met iteraties). Evalueer de prestaties van het NAD-filter voor verschillende iteraties door te klikken op Verschillende iteratietestresultaten weergeven of door een slicer-tool te gebruiken. Kies een waarde voor een ander aantal iteraties.
   6. Gebruik de geïdentificeerde K-waarde en het aantal iteraties (Volledig volume filteren > K-waarde en iteraties) en filter het hele volume (Volledig volume filteren). Een nieuw gefilterd volume verschijnt in dezelfde map waar het geladen volledige volume zich bevindt met een .nad-bestandsextensie die is gekoppeld aan het .mrc-bestand.
      OPMERKING: Met deze stappen wordt een .mrc-bestand gemaakt dat is gefilterd met een NAD-filter en een lagere ruis vertoont en dus een verbeterde signaal-ruisverhouding.

3. Volumetrische modelbouw

1. Voorbereiding van plaatsing in 3D model
   OPMERKING: Het doel van deze stap is om de kaart voor te bereiden en te analyseren voor het plaatsen van 3D volumetrische modellen in de geroteerde en ruisvrije dichtheidskaart met behulp van het UCSF Chimera-programma.
   1. Verkrijg met behulp van het slicervenster een dwarsdoorsnede (plaat van 30 plakjes/28,4 nm) om de Z-coördinaten van het midden van de dichtheidsplaat te identificeren, waarin het actinefilamentmodel moet worden geplaatst. Klik op het midden van de filamentdichtheid en noteer de Z-coördinaten in het IMOD-hoofdvenster.
   2. Houd de coördinaten in de gaten die zijn geïdentificeerd voor toekomstige modelplaatsing in UCSF Chimera.
      OPMERKING: De Z-coördinaten die uit deze stap zijn genoteerd, worden tijdens stap 4 gebruikt om eenvoudig kant-en-klare actinefilamentmodellen op de juiste Z-hoogtes te vinden en te plaatsen, waardoor de modelplaatsing sneller gaat.
2. Plaatsing van 3D-modellen
   OPMERKING: Het doel van deze stap is om een 3D volumetrisch model in de voorbereide dichtheidskaart te plaatsen met behulp van UCSF Chimera.
   1. Open in UCSF Chimera de gefilterde, geroteerde kaart (bestand > openen)
   2. Controleer of de parameters van de kaart correct zijn ingesteld door Functies > vlakken en Functie> coördinaten te selecteren in de volumeviewer om de interface voor functies en coördinaten te openen. Controleer de voxelgrootte om te zien of de juiste voxelafstand is ingesteld met behulp van de koptekstopdracht in de opdrachtprompt (in IMOD). Als dit niet het geval is, corrigeert u de Voxel-grootte-interface naar de juiste voxel-afstand. Centreer de kaart om de camera in het midden van het weergavevenster in te stellen (Origin Index > Center).
   3. Open het venster Camerabediening (Extra > weergavebediening > camera). Stel vervolgens de cameraweergave in op de orthografische weergave (projectie > orthografisch)
   4. Laad het vooraf gemaakte python-scriptmodel (bestand > Open > ActinFilamentPlane.py) en open zoveel scripts voor actinefilamentvlakken als er actinefilamentvlakken op de kaart zijn.
   5. Verplaats de geladen modellen door de bewegingsmuismodus (Extra > beweging > bewegingsmuismodus) in te schakelen. Schakel de bewegingsmuisoptie in (Beweging muismodus instellen > Selectie verplaatsen). Gebruik Ctrl + Slepen om alle modellen in de sessie te selecteren en klik met de rechtermuisknop (of een andere toets die is opgegeven in Voorkeur > Muis) om de modellen in de gewenste richting te verplaatsen.
      OPMERKING: De modellen zijn gemaakt met ballen en stokken met een bepaalde dikte (straal van ActinFilamentPlane.py script) en met bepaalde afstanden (Lattice_Spacing van ActinFilamentPlane.py script).
   6. Om alleen het model te visualiseren waarin men geïnteresseerd is, opent u het modelpaneel (Extra > algemene bedieningselementen > Modelpaneel). Klik op selectievakjes onder S (Weergeven) om de zichtbaarheid van een bepaald model in of uit te schakelen.
   7. Activeer het opdrachtregelpaneel (Extra > Algemene besturingselementen > Opdrachtregel).
   8. Nadat u elk actinefilamentvlakmodel op de juiste Z-hoogte hebt geplaatst, verwijdert u alle overtollige actinefilamenten in elk actinefilamentvlakmodel door het overtollige deel van de modellen te selecteren en door del sel (Geselecteerde verwijderen) te typen in de opdrachtregel onder aan het hoofdweergavevenster van UCSF Chimera.
   9. Visualiseer slechts één actinefilamentvlak tegelijk door naar het modelpaneelvenster te gaan en alle andere actinefilamentmodellen te selecteren en te verbergen (Ctrl + klik > verbergen).
   10. Als u delen van de kaartdichtheid wilt visualiseren die zich in de onmiddellijke nabijheid van het betreffende model met één actinefilamentvlak bevinden, selecteert u het model (Modelpaneel > selecteert) en opent u het zonebedieningspaneel in Volumeviewer (Volumeviewer > functies > Zone). Stel de zonestraal in op 100 Å en klik vervolgens op Zone om de kaart in een straal van 100 Å (= 10 nm) van het geselecteerde model te plaatsen. Merk op dat de dimensie in Chimera is ingesteld in Angstrøm (1 Å = 0,1 nm).
   11. Pas indien nodig het model aan de dichtheidskaart aan door de bewegingsmuismodus in te schakelen. Selecteer meerdere modellen die zich niet in de juiste positie bevinden om de modellen te verplaatsen zodat ze correct in de gezoneerde dichtheidskaart worden geplaatst.
   12. Om een programmeerfout in ActinFilamentPlane.py op te lossen, voert u het FixingMarkerID.py-script uit, dat de ontbrekende MarkerID van de "atomen" (ballen in het bal-en-stick-model) repareert. Selecteer het volledige model en typ runscript FixingMarkerID.py op de opdrachtregel (het script moet worden opgegeven door de juiste map, zoals C: \ directory \ Script.py).
   13. Als de dichtheidskaart aangeeft dat het actinefilament gebogen is, zorg er dan voor dat het rechte actinefilament in meerdere delen wordt verdeeld om rekening te houden met de kromming door de gewenste modellen te selecteren en runscript dividelinks.py nummer te typen. Extra markeringen (gespecificeerd door het nummer in het commando) worden op gelijke afstand van elkaar in het actinemodel geplaatst, waardoor "verbindingen" ontstaan waar het model kan worden gebogen.
   14. Pas de gewrichten aan om de kromming weer te geven door extra markeringsgewrichten langs de gezoneerde kaart te verplaatsen met behulp van de bewegingsmuismodus. Voeg indien nodig extra markeringen toe aan het model met behulp van het dividelinks.py-script .
   15. Om te controleren of alle actinefilamenten correct binnen de actinedichtheden zijn geplaatst, gebruikt u uitknipbalken door te klikken op Extra > Weergavebediening > camera in het vervolgkeuzemenu UCSF Chimera om het camerabesturingsvenster te openen en selecteer vervolgens Zijaanzicht om de twee uitknipbalken (bijna- en verafknipvlakken) van de camera te zien. Sleep twee gele balken in een smalle spleet door met de linkermuisknop te klikken en sleep het uitknipgedeelte met de middelste muisknop om de modellen beetje bij beetje te inspecteren.
       OPMERKING: Het stereocilium actine kernmodel is nu compleet.
3. Membraan segmentatie
   OPMERKING: Het doel van deze stap is om een oppervlaktemodel van het stereocilia-membraan te maken.
   1. De segmentatie van oppervlakken maakt gebruik van de Volume Tracer-tool (Tools > Volume Data > Volume Tracer).
   2. Klik in het venster Volume Tracer op Muis en vink alleen de opties aan Markeringen op gegevensvlakken plaatsen en Nieuwe markering koppelen aan geselecteerde markering in. Dit maakt het mogelijk om de markeringen nauwkeurig op hetzelfde Z-vlak te plaatsen (wanneer een enkel Z-vlak wordt getoond). Controleer ook de plaatsmarkeringen met de middelste muisknop in het venster Volumetracer .
   3. Maak een nieuwe markeringsset (Bestand > Nieuwe markeringsset). Markeringsset 1 moet worden gemaakt en geselecteerd in het venster Volume Tracer .
   4. Gebruik Volumeviewer om afzonderlijke Z-vlakken weer te geven in het hoofdweergavevenster (As naar Z > One.)
   5. Trek met de middelste muisknop het membraan van het ene uiteinde van het zichtbare membraan naar het andere. Alle markeringen moeten door verbindingen van het ene uiteinde naar het andere worden verbonden.
   6. Deselecteer de laatst geplaatste markering door op Ctrl + Klik op de achtergrond te drukken waar geen enkel selecteerbaar item zich bevindt. Dit zorgt ervoor dat de volgende markering die moet worden geplaatst, verbonden is met schakels in het nieuwe vlak, en niet met een eerder membraanspoor van een ander Z-vlak.
   7. Herhaal de membraantracering voor elke 10 nm in dezelfde richting van het traceren van het ene uiteinde van het zichtbare membraan naar de andere kant.
   8. Zodra veel parallelle banden van membranen zijn gesegmenteerd, gaat u naar het Volume Tracer-venster en klikt u op Functies > oppervlakken. Dit maakt de oppervlakte-interface in het Volume Tracer-venster mogelijk. Klik op Maken naast de interface Oppervlakken om oppervlakken te maken tussen banden van membraansegmentatie. Hierdoor ontstaat een dunne flap van het oppervlaktemodel die de uit elkaar geplaatste membraansporen opvult.
      OPMERKING: Het maken van het stereocilium-membraanoppervlaktemodel is nu voltooid.
4. Crosslinker modellering
   OPMERKING: Het doel van deze stap is om de crosslinkers tussen actinefilamenten te modelleren.
   1. Crosslinkers kunnen ook worden geplaatst met behulp van de Volume Tracer-tool .
   2. Klik in het venster Volumetracer met de linkermuisknop om alleen Markeringen op oppervlakken te plaatsen en Nieuwe markering aan geselecteerde markering te koppelen. Controleer vervolgens Plaatsmarkeringen met de middelste muisknop in het Volume Tracer-venster .
   3. Visualiseer alleen dichtheden rond het model van het enkele actinefilamentvlak dat van belang is met behulp van de zonefunctie. Stel de zonestraal in op 100 Å om de kaart te visualiseren binnen een straal van 100 Å vanaf het geselecteerde model.
   4. Plaats markeringen op zichtbare dichtheden van crosslinkers door op de middelste muisknop te klikken. Zodra twee markeringen zijn geplaatst (en dus een enkele crosslinker is gemodelleerd), moet u ervoor zorgen dat de tweede markering wordt uitgeschakeld om te voorkomen dat er continu links worden verbonden met het volgende crosslinkermodel.
   5. Herhaal de bovenstaande stappen voor elk actinefilamentvlak en herhaal het hele bovenstaande proces naar alle drie de hoofdrichtingen waarin crosslinkers zich kunnen bevinden. Bij het zoneren van actinefilamentvlakken in diagonale richting, selecteert u handmatig actinefilamentmodellen afzonderlijk.
      OPMERKING: Voor elk van de actine-crosslinkermodellen kunnen we de positie op de actinefilamenten registreren waarmee de vermeende crosslinkers zijn verbonden. Deze informatie zou in principe kunnen worden geëxtraheerd voor een vervolganalyse met behulp van subtomogramgemiddelden, wat buiten het bestek van deze studie valt.

4. Kwantitatieve analyse van het 3D-model

1. Analyse van lacunes
   OPMERKING: Het doel van deze stap is het detecteren van hiaten in de actinefilamenten.
   1. Geselecteerde items kunnen worden geanalyseerd. Geef de parameters op, zoals de kleur, met behulp van de tool Inspecteer selectie (Actie > Inspecteren).
   2. De kleur van het geselecteerde item kan worden gespecificeerd door een selecteerbaar item te selecteren in UCSF Chimera en door de kleur te wijzigen naast de sectie Kleur van het venster Selectie inspecteren .
   3. Specificeer de grootte van de markeringen en links door markeringen en links in UCSF Chimera te selecteren en door de waarden naast de straalsectie van het Inspect Selection-venster te wijzigen, waar de eenheden zich in Angstrøm bevinden.
   4. Voer een kloofanalyse uit door automatisch dichtheidsverschillen te detecteren, met behulp van de functie Waarden op Atoomposities (Tools > Volume Data > Values at Atom Positions).
   5. Selecteer de kaart waarin de waarden worden gelezen door de gewenste kaart te selecteren naast de sectie Volumegegevens van het venster Waarden op Atom-posities . Selecteer het model waarin aan alle markeringen een parameter wordt toegewezen door het gewenste model te selecteren naast de sectie Molecuul .
   6. Met de knop Histogram onder aan het venster Waarden op atoomposities wordt een histogram gemaakt in een nieuw venster met de naam Render/Select by Attribute. Ctrl + Klik op het histogram om afkappunten toe te voegen of te verwijderen, waarvoor verschillende kleuren kunnen worden geselecteerd. Schakel Dekken houden uit om een transparante kleur op de scène toe te passen. Markeringen met een dichtheid onder een bepaalde drempel, die hiaten vertegenwoordigt, kunnen niet alleen worden gekleurd, maar kunnen ook worden geselecteerd, en stellen ons dus in staat om de nummermarkeringen in het hiaatgebied te tellen. Om te selecteren, klikt u op Selecteer > kenmerk > value_mapname.
2. Bepalen van interactine-afstanden
   1. Voor het meten van interactine-afstanden plaatst u markeringen op een enkel XZ-vlak (in UCSF Chimera aangeduid als een Y-vlak) door het Volume Tracer-venster te gebruiken, op Muis te klikken en alleen Plaats markeringen op gegevensvlakken aan te vinken en het vinkje weg te halen Nieuwe markering koppelen aan geselecteerde markering. Dit maakt het mogelijk om de markeringen nauwkeurig op hetzelfde Y-vlak te plaatsen (wanneer een enkel Z-vlak wordt getoond). Controleer ook Plaats markeringen met de middelste muisknop in het Volume Tracer-venster en plaats de markeringen op een doel Y-vlak dat van belang is voor het meten van de interactineafstand.
   2. Zodra de actineposities van het enkele Y-vlak met succes zijn gemarkeerd, selecteert u alle markeringen en typt u de opdracht findclash #model-spec test self overlapCutoff -200 hbondAllowance 0 log true Linewidth 10 pbColor black in de opdrachtregel aan de onderkant van het actinefilamentvlak. Hiermee worden alle botsingen tussen markeringen gevonden binnen een afstand van 200 Å (overlapCutoff -200) en worden zwarte lijnen (pbColor zwart) gemaakt met een dikte van 10 Å (lijnbreedte 10) tussen de markeringen.
   3. Aangezien er overlappende markeringen zijn binnen het gegeven bereik van 200 Å, verwijdert u overbodige metingen die geen verbindingen zijn tussen alleen de dichtstbijzijnde, aangrenzende markeringen. Doe dit door gebruik te maken van het RemoveCross.py script dat op de UCSF Chimera-website wordt aangeboden, dat alle overlappende links verwijdert die niet de kortste link zijn met de aangrenzende markeringen.
   4. Om de afstand van de resterende bindingen te meten, selecteert u alle pseudobonds (links die zijn gemaakt door findclash) en gebruikt u het python-script pblengths.py door runscript pblengths.py te typen. Bekijk de gemeten waarden uit het antwoordlogboek (Extra > hulpprogramma's > antwoordlogboek). Kopieer vervolgens de verkregen waarden uit het antwoordlogboek en breng ze over naar een spreadsheet of een ander geschikt hulpmiddel om een histogram te maken.

Resultaten

Met behulp van cryo-elektronentomografie van ongekleurde, ingevroren gehydrateerde individuele stereocilia ingebed in glasachtig ijs, verkregen we dichtheidskaarten van de actinebundel met zijn zeshoekig gerangschikte actinefilamenten, verbonden door cross-connector eiwitten²³. De afmeting van een individuele voxel was 0,947 nm. Visuele inspectie in het IMOD-slicerprogramma van een volumeweergave van het gehele tomogram (400 plakjes/379 nm) wees op de aanwezigheid van filamenteuze structuren die waren uitgelijnd met de lengteas van de stereocilia, zoals te zien is in longitudinale aanzichten (XY-vlak; Figuur 1A-C, bovenpanelen) en in dwarsdoorsneden (XZ-vlak; Figuur 1A-C, bodempanelen). We merkten op dat het projectiebeeld door het filamentnetwerk van 400 slices/379 nm het duidelijkst werd wanneer het oorspronkelijke gereconstrueerde volume met -6° rond de X-as, -13,5° rond de Y-as en 5° rond de Z-as werd gedraaid. Onder deze hoek zijn alle filamenten op elkaar uitgelijnd, waardoor het contrast maximaal is, zoals kan worden opgemaakt uit de dwarsdoorsnede (Figuur 1B). Omdat plakjes met een enkele dwarsdoorsnede niet genoeg signaal hebben om actinefilamenten ondubbelzinnig te onderscheiden, hebben we ervoor gekozen om een plaat van 30 plakjes/28,4 nm op volume weer te geven, die duidelijk een zeshoekig patroon laat zien in de dwarsdoorsnede. De blauwe lijnen in figuur 1C (bovenste panelen) geven de positie aan van het midden van de corresponderende 30 plakjes/28,4 nm dwarsdoorsnedeplaten in de onderste panelen.

Kleine afwijkingen van deze optimale kijkhoek, met slechts ±2°, verminderden de waargenomen orde van het actinefilamentnetwerk aanzienlijk (Figuur 1A,C), wat een indicatie is hoe gemakkelijk het is om te verdwalen in het 3D-volume van het tomogram.

Om de uitdaging van het gebruik van geautomatiseerde segmentatiebenaderingen, zoals stroomgebiedsegmentatie, te illustreren, hebben we een klein subvolume (afgebeeld als goud) gekozen voor stroomgebiedsegmentatie, zoals geïmplementeerd in het UCSF Chimera-softwarepakket (Tools > Volume Data > Segger > Segment). De positie van het subvolume ten opzichte van de gehele stereocilia-kaart wordt aangegeven door de kleine inzet in Figuur 1B.

Figuur 1D-F toont het gekozen subvolume in verschillende richtingen, waarbij Figuur 1D,E de lengterichting aangeeft en Figuur 1F een dwarsdoorsnede kijkrichting. De pijlen aan de linkerkant van figuur 1D-F geven de richting van de actinefilamenten aan.

Figuur 1D-F (rechterpanelen) toont de resultaten van de segmentatie van stroomgebieden. Het subvolume wordt gekleurd op basis van objectidentiteit, waarbij kleuren willekeurig worden toegewezen aan de verschillende objecten. Verschillende kleuren geven een andere objectidentiteit aan, vandaar dat uit figuur 1D-F duidelijk wordt dat de kaartdichtheden voor filamenten beide gefragmenteerd waren langs de filamentas, terwijl dezelfde kleur en dus objectidentiteit werden gegeven aan kaartdichtheden die naburige filamenten met elkaar verbonden. Met andere woorden, het algoritme voor stroomgebiedsegmentatie was niet in staat om de dichtheidskaart van actinefilamenten gedurende een langere periode te volgen, en leidde in plaats daarvan tot het verbinden van dichtheden van naburige filamenten. Hoewel het mogelijk is om de selectie handmatig te beheren (bijvoorbeeld door objecten te verwijderen of samen te voegen), is deze aanpak nogal arbeidsintensief en dus tijdrovend.

Hoewel het niet absoluut noodzakelijk is om onze volumetrische modelbouwstrategie te laten werken, hielp het wel om de 3D-kaart te heroriënteren (roteren) zodat de actinefilamentnetwerkas uitgelijnd was met de Y-as en de actinefilamentmodelvlakken uitgelijnd waren met het X-Y-vlak van het tomogram. We noemen deze oriëntatie de standaardoriëntatie voor stereocilia-tomografische weergave.

We besloten daarom een andere strategie voor beeldsegmentatie te onderzoeken, waarbij we gebruik maakten van het feit dat de actinefilamenten een algemene regelmatige organisatie vertoonden (zeshoekige verpakking), met regelmatige afstand en gedefinieerde algemene bundeloriëntatie. Onze strategie was om een algemene pasvorm van modellen van een actinebundel te vinden, als een reeks filamenten, gevolgd door regionale en vervolgens lokale aanpassingen van de modelpositie om in de experimentele dichtheidskaart te passen. Door een algemeen model als eerste te plaatsen, kunnen we onduidelijkheden in de lokale kaart overwinnen en regionale trends detecteren van afwijkingen van het model ten opzichte van de oorspronkelijke organisatie, zoals filamentbuiging.

Om het model te plaatsen, toonden we platen met de dichtheid (10 plakjes/9,47 nm) in de standaardoriëntatie die overeenkwam met een dikte van een enkele laag van de actinefilamenten, waarop een laag van regelmatig verdeelde, rechte actinefilamentmodellen was aangebracht. Dit is natuurlijk een oversimplificatie van actinefilamenten, die elk bestaan uit een lineaire reeks actinemonomeren met spiraalvormige symmetrie. Figuur 2A-C toont drie representatieve lagen op verschillende Z-hoogten, waarbij de roodgekleurde staafjes de actinefilamenten vertegenwoordigen. De bovenste panelen, met ~30 plakjes/28,4 nm dikke doorsneden, laten zien op welke Z-hoogte een individuele actine-modellaag van 19 staven werd geplaatst, terwijl de onderste panelen een longitudinale oriëntatie vertonen (zij het in perspectief). Figuur 2D toont het volledige vereenvoudigde model, zowel in de dwarsdoorsnede (bovenpaneel) als in de lengteperspectieven (onderpaneel). De oriëntatie van de dwarsdoorsnede stelde ons in staat om de filamenten met goed vertrouwen te positioneren. Hier bleek onze oorspronkelijke zet om het hele volume te heroriënteren om samen te vallen met de hoofdassen van de tomogrammen nuttig te zijn, omdat het betekende dat de oriëntatie van ons model in onze standaard kijkrichting ook evenwijdig was aan de hoofdassen. Strikt genomen zou onze aanpak echter ook hebben gewerkt zonder de heroriëntatie van het tomogram, alleen de plaatsing van het model ten opzichte van de dichtheid zou een grotere uitdaging zijn geweest.

Bij zorgvuldige inspectie van individuele platen van de dichtheidskaart merkten we op dat een perfect recht actinemodel niet paste in de waargenomen dichtheidskaart die van het proximale uiteinde naar het distale uiteinde (d.w.z. naar de punt) van de stereocilia ging (Figuur 3A-C). In de buurt van het uiteinde van de stereocilia werd de kaartdichtheid voor filamenten verplaatst met meer dan 13 nm (actine-actine-afstand), die we konden compenseren door het model aan te passen terwijl we van het proximale naar het distale deel van de stereocilia-dichtheidskaart gingen, waardoor een kleine maar herkenbare geleidelijke kromming in ons actinemodel werd geïntroduceerd. Figuur 3D toont een enkele plaat van de kaartdichtheid van het actinefilament, met een volumetrisch model dat op de dichtheidskaart is aangebracht. Een vergelijking tussen het rechte (rood) en het gebogen (geel) model wordt weergegeven in figuur 3E. Deze kromming wordt het best begrepen door een plaat van de dichtheidskaart met het geplaatste model 80° rond de X-as te kantelen, waardoor men een perspectief heeft in de richting van de actinefilamenten (Figuur 3D,E).

De afwijking van de twee modellen, waarbij de positie van het actinemodel bij de punt ongeveer even ver is verschoven als de afstand tussen de actinefilamenten, had veel verwarring kunnen veroorzaken als we niet te werk waren gegaan zoals we hebben gedaan. Deze "globale" positionering van een laag van het actinefilamentmodel, gevolgd door "regionale" aanpassing, stelde ons in staat om deze kromming te detecteren, die nauwelijks waarneembaar is in de longitudinale of dwarsdoorsnede. Als de twee modellen echter over elkaar heen worden gelegd, zoals weergegeven in figuur 3E, wordt het subtiele verschil zichtbaar.

Door deze aanpak voor meerdere lagen te herhalen, kan een volledig 3D-model worden verkregen (Figuur 3F), alleen beperkt door de gegevensonzekerheid helemaal bovenaan en onderaan de stereocilia, bekeken in de dwarsdoorsnede (Figuur 3G). Dit gebrek aan dichtheid wordt veroorzaakt door de ontbrekende wig in de (enkelassige) tomografische gegevensverzameling en de bijbehorende anisotropie van de gegevensresolutie, en het effect ervan wordt aangegeven door het ontbreken van een goed gedefinieerde kaartdichtheid voor stereocilia-membranen.

Toen we eenmaal een 3D-model hadden, hebben we elke locatie van het volumetrische model een kleurcode gegeven op basis van de dichtheidswaarde van de kaart op die positie. Regio's van het model met een onderliggende zwakke kaartdichtheid waren rood gekleurd, terwijl regio's van het model met een sterk kaartdichtheidssignaal geel waren gekleurd (Figuur 4A). We interpreteren dergelijke roodgekleurde gebieden, die zich kunnen uitstrekken tot tientallen nanometers, als hiaten in de actinefilamentstructuren die vanwege hun omvang niet kunnen worden toegeschreven aan dichtheidsvariaties die vaak worden aangetroffen in de omgeving met veel ruis van een cryo-EM-kaart. Ruis heeft de neiging om individuele voxels of kleine groepen voxels te beïnvloeden, maar het is onwaarschijnlijk dat het de bron is voor volumes die bestaan uit honderden voxels, waarvoor filamentdichtheid ontbreekt. In plaats daarvan zijn dergelijke hiaten waarschijnlijk een reëel kenmerk van het actinenetwerk van stereocilia en kunnen ze plaatsen van actine-omzet vormen. Figuur 4A heeft twee verschillende dichtheidswaarden op de kaart, weergegeven in lichtblauw en donkerblauw. Er moet expliciet worden opgemerkt dat onze volumetrische modelbouwbenadering, gecombineerd met een geautomatiseerde kleurcodering van ons model in regio's met een zwakke dichtheid, een snelle en gemakkelijke manier is om de verdeling van dergelijke hiaten in het actinefilamentmodel te detecteren en te visualiseren, wat anders erg moeilijk zou zijn geweest.

Zoals te zien is in Figuur 4B, kunnen delen van het volumetrische model op locaties met een relatief zwakke dichtheid gemakkelijk worden verborgen op basis van de resultaten verkregen in Figuur 4A. Dit resulteert dan in een meer gefragmenteerd model dat het actinemodel realistischer kan weergeven in stereocilia. Het alternatief van het bouwen van kleine stukken actinefilamenten zou zeer arbeidsintensief zijn geweest en mogelijk helemaal zijn mislukt vanwege de problemen die zijn besproken bij het beschrijven van figuur 1.

Bovendien stelt het volumetrische model ons in staat om de kruisconnectoren eenvoudig te modelleren door simpelweg een verbinding (weergegeven in rood) te plaatsen tussen de modelpuntposities van het actinefilamentmodel aan weerszijden van de kruisverbinding (Figuur 4C). In onze vereenvoudigde benadering hoeven we geen enkele aanname te doen over de exacte identiteit van elk kruisverbindend eiwit, wat een hogere resolutie en/of geavanceerde labelbenaderingen zou vereisen. In plaats daarvan hoeven we alleen maar te bepalen of er een dichtheid bestaat die aangrenzende actinefilamenten overbrugt; Als dat het geval is, kunnen we een korte verbinding plaatsen van het ene filament naar de aangrenzende tegenhanger. In Figuur 4D is een model van vijf actinefilamenten met hun dwarsconnectoren weergegeven, dat een indruk geeft van de verdeling van de dwarsconnectoren langs de as van het actinefilament.

Een ander voordeel van het bouwen van een volumetrisch model van de actinebundel is dat men snel de afstand tussen aangrenzende actinefilamenten kan bepalen (Figuur 4E-H). Figuur 4E,F toont een dwarsdoorsnede van de dichtheidskaart zonder en met een model dat is aangepast aan het zeshoekige rooster van de kaartdichtheid. Figuur 4G toont het model met verbindingen tussen de dichtstbijzijnde naburige ballen. UCSF Chimera maakt automatische berekening van de afstand van de dichtstbijzijnde buurcentra mogelijk, waarvan het resultaat vervolgens kan worden uitgezet als een afstandsverdeling (Figuur 4H). Modelbouw voor twee aanvullende datasets wordt getoond in Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2.

Figuur 1: De uitdagingen die zich voordoen bij de segmentatie van stroomgebieden van tomogrammen van haarcelstereocilia. (A-C) Longitudinale projecties (400 plakjes/379 nm) door de tomografische 3D-kaart in het XY-vlak (bovenste panelen) en dwarsdoorsnedes (30 plakjes/28,4 nm) in het XZ-vlak (onderste panelen). (A) Tomografische afbeelding geroteerd -2° langs de Y-as vanuit de optimale oriëntatie. (B) Tomografische afbeelding in de optimale oriëntatie, bepaald door aanpassing van de rotatiehoeken van de X-, Y- en Z-assen (X = -6°, Y = -13,5° en Z = 5°) en het onthullen van een hoge mate van orde in de dichtheidskaart, wat wijst op een sterk geordend actinefilamentnetwerk. (C) tomografische kaart geroteerd +2° langs de Y-as vanuit de optimale oriëntatie; de rotatie van slechts 2° rond de Y-as weg van de optimale kijkrichting brengt de waargenomen regelmaat van de dichtheidskaart ernstig in gevaar. De bodempanelen onthullen de regelmaat van de actinefilamentarray wanneer ze in de dwarsdoorsnede worden bekeken. De blauwe lijn in A-C geeft de positie van de dwarsdoorsnedeplaat aan. (D-F) Een kubus van 50 nm x 50 nm x 50 nm bekeken vanuit drie verschillende richtingen voor (linkerpanelen) en na (rechterpanelen) stroomgebiedsegmentatie. Merk op dat stroomgebiedsegmentatie er niet in slaagt de dichtheid van continue actinefilamenten te detecteren, terwijl aangrenzende actinefilamenten en hun kruisverbinding dezelfde objectidentiteit delen, wat suggereert dat stroomgebiedsegmentatie geen geschikte benadering is voor tomogramsegmentatie. In panelen D-F wordt de dichtheidskaart in Chimera weergegeven als kaartstijl "Surface". (A-C) Schaal staven = 100 nm. (D-F) Schaal staven = 50 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Opbouw van een volumetrisch bal-en-stok actinefilamentmodel. (A-C) Boven: dwarsdoorsnede van 30 plakjes/28,4 nm weergaven van de dichtheidskaart met een enkellaags vereenvoudigd actinefilamentmodel geplaatst op een andere Z-hoogte. Onderkant: een enkele plak van 10 plakjes/9,47 nm plaat van de dichtheidskaart met een enkellaags vereenvoudigd actinefilamentmodel. (D) Volledig model van rechttoe rechtaan actinefilament in een dwarsdoorsnede van 30 plakjes/28,4 nm (boven) en perspectiefaanzicht (onder); Schaal staven = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Modelaanpassing om te corrigeren voor de gedetecteerde buiging van de dichtheid van actinefilament. (A-C) Zorgvuldige visuele inspectie van het model, hetzij in dwarsdoorsnede (bovenste panelen) of in longitudinale weergave (onderste panelen), onthulde een goede aansluiting van het model op de dichtheidskaart aan het proximale uiteinde van de stereocilia. Naarmate men echter naar het distale uiteinde van de stereocilia gaat, wordt de pasvorm steeds slechter voor alle actinefilamentmodellen. Dit kan worden gecorrigeerd door de ballen van het bal-en-stick-model in de juiste dichtheidskaartpositie te zetten, wat resulteert in een licht gebogen actinefilamentmodel. Het rechte model wordt weergegeven in rood en het gecorrigeerde gebogen model wordt weergegeven in geel. (D) Enkele plaat van de dichtheidskaart met het gebogen model erop gemonteerd, waardoor de kromming van de actinedichtheid naar het uiteinde van de stereocilia wordt onthuld. Het actinemodel is 80° rond de X-as gedraaid om deze subtiele maar significante buiging van de actinefilamenten beter te laten zien. (E) Vergelijking tussen het rechte, niet-gecorrigeerde actinemodel in rood en het gebogen, gecorrigeerde actinemodel in geel. Voor de duidelijkheid wordt slechts één laag van het actinefilamentmodel weergegeven. (F-G) Actinebundelmodel met gebogen, gecorrigeerde actinefilamenten weergegeven in longitudinale (F) en dwarsdoorsnede (G) oriëntatie. Het gesegmenteerde membraan is in blauw weergegeven. In paneel D wordt de dichtheidskaart in Chimera weergegeven als kaartstijl "Mesh". Schaal staven = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Detectie van hiaten in de actinebundel met behulp van volumetrische modelbouw. Kwantificering van volumetrische eigenschappen met behulp van bal-en-stokmodellen. (A-C) Een klein gebied van een ~10 plak/9,47 nm dikke longitudinale plaat van de stereocilia-dichtheidskaart wordt in blauw weergegeven, samen met het gebogen, gecorrigeerde actinefilamentmodel. (A) De dichtheidskaart wordt weergegeven bij een lagere dichtheidsdrempel (lichtblauw) en een hogere dichtheidsdrempel (donkerblauw). Er zijn gebieden van het actinefilamentmodel waarvoor er geen overeenkomstige dichtheid is. Op dergelijke locaties heeft het model een rode kleurcode gekregen om een gebrek aan dichtheid weer te geven. We interpreteren deze locaties als hiaten in de actinefilamenten. (B) Model van de actinefilamenten dat gefragmenteerd lijkt, wat het gebrek aan dichtheid van actinefilamenten op dergelijke gap-locaties weerspiegelt. (C) Model van de actinefilamenten met dwarsverbindingen (weergegeven in rood) toegevoegd op plaatsen waar een sterke dichtheid werd gevonden om aangrenzende actinefilamenten te overbruggen. (D) Drie geselecteerde modellen actinefilamenten worden getoond met kruisconnectoren naar aangrenzende actinefilamenten (die voor de duidelijkheid niet worden getoond). Merk op dat veel, maar niet alle, mogelijke posities van interactinefilamenten worden ingenomen door connectoreiwitten; (E) Een dwarsdoorsnede van 30 plakjes/28,4 nm plaat van de stereociliadichtheid. (F) Model van actinefilamenten gemonteerd op de dwarsdoorsnede van 30 plakjes/28,4 nm stereocilia dichtheidsplaat. (G) Model van actinefilamenten zonder de onderliggende kaartdichtheid. Automatische detectie van de afstanden van de dichtstbijzijnde actinefilamenten, zoals aangegeven door dunne verbindingen tussen actinefilamentmodelballen. (H) Histogram van de modelafstanden van actinefilamenten. In de panelen A-C wordt de dichtheidskaart in Chimera weergegeven als kaartstijl "Mesh". (A-C) Schaal staven = 50 nm. (D) Schaalbalk = 25 nm. (E-G) Schaal staven = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Modelbouw voor de eerste van twee extra stereocilia-datasets. (A-C) Een klein gebied van een ~10 plak/9,47 nm dikke longitudinale plaat van de stereocilia-dichtheidskaart wordt in blauw weergegeven met behulp van de mesh-modusweergave. Het oorspronkelijk geplaatste model wordt in het rood weergegeven en het gecorrigeerde model in het geel. (A) Alleen kaartdichtheid. (B) Initieel model geplaatst in de dichtheidskaart. (C) Gecorrigeerd model geplaatst in de dichtheidskaart. (D-E) Groter stereociliagebied zonder (D) en met (E) het gecorrigeerde model gemonteerd op een ~10 plak/9,47 nm dikke longitudinale plaat van de stereociliadichtheidskaart. (F-G) Het volledige gebied van het tomogram van de stereocilia wordt getoond. (F) Alleen kaart. (G) Kaart met het gecorrigeerde model. (H) Superpositie van het oorspronkelijke en gecorrigeerde model. Schaal balken = 100 nm Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Modelbouw voor de tweede van twee extra stereocilia-datasets. (A-C) Een klein gebied van een ~10 plak/9,47 nm dikke longitudinale plaat van de stereocilia-dichtheidskaart wordt in blauw weergegeven met behulp van de mesh-modusweergave. Het oorspronkelijk geplaatste model wordt in het rood weergegeven en het gecorrigeerde model in het geel; (A) Alleen kaartdichtheid. (B) Initieel model geplaatst in de dichtheidskaart. (C) Gecorrigeerd model geplaatst in de dichtheidskaart. (D-E) Groter stereociliagebied zonder (D) en met (E) het gecorrigeerde model gemonteerd op een ~10 plak/9,47 nm dikke longitudinale plaat van de stereociliadichtheidskaart. (F-G) Het volledige gebied van het tomogram van de stereocilia wordt getoond. (F) Alleen kaart. (G) Kaart met het gecorrigeerde model. (H) Superpositie van het oorspronkelijke en gecorrigeerde model. Schaal staven = 100 nm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: UCSF Chimera python scripts voor stereocilia modellering. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: pblengths.py. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 2: RemoveCross.py. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 3: ActinFilamentPlane.py. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 4: dividelinks.py. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 5: FixingMarkerID.py. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

We hebben aangetoond dat geautomatiseerde benaderingen voor segmentatie, zoals segmentatie van stroomgebieden, kunnen falen in de omgeving met veel ruis en hoge complexiteit van cryo-elektronentomogrammen van haarcelstereocilia. Het lijkt op zijn best een uitdaging om te onderscheiden welk deel van dit filamenteuze netwerk actinefilamenten vertegenwoordigt en wat crosslinks op lokaal omgevingsniveau zijn, wanneer alleen kleine tomografische subvolumes worden geïnspecteerd. De modelbouwbenadering die in deze studie wordt gebruikt, profiteert van voorkennis van de grootschalige orde van de actinebundel, wat helpt bij het ontwikkelen van een verwachting over de oriëntatie van actinefilamenten en de crosslinkerdichtheden. Misschien nog belangrijker is dat een menselijk brein gemakkelijk patronen kan vinden door rekening te houden met de grotere context dan de lokale dichtheidsverdeling, terwijl een computeralgoritme alleen werkt voor een relatief klein gebied dat door het algoritme wordt beschouwd; Daarom kan niet gemakkelijk rekening worden gehouden met trends op grotere schaal. Door een model globaal aan te passen aan een dichtheidslaag, hebben we de verwarring vermeden die kan optreden bij het maken van een model voor kleine hoeveelheden enkelvoudige actinefilamenten tegelijk. Natuurlijk gaat zo'n globale aanpassing uit van een orde die zich over grote afstanden uitstrekt. Omdat we echter een onverwachte kleine maar significante geleidelijke buiging van de actinefilamenten hadden, was de globale pasvorm slechts een eerste benadering en vereiste lokale aanpassingen van het model om in de dichtheidskaart te passen. Omdat het oorspronkelijke model een goed uitgangspunt was, konden de aanpassingen met veel vertrouwen worden gemaakt. Een groot voordeel van onze aanpak was dat we ervoor konden kiezen om alleen een gedefinieerde dichtheidszone weer te geven, wat hielp om de complexiteit van het landschap te verminderen. Bovendien hielp het bekijken van de kaartdichtheidsplaat langs de as van het filamentmodel om de onverwachte kromming te identificeren, die we hoogstwaarschijnlijk zouden hebben gemist bij het simpelweg weergeven van kleinere subvolumes. De plaatsing van het oorspronkelijke model maakte het ook mogelijk om snel in en uit te zoomen, om af te wisselen tussen een totaalbeeld van de respectieve laag actinefilamenten en de gedetailleerde weergaven om modelaanpassingen te maken.

De kritieke stappen binnen het protocol omvatten de rotatie van de kaart na visuele inspectie, het maken en plaatsen van het model in de dichtheidskaart, evenals de verdeling van het filamentmodel in kleinere segmenten. De atoompositie van de segmenten kon vervolgens ruimtelijk worden aangepast om in de dichtheidskaart te passen en/of een kleurcode krijgen om hiaten te detecteren.

Deze benadering van het bouwen van actinemodellen kan ook worden gewijzigd door een reeks "atomen" (d.w.z. de ballen van het bal-en-stokmodel) in filamentdichtheden te plaatsen door gebruik te maken van een dwarsdoorsnede van een 10-30 plak / 9.47-28.4 nm gemiddelde plaat van dichtheid, die vervolgens kan worden verbonden door bindingen (d.w.z. de stokken van het bal-en-stokmodel). We hebben deze aanpak, die een wijziging is van het protocol dat hier in detail wordt beschreven, gebruikt voor de volumetrische modelbouw in het taps toelopende gebied van haarcelstereocilia²³. Bovendien, zoals we hier hebben beschreven, is onze volumetrische modelbouwbenadering ook zeer geschikt voor de segmentatie en modelbouw van membranen.

Hoewel volumetrische modelbouw kan worden toegepast op elke dichtheidskaart die filamenteuze kenmerken vertoont, is de techniek die we hier hebben beschreven het meest efficiënt wanneer we een reeks filamenten op regelmatige afstand van elkaar hebben, waarvoor een globale pasvorm van een volumetrisch model kan worden verkregen. Het hangt ook af van de filamenteuze kenmerken om hun directionaliteit op een geleidelijke manier te veranderen. Als er plotselinge knikken en scherpe bochten in de filamenteuze structuren zijn, is onze aanpak mogelijk niet bijzonder nuttig voor segmentatie.

In de tussentijd hebben onze medewerkers een geautomatiseerde aanpak ontwikkeld voor geautomatiseerde filamenttracering die een soortgelijk concept volgt dat hier wordt gebruikt voor handmatige segmentatie^30,31. In de toekomst is de beste aanpak misschien wel een hybride van handmatige identificatie en plaatsing van een eerste schaars model (zelfs slechts een paar ballen) in de dichtheid als uitgangspunt, en vervolgens een zoek- en aanpasalgoritme het traceren van de filamenten laten voltooien.

Vereenvoudigde volumetrische modellen verminderen de complexiteit van een systeem en zorgen ervoor dat bepaalde patronen, zoals het buigen van actinefilament in de buurt van de punt, beter worden gewaardeerd. Het volumetrische model kan ook worden gebruikt als een "anker" om een dichtheidszone rond het gekozen verankeringskogel-en-stokmodel weer te geven, waardoor crosslinkerdichtheden tussen aangrenzende actinefilamenten kunnen worden gedetecteerd en gevisualiseerd. De mogelijkheid om individuele filamenten te selecteren en de juiste stralen in te stellen als een zone waarin de dichtheid opnieuw wordt weergegeven, maakt het mogelijk om de overweldigende complexiteit van het landschap terug te brengen tot een beheersbaar niveau.

Een voordeel van deze volumetrische modelbouwbenadering van globale aanpassing, gevolgd door lokale aanpassingen, was dat we in staat waren om regio's te identificeren waar actinefilamenten onderbroken leken te zijn, en significante hiaten in actinefilamenten werden aangegeven door de afwezigheid van kaartdichtheid. Omdat we een volumetrisch bal-en-stokmodel hadden geplaatst, konden we gebruik maken van een routine in het UCSF Chimera-softwarepakket dat elke modelbalpositie een kleurcode geeft op basis van de dichtheidswaarde van de kaart op die locatie. Deze aanpak maakte een snelle detectie en visualisatie van actinefilamentopeningen in de actinebundel mogelijk, wat een biologisch belangrijk kenmerk is dat we vonden in ons cryo-elektronentomogram, en dat zeer moeilijk te detecteren en te visualiseren zou zijn geweest met traditionele segmentatiebenaderingen. Nog een ander voordeel van ons volumetrische model is dat volumetrische eigenschappen, waaronder lengtes en afstanden, gemakkelijk kunnen worden verkregen, waardoor werkelijke getallen en dus een statistische analyse kunnen worden uitgevoerd.

Samenvattend is interactieve handmatige plaatsing van modelpunten, mogelijk verder aangevuld met daaropvolgende geautomatiseerde lokale aanpassing en filamenttraceringsmogelijkheden, een veelbelovende benadering voor de visualisatie en kwantitatieve analyse van elektronentomografische subcellulaire volumes. Dit komt omdat het de kracht van het menselijk brein gebruikt voor patroonherkenning en de kracht van de informatica voor modeloptimalisatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chimera	RBVI		Versie 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html
Chimera	RBVI		Versie 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=win64/chimera-1.16-win64.exe
Chimera	RBVI		Versie 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=mac64/chimera-1.16-mac64.dmg
Chimera	RBVI		Versie 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=linux_x86_64/chimera-1.16-linux_x86_64.bin
Excel	Microsoft		Versie 2211 https://www.office.com/?auth=1
Falcon II	Thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/accessories-em/falcon-detector.html
IMOD	University of Colorado		Versie 4.11.1 https://bio3d.colorado.edu/imod/download.html
PC Desktop	Intel		Windows 10, versie 22H2
PC Laptop	Gigabyte		Windows 10, versie 22H2
Powerpoint	Microsoft		Versie 2211 https://www.office.com/?auth=1
Titan Krios Electron Microscope	Thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html
Word	Microsoft		Versie 2211 https://www.office.com/?auth=1